Projets et candidats lauréats

L’objectif de ce projet est de concevoir un simulateur épidémiologique à base d’agents dédié à l’analyse et à la comparaison des interventions contre l’épidémie de COVID-19 à l’échelle des villes au Vietnam. Le simulateur, appelé COMOKIT (pour COvid-19 MOdeling KIT), est basé sur une description fine des comportements individuels et des politiques publiques et permet aux utilisateurs de mener des expériences virtuelles, dans des environnements simulés, même avec une quantité limitée de données disponibles.

Le Vietnam est l’un des rares grands pays à être encore dans une phase pré-épidémique avec seulement 262 cas signalés et 0 décès (chiffres officiels du 13 avril 2020). C’est du à son extrême vigilance dans la gestion locale de l’épidémie, à base d’interventions telles que le confinement, faites au niveau des villages, des communes ou des petites villes immédiatement après la notification des cas. La littérature regorge de modèles épidémiologiques mais la plupart considèrent de grandes populations, ce qui apparaît limité dans le contexte de l’émergence d’un nouveau pathogène. D’un point de vue modélisation, les petites populations génèrent un certain nombre de difficultés liées à une très forte stochasticité dite démographique, ainsi qu’à de très grandes hétérogénéités tant individuelles qu’à l’échelle du foyer (en particulier hétérogénéité de comportements ou de respect des règles qui sont des facteurs importants à prendre en compte pour analyser ou prédire le succès d’une intervention). COMOKIT comblera cette lacune et a pour but de soutenir les autorités vietnamiennes (par le biais d’un partenariat avec le NIHE) dans leur conception d’interventions ciblées et informées contre le COVID-19.

Enfin, bien qu’il soit mis en œuvre pour une application immédiate à l’épidémie de  COVID-19, le simulateur sera conçu pour être rapidement adaptable à d’autres maladies infectieuses et à d’autres contextes géographiques, ouvrant la voie à l’adoption de modèles épidémiologiques intégrant des composantes sociales plus ambitieuses.

A l’échelle mondiale, le virus de l’hépatite B (HBV) est responsable de plus de 50% des cas de carcinome hépatocellulaire (CHC) et cette proportion est largement augmentée dans les pays de forte endémicité comme en Afrique de l’Ouest. L’histoire naturelle de l’infection par HBV a été essentiellement étudiée sur des cohortes Européennes ou Asiatiques, avec très peu de données pour l’Afrique en général et l’Afrique de l’Ouest en particulier où les modes de transmission, l’âge de l’infection, les facteurs génétiques et environnementaux, sont totalement différents de ceux des autres régions du monde.

De nombreuses données suggèrent que les différents génotypes et variantes du HBV ont un impact clinique et biologique différent et certaines protéines virales sont reconnues pour leurs propriétés oncogéniques. Cette étude se propose d’approfondir les caractéristiques des génotypes A et E Africains et de variantes du HBV (délétion dans le domaine préS2) au niveau du foie, ce qui sera une première dans cette région du monde. Nous avons un projet actuel subventionné par l’ANRS (12357) qui est basé sur une cohorte ouest-africaine (PROLIFICA). Dans le cadre de ce projet, nous avons pu mettre en évidence une augmentation de l’incidence des délétions preS2 (entre 12, 15 ou 18 paires de bases) dans le génome du HBV circulant chez les patients HBV chroniques de la Gambie. Ces délétions montrent une corrélation avec la sévérité de la maladie hépatique (20% de délétions chez les patients avec hépatite chronique sans cirrhose, 35% chez ceux avec cirrhose et jusqu’à plus de 50% dans les cas de CHC) (Cohen et al, In prep).

Grâce à l’accès à une collection unique de 193 biopsies de patients HBV Africains, naïfs de tout traitement, pour lesquelles nous avons des sérums concomitants associés dans le cadre de la cohorte PROLIFICA, nous allons pouvoir identifier les paramètres de l’histoire naturelle des infections HBV en Gambie. Nous pourrons en particulier :

(i) caractériser les marqueurs HBV intrahépatiques et en particulier la quantité de cccDNA, et l’activité transcriptionnelle du HBV et corréler ces paramètres aux nouveaux potentiels marqueurs indirects du cccDNA (HBcrAg, pgRNA et miRNA circulants);

(ii) Séquencer le cccDNA intrahépatique de manière à déterminer si les mutations PreS2 identifiées dans les virions du sang circulant sont “archivés” dans la matrice transcriptionnelle

(iii) Evaluer l’effet des mutations Pre S2 sur l’activité transcriptionnelle du cccDNA et la réplication virale in vitro, dans des modèles cellulaires d’infection par HBV.

L’ensemble de ces données nous permettra de mieux caractériser les infections HBV en Afrique de l’Ouest, les particularités liées aux génotypes et variantes viraux, ceci sera particulièrement utile pour la mise en place et le suivi des traitements anti-HBV par analogues de nucléosides (inititiés dans PROLIFICA) ou par les nouveaux traitements qui émergent.

L’exploration du microbiote digestif est une technologie de plus en plus accessible aujourd’hui. De nombreuses données expérimentales chez l’animal et chez l’homme suggèrent qu’un dérèglement du microbiote intestinal (dysbiose) pourrait participer à un vieillissement plus précoce et à l’expression du phénotype de fragilité. Les Personnes vivant avec le VIH (PVVIH) présentent des marqueurs de fragilité phénotypique en moyenne 10 ans avant les personnes non infectées.     

Chez les PVVIH des altérations anatomico-fonctionnelles du système lymphoïde associé au tube digestif surviennent très précocement après l’infection par le VIH, et peuvent persister malgré une suppression virologique sous ART. Ces altérations sont associées à une translocation microbienne (passage de microbes et/ou de produits microbiens de la lumière intestinale vers l’organisme en absence de bactériémie), qui elle, est corrélée à l’activation immunitaire et la dysbiose intestinale.

L’objectif de notre étude est d’explorer le microbiote intestinal chez des PVVIH sur une durée de 5 ans et d’étudier l’association de l’évolution du microbiote avec le phénotype de fragilité ainsi qu’avec le poids des comorbidités.

Objectif principal: Etude de l’évolution différentielle à 5 ans du microbiote intestinal entre les différents groupes des PVVIH classés en 3 catégories selon les marqueurs phénotypiques de fragilité : fragiles (3 ou plus), pré-fragiles (1 à 2), non fragile (0).

Objectifs secondaires:

• Etude de l’évolution différentielle du microbiote intestinal entre les différents groupes des PVVIH à 3 ans
• Etude annuelle de l’évolution du profil immunitaire en fonction du groupe de fragilité pendant 5 ans
• Etude de l’association entre microbiote intestinal et activation inflammatoire à 0, 3 et 5 ans dans les différents groupes de PVVIH
• Etude de l’association entre le microbiote intestinal et la présence d’une ou plusieurs comorbidités dans les différents groupes de PVVIH

METHODES:

Le modèle de Fried comprend cinq marqueurs de fragilité qui correspondent à 5 domaines : faiblesse de préhension (force), faible endurance (énergie), activité physique réduite (activité physique), vitesse de marche lente (mobilité) et perte de poids involontaire au cours de la dernière année (nutrition). La présence d’au moins trois de ces critères qualifie la «fragilité » tandis qu’un ou deux critères définissent la préfragilité.

Les selles des participants seront recueillis pour l’analyse du microbiote, à l’inclusion, puis tous les ans pour une durée de 5 ans. Chaque prélèvement de selles donnera lieu à une consultation avec une diététicienne (afin de renseigner les habitudes alimentaires du participant, et les éventuels changements dans les 15 jours précédant le recueil des selles), ainsi qu’une évaluation impédancemétrique.

• Nombre de sujets participants : 132 (44 PVVIH fragiles-44 PVVIH préfragiles- 44 PVVIH non fragiles)
• Durée des inclusions : 18 mois
• Durée de participation à l’étude: 5 ans

Des analyses multivariées exploratoires non supervisées (Analyse en Composantes Principales) et supervisées (Analyse Discriminante par Moindre Carrés Partiels), seront réalisées pour identifier des biomarqueurs et/ou faire ressortir une empreinte microbiote caractéristique du phénotype de fragilité ou de sa progression.

Tous les tests statistiques seront calculés en fonction du seuil de significativité α=0.05. Les analyses statistiques seront réalisées à l’aide du logiciel SAS V9.4 (SAS Institute Inc., Cary, NC).

RETOMBEES:

L’évolution longitudinale du microbiote intestinal pourrait être associée à une évolution des marqueurs de fragilité, par exemple vers un état plus fragile. Sachant que le phénotype de fragilité pourrait être un état réversible, les marqueurs identifiés pourraient permettre un dépistage plus précoce et une prise en charge des patients pré-fragiles et fragiles, ou ceux ayant un risque d’évolution vers ces phénotypes.

Les réponses immunitaires dues aux cellules Natural Killer (NK) et B surviennent aux premiers stades de l’infection virale B et sont essentielles pour l’éradiquer. Pourtant, l’infection chronique (CHB) se produit parce que la réponse immunitaire antivirale est insuffisante. Les événements qui conduisent à un dysfonctionnement immunitaire ont été étudiés par notre groupe et nos partenaires. Grâce aux financements de l’ANRS, nous avons montré que les cellules B et NK sont dysfonctionnelles au cours de l’infection liée au virus de l’hépatite B (VHB) dans des modèles humains in vitro et validé ces résultats chez les patients atteints d’une infection chronique. Nous avons observé que les réponses des cellules B médiées par le Toll Like Receptor 9 (TLR9) étaient inhibées par la protéine d’enveloppe du virus (HBsAg). Nous avons noté que la perte d’expression de TLR9 sur la totalité des sous-ensembles de cellules B était médiée par la perte de l’activité de promoteur du VHB qui s’accompagne d’un blocage de la phosphorylation du facteur de transcription CREB. En outre, les réponses des cellules B médiées par TLR9, telles que la prolifération et la production de cytokines ont été inhibées chez les patients CHB. Pour les cellules NK, nous avons démontré plusieurs changements significatifs dans l’expression de leurs récepteurs, la perte de cytokines tels que IFNg, MIP1a et de la fonction de cytotoxicité par rapport aux donneurs sains. Cependant, la base moléculaire et la voie de signalisation du dysfonctionnement des cellules NK et B sont mal caractérisées. De plus, si cet état pouvait être inversé, ce que nous cherchons à déterminer, l’impact thérapeutique serait clef. Nous avons des données montrant que la perte de la fonction pCREB dans les cellules B entraîne non seulement la perte de l’expression de TLR9 mais également des gènes tels que BCL-2 qui est important dans le contrôle de la croissance cellulaire. Nous émettons l’hypothèse que la dérégulation de CREB joue un rôle dans la fonction des cellules B par TLR9 et non chez les patients CHB. Notre groupe dispose également de données montrant que la perte de fonction des cellules NK chez les patients CHB peut dépendre de mTOR, une voie qui est essentielle à la réponse des cellules NK. Plus frappant, nous avons des données récentes montrant que les cellules NK des patients CHB expriment Lag3 et TOX qui sont des gènes associés aux cellules T lorsque ceux-ci deviennent sur-stimulés et épuisés. Nous émettons l’hypothèse que plusieurs changements moléculaires se produisent dans les cellules NK des patients CHB qui dépendent de la modification de la voie mTOR par le VHB et plus spécifiquement l’HBsAg. Notre objectif est de définir les signatures génétiques qui conduisent à la fonction des cellules B et NK afin de contribuer à la compréhension du dysfonctionnement immunitaire induit par le VHB.

Pour explorer nos hypothèses, nous prévoyons d’utiliser des modèles humains in vitro de VHB, des plateformes de séquençage, des écrans CRISPR / Cas9, la cytométrie en flux et les techniques de biologie moléculaire. Dans les études sur les cellules NK et B, nous explorerons les altérations génétiques qui se produisent au cours des différents stades chroniques de la maladie, ce qui nous amène à inclure des patients aux différents stades cliniques de la maladie. Bien qu’il s’agisse d’un défi ambitieux, nous sommes convaincus d’avoir accumulé les outils de purification cellulaire, de production virale de VHB, de cohortes cliniques et de plates-formes de séquençage au sein de notre centre et d’avoir consolidé nos différentes collaborations pour explorer nos nouvelles hypothèses. Nous pensons que nos découvertes permettront de comprendre la signature moléculaire des cellules NK et B dans le contexte d’une infection par le VHB. À la fin du projet, nous espérons exploiter nos résultats dans des perspectives cliniques qui permettront d’identifier de nouveaux marqueurs diagnostiques et surtout de nouvelles pistes thérapeutiques pour les patients VHB.

L’hépatite E est une pathologie hépatique causée par le virus de l’hépatite E (HEV) et transmise principalement par voie féco-orale. Le HEV représente la cause majeure d’hépatites virales dans le monde et l’Organisation Mondiale de la Santé (OMS) estime à 20 millions le nombre de nouvelles infections par an. Le HEV cause une infection aiguë qui finit par être résorbée par le système immunitaire dans la majorité des cas.  Cependant, l’infection peut évoluer vers une hépatite chronique ou fulminante chez les patients immuno-déprimés et les femmes enceintes, respectivement. Le taux de mortalité est estimé de 40 000 à plus de 70 000 décès par an. HEV est le seul membre de la famille des Hepeviridae classé dans le genre Orthohepevirus.  Le génome du HEV est à ARN monocaténaire de polarité positive d’environs 7 kb. Il contient trois cadres ouverts de lectures (ORF1 à 3). L’ORF1 code pour une poly-protéine non structurale, impliquée dans la réplication du génome. Les produits des ORF 2 et 3 sont, quant à eux, impliqués dans l’encapsidation et la libération des particules virales néoformées. L’ORF1 code pour sept protéines non-structurales incluant:  la méthyltransférase (MeT), le Y-domaine (Y), la cystéine peptidase apparentée à la papaïne, un domaine hypervariable riche en proline (HVR), un Macro domaine (ou X domaine), un domaine hélicase ainsi qu’une ARN polymérase –ARN dépendante (RdRp).  Ces différents domaines jouent un rôle crucial dans l’inhibition de la réponse immunitaire innée pour promouvoir la progression de l’infection. 

 Dans les cellules infectées il se produit une accumulation d’intermédiaires de réplication d’ARN double brin (ARNdb), qui va induire la réponse immunitaire innée de l’hôte par activation du système Oligoadenylate synthetase /endoribonuclease L (OAS/RNAse L), interféron dépendant. L’OAS est activée suite à sa fixation à des ARN db et génère, à partir de l’ATP, des oligoadenylates (2’5’A). Ces derniers vont se fixer sur la ribonucléase cellulaire RNAse L et provoquer son activation. La RNAse L activée clive les ARN cellulaires et viraux. Ce processus conduit à l’activation de signaux promouvant la transcription des gènes stimulés par les interférons, l’inhibition de l’infection virale et l’apoptose de la cellule infectée. En contrepartie, les virus ont développé différents moyens pour échapper à la réponse antivirale de l’hôte. Des études sur les virus tels que l’Ebola, l’hépatite C, l’influenza A, et plus récemment les Coronavirus et les Rotavirus, ont montré que les protéines non structurales de ces virus peuvent inhiber le système OAS/RNAse L par séquestration d’ARNdb ou l’inhibition directe de la voie OAS/ RNAse L. Cette inhibition dépend de la présence de motifs H-x-(S/T)-x, assurant une activité phosphodiestérase. La transfection des différents segments de l’ORF1 dans les cellules de mammifère inhibe fortement la production d’interférons. Cependant, les mécanismes moléculaires impliqués dans cette évasion restent à être élucidés.  

Le but de ce projet est d’une part d’identifier et de caractériser des activités enzymatiques, et d’autre part de déterminer des motifs moléculaires impliqués dans l’inactivation de la réponse immunitaire innée. La réalisation de ce projet repose sur (i) la conception de façon rationnelle de constructions contenant les motifs H-x-(S/T)-x; (ii) l’expression des constructions générées en système cellulaire afin d’étudier leur effet sur la modulation de la réponse immunitaire innée ; (iii) la caractérisation biochimique des protéines recombinantes de l’ORF1, permettant d’élucider les mécanismes moléculaires observées en cellules ; (iv) la confirmation du rôle des motifs /domaines identifiés, à l’aide de mutagénèse dirigée, dans la modulation de la réponse immunitaire innée.

Finalement, l’identification et la compréhension des activités virales, impliquées dans l’inactivation de la défense cellulaire, pourrait permettre l’identification de cibles pouvant être exploitées pour la génération d’agents antiviraux spécifiques.

L’infection chronique par le VHB (CHB) est une maladie complexe entraînant une inflammation chronique du foie et compliquée par le développement d’une cirrhose et d’un carcinome hépatocellulaire (CHC). Différentes phases de la maladie ont été caractérisées en fonction du niveau de réplication virale, ainsi que des réponses immunitaires et inflammatoires de l’hôte. La prise en charge de l’infection chronique par le VHB repose sur un dépistage à l’échelle de la population et sur l’identification précise de la phase de la maladie et des patients nécessitant un traitement antiviral. La décision de traiter est aujourd’hui principalement basée, selon les principales recommandations internationales, sur le chrage viral VHB qui est aussi utilisé pour surveiller les traitements actuels basés sur les analogues nucléos (t) ide (NUC) ou l’interféron alpha pégylé (IFNa). Bien que la plupart des patients sous traitement avec NUCs atteignent des charges virales indétectables, avec un bénéfice clinique clair (risque plus faible de développer une cirrhose et un CHC), il n’y a actuellement aucun « cure » de l’infection VHB en raison de la persistance du mini chromosome viral, l’ADNccc, dans le foie des patients. Plusieurs nouveaux composés, visant à diminuer le pool de molécules d’ADNccc  et/ou bloquer l’activité transcriptionnelle de l’ADNccc pour obtenir avec une durée de traitement finie une guérison fonctionnelle (perte de l’AgHBs), sont en cours de développement.

Nouveaux et anciens biomarqueurs non invasifs sont actuellement évalués pour leur capacité à: a) refléter avec précision la taille et l’activité transcriptionnelle du pool d’ADNccc intrahépatique; b) mieux classer les patients non traités en fonction de leur histoire naturelle; c) prédire le succès d’une guérison fonctionnelle (perte de HBsAg) avec les thérapies antivirales actuelles ou nouvelles en cours de développement clinique; d) évaluer le risque de réactivation virale chez les patients qui arrêtent le traitement antiviral ou chez ceux qui suivent un traitement immunosuppresseur. Une étape critique pour la validation de ces nouveaux biomarqueurs et pour aider au développement de nouveaux médicaments pour la guérison du VHB est la disponibilité de méthodes fiables pour étudier le réservoir viral VHB dans le foie (taille du pool d’ADNcc, activité transcriptionnelle et statut épigénétique).

Dans ce projet, nous nous appuierons sur un certain nombre d’avancées technologiques ainsi que sur les résultats récents de notre laboratoire pour optimiser (dans des modèles d’infection VHB in vitro et in vivo) et valider (dans des échantillons cliniques) une nouvelle méthode basée sur le séquençage de nouvelle génération (NGS) de l’accessibilité à la chromatine du ADNccc (cccDNA-ATAC-sec) comme approche de référence pour définir l’état fonctionnel du mini-chromosome ADNccc dans le foie des patients CHB (non traités et traités) et pour aider a l’évaluation mécanistique de nouveaux médicaments ou nouvelles interventions immunitaires anti-VHB.

Les objectifs spécifiques du projet sont :

– la réduction du nombre de cellules infectées nécessaires pour un cccDNA-ATAC-seq;

– l’adaptation du protocole cccDNA-ATAC-seq afin de son utilisation dans des échantillons de biopsie hépatique ou d’aspiration à l’aiguille fine (FNA) du foie ;

– la validation du meilleur protocole cccDNA-ATAC-sec dans le contexte clinique en définissant davantage la relation entre les profils cccDNA-ATAC-seq, les modifications post-traductionelles des histones liées au a ADNccc (statut épigénétique du ADNccc) et la transcription du ADNccc dans 2 cohortes de patients CHB.