Projets et candidats lauréats

Contexte :

L’hépatite B chronique touche actuellement plus de 300 millions de personnes dont près de 40% développeront une cirrhose, un carcinome hépatocellulaire ou d’autres complications hépatiques. La cause de la chronicité est la persistance du génome du virus de l’hépatite B (VHB) dans les cellules infectées sous la forme d’un ADNccc (ADN circulaire clos de manière covalente). Durant le cycle de réplication, l’ADN viral est converti en ADNccc grâce à des protéines cellulaires et agit ensuite comme un réservoir viral et la matrice de transcription. Les traitements actuels de l’hépatite B limitent la réplication du virus et la progression de la maladie, mais ne ciblent pas l’ADNccc, induisant une rare clairance viral complète. Bien que des études récentes aient mis en évidence des facteurs cellulaires essentiels pour la formation de l’ADNccc, ils ne peuvent pas être ciblés par des antiviraux au vu de leur importance dans la cellule. En conséquence, l’identification et la caractérisation de nouveaux facteurs d’hôte de l’ADNccc comme cibles potentielles ferait avancer la compréhension du cycle viral, mais surtout fournirait de nouvelles stratégies thérapeutiques pour traiter et guérir l’infection chronique par le VHB.

Méthodes :

En effectuant deux criblages primaires « perte de fonction » à l’aide de deux banques de siRNA ciblant des kinases et des protéines membranaires dans la lignée cellulaire rapportrice HA2/3, nous avons obtenu une liste de candidats ayant un effet significatif sur la production d’antigène HBe du VHB du canard, un marqueur d’activité de l’ADNccc dans ce modèle. Parmi ces candidats, nous avons validé l’importance d’une kinase pour la réplication du VHB humain dans la lignée HepG2-NTCP grâce à un inhibiteur spécifique. Un criblage secondaire utilisant des siRNA ciblant les candidats des criblages primaires couplé à une méthode de détection spécifique de l’ADNccc par qPCR permettra d’identifier les facteurs spécifiques pour la biologie de l’ADNccc du VHB. La validation d’un de ces facteurs sera effectuée dans les cellules HepG2-NTCP, HepaRG différenciées (dHepaRG) et les hépatocytes humains primaires (PHH) à l’aide des shRNA, de la technique CRISPR-Cas9 et l’utilisation d’inhibiteurs spécifiques. Ensuite, l’étude du mécanisme d’action sera menée dans les cellules dHepaRG.

But et objectifs :

Le but de ce projet est d’identifier des facteurs cellulaires qui pourraient être des cibles thérapeutiques potentielles de l’ADNccc et permettant une guérison complète de l’infection par le VHB. Les objectifs sont :

1. Réalisation d’un criblage secondaire ciblant les protéines identifiées par deux criblages primaires dans un contexte d’infection de la lignée HepG2-NTCP utilisant une qPCR spécifique pour l’ADNccc
2. Validation du meilleur candidat ciblant l’ADNccc identifié par le criblage secondaire en utilisant la lignée HepG2-NTCP, les cellules dHepaRG et les PHH
3. Etude du mécanisme d’action du meilleur candidat sur la production et/ou la stabilité de l’ADNccc

Résultats attendus :

Nous estimons que notre stratégie permettra une avancée de la compréhension du cycle du VHB, de la biologie de l’ADNccc, et qu’elle fournira des cibles prometteuses pour le traitement de l’infection chonique, dans l’objectif d’atteindre une guérison complète.

L’infection chronique par le virus de l’hépatite B (VHB) augmente considérablement les risques de développer des maladies sévères du foie tel que le carcinome hépatocellulaire. Bien qu’efficaces pour maintenir l’infection sous contrôle, les traitements actuels ne permettent pas d’éradiquer le virus du fait de la persistance du minichromosome viral, l’ADNccc (circulaire clos de façon covalente). Il est donc absolument essentiel de développer de nouvelles thérapies ciblant directement cet épisome. L’interaction complexe entre le VHB et le système immunitaire de l’hôte crée un micro-environnement hépatique inflammatoire responsable des lésions du foie et du développement du cancer. Cette interaction est régie par la production de cytokines/chemokines à partir des hépatocytes ou des cellules immunitaires. Une meilleure compréhension de cette interaction intercellulaire est donc primordiale afin de ralentir significativement la progression de la maladie. Le stress du réticulum endoplasmique (RE) est une des voies de signalisation contrôlant la production de cytokines et est communément activée lors de maladies hépatiques. En particulier, le VHB, de par la production de protéines virales, induit cette voie de stress responsable d’une sécrétion plus importante de l’interleukin-8 (CXCL8), décrite pour attirer des cellules immunitaires. De manière intéressante, l’environnement pro-inflammatoire augmente la proportion de variants d’épissage du VHB, en particulier peu de temps avant l’apparition du cancer. Ce processus co-transcriptionnel génère une vingtaine de variants dont certains codent des protéines décrites pour moduler l’interaction avec le système immunitaire montrant un rôle prépondérant dans la pathogenèse induite par le VHB.

Nous avons identifié les hélicases à ARN DDX5 et DDX17 comme des régulateurs clés de l’épissage du VHB dans des cellules hépatiques primaires ou cancéreuses. Leur déplétion est notamment associée à l’induction du variant SP17 qui semble produire une nouvelle protéine virale que nous avons appelée HBc-P. De manière frappante, l’induction de ce variant et potentiellement de cette protéine est associée à l’induction d’un stress du RE et l’augmentation de l’expression de CXCL8.

L’objectif de ce projet sera donc d’établir un lien fonctionnel entre la production de HBc-P, l’induction du stress du RE et la production de cytokines pro-inflammatoires telle que CXCL8. Après avoir confirmé la production de HBc-P à partir du variant SP17 après infection d’hépatocytes primaires humains par un fractionnement de polysomes, nous générerons un vecteur lentiviral nous permettant de surexprimer cette protéine dans ces cellules. L’induction du stress du RE sera monitoré par une approche de Nanostring nCounter avec un panel de gènes dédiés associée à des expériences de Western blot quantifiant des évènements liés à cette voie de signalisation. En parallèle, les cytokines seront quantifiées par Isoplexis et leur régulation par HBc-P sera validée par de nouvelles expériences d’ELISA.   

Dans le cas où ces résultats obtenus au cours de financement corroborent notre hypothèse, ce projet fournira les bases d’un projet plus large visant à 1) caractériser le lien fonctionnel entre SP17/HBc-P et le tress du RE dans des modèles in vivo, 2) suivre l’expression de SP17/HBc-P chez les patients au cours des différénetes étapes de l’hépatite B chronique et enfin 3) caractériser la contribution d’autres variants d’épissage du VHB à l’interaction entre les hépatocytes infectés et les cellules immunitaires à la fois dans des modèles in vivo et chez les patients. Ce projet éclairera donc davantage l’importance fonctionnelle des variants d’épissage au cours de l’hépatite B chronique et ouvrira la porte au développement de nouvelles stratégies thérapeutiques, ciblant notamment le stress du RE, stratégie déjà employée contre des maladies hépatiques telle que la MASLD et dont des drogues ciblant cette voie sont actuellement en essais cliniques.  

Les maladies du foie et les cancers posent d'importants problèmes de santé au niveau mondial, avec des taux de mortalité élevés et une incidence croissante. Les maladies chroniques du foie touchent jusqu'à 20 % de la population européenne et le cancer du foie est à l'origine de 800 000 décès dans le monde. Plusieurs facteurs contribuent notablement à cette augmentation de l'incidence, notamment l'hépatite virale. Malgré l'efficacité des antiviraux et des vaccins, l'infection chronique par le virus de l'hépatite B (VHB) reste un problème majeur de santé publique dans le monde entier et une cause majeure d'hépatocarcinome. La production de métabolites par le microbiote intestinal, notamment les acides gras à chaîne courte (AGCC), influence considérablement la défense de l'hôte contre les agents pathogènes et favorise les effets antitumoraux et immunomodulateurs qui s'étendent au-delà des sites intestinaux. Bien que des études aient observé la régulation à la baisse des bactéries bénéfiques productrices d'acides gras à chaîne courte associées à l'infection par le virus de l'hépatite B (VHB) au cours de l'hépatite et l'influence des acides gras à chaîne courte sur les voies de signalisation des hépatocytes, leurs effets multiples et leurs mécanismes complexes peuvent poser des limites à leur ciblage pour le traitement de l'hépatite virale et de ses séquelles. Dans ce contexte, notre objectif principal est d'élucider les mécanismes moléculaires par lesquels les acides gras à chaîne courte interfèrent avec la signalisation inflammatoire du foie pendant l'infection par le VHB et d'essayer de corréler leur rôle dans la progression de la maladie hépatique chronique induite par le VHB. À cette fin, nous procéderons d'abord à une exploration approfondie des données transcriptomiques et protéomiques disponibles dans notre laboratoire, afin de découvrir de nouvelles informations sur la dynamique de l'expression génique et les réseaux de régulation associés aux voies des acides gras à chaîne courte (AGCC). Afin d'étendre et de valider la pertinence biologique des AGCC, et en émettant l'hypothèse que la réduction de leurs niveaux systémiques pourrait servir de biomarqueur pour la progression de la maladie du foie due au VHB, nous visons à évaluer leurs niveaux systémiques dans le sérum d'une cohorte établie de patients atteints de VHB chronique à différents stades de la maladie.

L’étude BADASSE (BActériolical DAtura Sub StudiEs) est une sous-étude bactériologique de l’essai DATURA (Determination of Adequate TUberculosis Regimen in Adults and adolescents hospitalised with HIV-associated severe immune suppression). DATURA a pour objectif d’évaluer la possibilité de réduire la mortalité de la tuberculose chez les personnes vivant avec le VIH par grâce à une intensification du traitement antituberculeux. BADASSE vise à identifier les déterminants bactériens du succès et de l’échec du traitement antituberculeux chez les patients inclus dans DATURA. Nous allons étudier en détail la sensibilité aux antibiotiques avec une caractérisation phénotypique (mesure précise de concentrations minimales inhibitrices (CMI) des antituberculeux de première et seconde ligne) et génotypique (séquençage complet du génome et analyse par Deeplex). L’objectif principal de l’étude est d’identifier des caractéristiques bactériennes corrélées à l’issue du traitement (CMI, mutations impliqués dans le résistome ou le tolérome bactérien). L’objectif secondaire est de caractériser la sensibilité aux antituberculeux de seconde ligne du régime BPaLM (bédaquiline, prétomanide, linézolide, moxifloxacine) qui est le standard du traitement des tuberculoses à bacilles multitrésistants pour évaluer la possibilité de l’utiliser dans cette population de tuberculoses à bacilles présumés sensibles. Ainsi l’étude BADASSE permettra d’identifier des marqueurs bactériens pronostiques pour les PVVIH ayant une tuberculose et permettra d’évaluer la faisabilité du régime BPaLM pour les cas de TB à bacilles sensibles dans les pays de l’étude DATURA.

Le virus de l'hépatite D (VHD) est un agent pathogène à ARN associé à la forme la plus sévère d'hépatite virale, conduisant à une progression rapide vers la cirrhose du foie et le carcinome hépatocellulaire. En tant que virus satellite, le VHD requiert la présence du virus de l'hépatite B (VHB) pour sa réplication, utilisant les protéines d'enveloppe de ce dernier. Le génome du VHD code uniquement pour l'antigène delta de l'hépatite (HDAg), présent sous deux isoformes, small (S)- et large (L)-HDAg, qui jouent un rôle crucial dans la réplication du génome et l'assemblage des virions. Cependant, la structure moléculaire du complexe ribonucléoprotéique (RNP) formé par S-HDAg et L-HDAg avec l'ARN viral reste énigmatique malgré l'utilisation des techniques structurales traditionnelles telles que la cristallographie aux rayons X et la cryo-microscopie électronique. Notre projet, s'étendant sur une période de trois ans, vise à élucider les interactions entre S-HDAg et L-HDAg avec l'ARN viral, ainsi qu'à modéliser la structure qu'ils forment en utilisant principalement la résonance magnétique nucléaire (RMN). Cette technique permet l'analyse de complexes présentant des degrés variables d'ordre et de symétrie, comme le RNP, et comprenant des segments flexibles, tels que les isoformes de HDAg. A terme, l'objectif est d'évaluer la possibilité de cibler les interactions entre HDAg et l'ARN viral avec des inhibiteurs afin d'entraver la réplication virale.