Projets et candidats lauréats

La protéine core (Cp) de la capside virale est au cœur du cycle de vie du VHB. Son domaine d’assemblage organise et façonne la structure de la capside formée par les dimères de la protéine, tandis que son domaine C-terminal fonctionnel (CTD, résidus 150-183) joue un rôle central dans de nombreuses interactions de la protéine, que ce soit avec des acides nucléiques ou des protéines cellulaires. Le CTD est très basique et largement non structuré. La plupart des études au niveau moléculaire ont été réalisées avec la version tronquée, Cp149. Cependant, même lorsqu’elle était présente, la CTD restait largement invisible dans les études structurelles. Récemment, en utilisant la RMN à détection de protons (1H) et en concevant des conditions expérimentales adaptées, nous avons été en mesure d’observer les signaux RMN de la CTD pour la première fois. Grâce à cette nouvelle opportunité, nous voulons étudier sa conformation et sa dynamique ainsi que ses interactions avec les unités partenaires virales et cellulaires. Plus précisément, nous voulons étudier les trois points suivants. Premièrement, nous voulons déterminer les résidus impliqués dans les interactions entre la CTD et l’acide nucléique. Nous examinerons les interactions entre les résidus de la CTD et l’ARN, ainsi que celles que la Cp dimérique réalise avec l’ADN. Ensuite, dans une variété de formes de capside, nous mesurerons la dynamique de la CTD et étudierons la localisation/extrusion de la CTD en utilisant les augmentations de relaxation paramagnétique mesurées par RMN. Enfin, nous étudierons l’interaction de la CTD avec les importines pour déterminer la séquence NLS d’interaction, également en fonction de la phosphorylation de la CTD, et nous construirons un modèle structurel du complexe.

Le zinc est un oligo-élément essentiel utilisé comme cofacteur par de nombreuses enzymes qui peuvent se structurer en des motifs particuliers appelés doigts de zinc. Le zinc naturel se présente sous la forme d’un mélange de 5 isotopes stables avec des abondances relatives variables. Le fractionnement isotopique du zinc correspond à une modification des rapports de ces abondances. Ce phénomène a déjà été observé dans plusieurs conditions physiologiques et pathologiques tels que certains cancer ou les maladies neurodégénératives. Le HIV-1 code pour une protéine de nucléocapside (NCp7) de 7 kDa comprenant deux motifs à doigts de zinc avec une très haute affinité. Les atomes de zinc étant nécessaires à l’activité de NCp7 et au bon déroulement du cycle viral, ils ont été la cible de nombreuses stratégies antivirales. Cependant, aucune étude à ce jour ne s’est intéressée au fractionnement isotopique au cours de l’infection virale.

Dans cette étude, nous souhaitons atteindre 3 objectifs :

(1) Mesurer le fractionnement isotopique du zinc dans les particules virales

(2) Déterminer l’influence d’une dérégulation de la composition isotopique naturelle du zinc sur la production du virus HIV-1 et son caractère infectieux

(3) Déterminer et comparer les caractéristiques biochimiques de protéine NCp7 synthétique contenant différents isotopes du zinc.

Nos résultats préliminaires nous ont déjà permis de montrer un fractionnement isotopique du zinc dans les particules virales HIV-1 purifiées comparées au milieu intra et extracellulaire. Nous souhaitons donc dans un premier temps valider ces résultats dans différents modèles cellulaires (0-6mois). Ensuite les objectifs 2 et 3 pourront être menés de front et de manière indépendante. Nous comptons produire du virus dans des conditions où nous aurons modifié l’abondance naturelle des isotopes du zinc en ajoutant au milieu de culture un isotope enrichi disponible commercialement (6-24mois). En parallèle, la protéine NCp7 sera produite par la plateforme SFR Biosciences (0-6mois), puis des tests in vitro seront réalisés afin d’étudier ses propriétés biochimiques en présence de différents isotopes du Zinc (6-24 mois).

Ce projet est original et innovant et il pourrait mener à considérer les isotopes du Zinc comme biomarqueurs de l’infection par le HIV-1 et même ouvrir de nouvelles voies thérapeutiques. Enfin, nous pourrions étendre ces études à d’autres modèles viraux ainsi qu’à d’autres cellules immunitaires (macrophages, cellules primaires, etc.).

Une des dernières étapes du processus d’entrée du virus de l’hépatite B (VHB) dans la cellule implique la fusion de sa membrane avec celle de la cellule afin de libérer son génome. Ce processus semble être indépendant de l’acidification des endosomes dans lesquels le virus est internalisé suite à son attachement à ses récepteurs de surface cellulaire. Le VHB comporte trois protéines de surface (L, M et S) qui ont en commun leurs derniers 226 acides aminés ainsi que quatre régions transmembranaires (TM) permettant leur insertion dans l’enveloppe du virus. Il a été proposé qu’une séquence de 23 acide-aminés juxtaposée à la première région TM (TM1), serait responsable de cette fusion. Cependant, il n’y a que très peu d’évidences expérimentales directes, utilisant notamment des tests d’infection, sur la participation de ce segment dans le processus de fusion. Par ailleurs, des résultats récents de notre équipe montre la présence d’un peptide de fusion potentiel dans la région PreS1 identifié par analyse de coévolution et confirmé depuis de manière fonctionnelle. Un autre déterminant impliqué dans l’entrée du VHB est la région AGL (antigenic loop), située dans l’ectodomaine de S, et notamment ses nombreux résidus cystéines qui, expérimentalement, semblent impliqués dans des modifications conformationnelles de S nécessaires pour entrainer le processus de fusion du VHB. Enfin, nos études en cours ont permis de modéliser un pont disulfure dit « allostérique » dont la modification abolie le processus de fusion membranaire. Néanmoins, la nature, la fonction et la coordination de l’ensemble de ces déterminants restent encore très mal connus.

L’objectif de ce projet est de mieux comprendre comment le VHB induit la fusion de sa membrane lipidique avec celle de la cellule en utilisant une combinaison d’outils bioinformatiques et expérimentaux. Dans une étude antérieure sur le virus de l’hépatite C, nous avions montré que la combinaison d’analyses bioinformatiques et de virologie moléculaire est une approche particulièrement efficace pour disséquer les modifications des protéines de surface du virus impliqués dans les processus de fusion membranaires. L’analyse bioinformatique de la co-évolution des résidus des protéines de surface du VHB combinée à différentes approches computationnelles telles que proposée dans ce nouveau projet permettra d’identifier un ou plusieurs groupes de résidus potentiellement impliqués dans le processus de fusion et de formuler des hypothèses pour comprendre l’activation du mécanisme de fusion membranaire. Ces hypothèses seront testées par différentes expériences mettant en jeu des protéines de surface mutées ainsi que par des modulations d’expression ou des inhibitions des facteurs cellulaires d’entrée impliqués.

Nous utiliserons comme systèmes expérimentaux principaux un test de fusion cellule-cellule ainsi que le virus de l’hépatite D (VHD) dont les particules comportent les protéines de surface du VHB. La qualité de production des particules sera examinée en analysant le contenu des protéines de surface et l’ARN du VHD. En utilisant ces systèmes expérimentaux, nous examinerons notamment si l’induction du processus de fusion lors de l’entrée cellulaire est le résultat de leur interaction avec certains membres de la famille des protéines disulfure isomérases (PDI). La participation de membres de la famille PDI dans l’entrée du VHB sera évaluée avec des inhibiteurs, anticorps et shRNA spécifiques de ces protéines afin de pouvoir identifier le facteur impliqué dans l’entrée du VHB et l’étape à laquelle se déroule cette interaction présomptive. Les analyses et les prédictions bioinformatiques nous aideront à modéliser les interactions au sein des protéines de surface du VHB ainsi qu’avec la PDI identifiée et les changements de conformation qu’elles subissent lors du processus de fusion. L’analyse des résidus impliqués sera réalisée par des substitutions conservatives ou non-conservatives et l’analyse ex vivo des propriétés des particules VHD ainsi modifiées dans des tests biochimiques, d’infectivité, d’interactions avec les co-facteurs d’entrée, dont la PDI, et de fusion membranaire in vitro.

L’intestin est un compartiment clé pour la réplication du VIH-1, dès les stades précoces de l’infection, entraînant une déplétion profonde des lymphocytes T CD4+ dans la muqueuse intestinale, notamment les cellules productrices d’IL-17 (Th17, Th1Th17) qui jouent un rôle central dans l’homéostasie muqueuse.

Dans l’étude ANRS EP44, nous avons observé un défaut de reconstitution des lymphocytes T CD4+ dans la muqueuse intestinale sous traitement antirétroviral, en particulier des Th17 et Th1Th17, notamment du fait d’altérations du recrutement des lymphocytes T CD4+ du sang vers le compartiment intestinal.

La caractérisation virologique réalisée chez les individus de l’étude ANRS EP44 a révélé la persistance d’une fraction augmentée de T CD4+ hébergeant de l’ADN VIH-1 par rapport aux T CD4+ sanguins, la persistance d’une production virale résiduelle, et une compartimentation des populations virales dans l’intestin chez plus de 75% des individus étudiés.

Le projet proposé a pour objectif de mieux caractériser les cellules cibles du VIH-1 dans la muqueuse intestinale, notamment en fonction du tropisme d’utilisation des corécepteurs CCR5 et CXCR4. Nous avons développé un modèle d’histocultures de tissu intestinal humain permettant d’étudier l’infection des différentes sous-populations de T CD4+ dans le micro-environnement tissulaire muqueux. Nos résultats préliminaires montrent que les virus utilisant CCR5 infecteraient préférentiellement les T CD4+ CCR6+, en particulier les Th1Th17 et Th17, alors que les virus utilisant exclusivement CXCR4 cibleraient préférentiellement les T CD4+ CCR6-. Nous chercherons à mieux caractériser les sous-populations de T CD4+ ciblées par les virus utilisant CCR5, notamment les Th17, Th1Th17, Th22 ainsi que les sous-populations de Treg CCR6+ vs. CCR6-, et à comparer les cinétiques d’infection entre ces sous-populations. Nous chercherons également à préciser les sous-populations ciblées préférentiellement par les virus utilisant CXCR4, et à mieux comprendre les facteurs de susceptibilités à l’infection entre ces sous-populations T CD4+ en fonction du tropisme viral.

La caractérisation des cellules cibles du VIH-1 dans la muqueuse intestinale, et les différences de susceptibilités selon le tropisme viral pour CCR5 ou CXCR4 pourraient permettre de mieux comprendre le rôle de ce compartiment dans la sélection des virus utilisant CCR5 observée aux stades précoces de l’infection. Ce projet pourrait également avoir des implications concernant la persistance du VIH-1 sous traitement antirétroviral.