Projets et candidats lauréats

Les protéines transmembranaires induites par l’interféron (IFITM) sont une large famille d’inhibiteurs viraux et, à ce titre, inhibent le VIH-1. Chez l’homme, IFITM1, 2 et 3 exercent ces fonctions antivirales en interférant avec la fusion entre membrane virale et membrane cellulaire à deux phases distinctes du cycle viral : lors de l’infection d’une nouvelle cellule, en conduisant à la séquestration des particules virales dans les endo/lysosomes et dans une cellule infectée en conduisant à la production de nouvelles particules virales moins infectieuses. Plusieurs hypothèses ont été avancées au fil des années pour expliquer ce phénomène d’inhibition de la fusion membranaire, comme par exemple la rigidification directe des membranes par insertion, mais plusieurs évidences suggèrent que les IFITM peuvent exercer des effets à la fois directs et indirects sur les membranes.

Grâce à une étude de lipidomique conduit sur de particules virales du VIH-1, nous avons mis en évidence qu’IFITM3 conduit à la production de membranes enrichies en trois classes de phospholipides (PLs) : les Céramides (Cer), la Phosphatidylcholine (PC) et les Phosphatidylinositols (PI). Nous sommes en train de confirmer ces changements à niveau cellulaire par microscopie confocale, suggérant que nous sommes en présence d’un réel, et nouveau, type de changement induit par IFITM3.

Les phospholipides sont des composants à part entière de la réponse antivirale, mais pour la plupart, les acteurs de cet aspect particulier du domaine de l’interaction hôte-pathogène ne sont pas bien connus, ni pleinement appréciés. Les changements lipidiques peuvent agir à plusieurs niveaux afin de moduler positivement ou négativement la réplication virale. En effet, ils peuvent altérer les propriétés biophysiques mêmes des membranes et ainsi moduler par exemple les mouvements latéraux de la gp41 ou des récepteurs cellulaires intégrés dans les membranes, mais ils peuvent aussi exercer des effets plus macroscopiques en modulant l’état d’activation de la cellule, sa migration, ou sa polarisation. Les Cer et le PC représentent respectivement de 2 à 50 % des lipides membranaires et peuvent donc influencer directement les propriétés fusogéniques des membranes. A l’inverse, les PI sont présents à des niveaux beaucoup plus faibles, mais jouent un rôle essentiel dans la signalisation cellulaire et agissent comme des plates-formes de recrutement pour des protéines qui peuvent elles-mêmes influencer le comportement membranaire, comme récemment suggéré pour IFITM3 dans les cellules B murines. Pour ces raisons, il nous semble important de comprendre comment IFITM3 induit des changements des Cer, du PC et des PI et de déterminer les conséquences de ceux-ci pour le VIH. Étant donné que ces conséquences peuvent êtres exercés à des niveaux très différents, nous commencerons par explorer leur poids dans le défaut de fusion membranaire induit par IFITM3. Plus généralement, nous pensons que les résultats de ce projet fourniront de nouvelles pistes d’investigation sur l’importance de la relation IFITM-PL sur d’autres aspects de la fonctionnalité cellulaire tels que l’état d’activation cellulaire, le contact de cellule à cellule, la polarisation, etc, paramètres qui modulent également la réplication du VIH.Ce projet s’inscrit dans la continuité d’une précédente subvention ANRS (AO 2019-1 se terminant en avril 2022) qui portait sur plusieurs aspects de la biologie des IFITM. Compte tenu de la complexité du sujet, la présente proposition est couplée à une bourse post-doctorale non nominative.

Contexte :  Le virus de l’hépatite Delta (HDV) est un agent pathogène humain découvert en 1977 chez des patients italiens atteints d'une forme grave du virus de l'hépatite B (HBV). En 2023, grâce à nos travaux d’analyses phylogénétiques, d’horloge moléculaire et de phylogéographie réalisés sur un panel de plus de 480 souches réparties à travers le monde, nous avons pu montrer que HDV était devenu un virus humain au cours du néolithique dans la région d’Afrique centrale. Cependant son origine avant le passage à l’Homme reste à ce jour toujours inconnue. 

Objectif : Ce projet s’inscrit dans la continuité de nos travaux précédents et vise à rechercher dans la zone forestière d’Afrique centrale, l’éventuelle présence de séquences “HDV-Like” dans des échantillons d’animaux endogènes de ces forêts équatoriales. Les animaux ciblés seront ceux potentiellement infectables par un Hepadnavirus en tant que virus “helper” comme l’est le HBV chez l’Homme.

Méthodologie : Deux voies d’étude seront proposées. (1) Récupérer dans les banques de données génétiques internationales tous les transcriptomes issus d’animaux prélevés dans cette région d’Afrique centrale pour rechercher des séquences “HDV-Like”. (2) Collaborer avec l’Institut de Recherche et Développement (IRD) de Montpellier et le Centre International de Recherches Médicales de Franceville (CIRMF) au Gabon, afin de travailler sur leurs collections d’échantillons d’animaux d’Afrique centrale déjà disponibles et représentant près de 8 000 échantillons. Ces échantillons seront analysés par PCR conventionnelle pour la présence du HBV et du HDV suivi d’un séquençage des amplicons pour confirmation et analyses phylogénétiques. Les génomes complets de nouveaux virus HDV-like seront séquencés par approche métagénomique.

Résultats attendus : En mettant en évidence des séquences génétiques de “HDV-Like” proches du HDV chez des animaux sauvages permettra de confirmer et de finaliser nos travaux sur l’origine du HDV. D’autre part, nous pourrons évaluer la prévalence de l’infection par un Hepadnavirus au sein d’une très large population animale en milieu naturel permettant ainsi de mieux comprendre la transmission potentielle inter-espèces des 2 virus HBV/HDV et de leur co-évolution. Les résultats de cette étude permettront une meilleure compréhension de l’épidémiologie actuelle du HDV chez l’homme, incitant ainsi à rechercher la présence de cette infection dans des zones géographiques encore non explorées.

Considérations éthiques : Ce travail sera réalisé sur des collections rétrospectives d’échantillons d’animaux ne nécessitant pas de considération éthique.

La tuberculose (TB), provoquée par la bactérie Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis) a été responsable de plus d’un million de décès dans le monde en 2021. Par conséquent, déchiffrer les mécanismes moléculaires permettant au bacille de la tuberculose, M. tuberculosis, de prospérer à l’intérieur de son l’hôte a pour objectif de  permettre de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques. A cet égard, les cytokines de la famille de l’IL-1 produites par les macrophages alvéolaires sont des effecteurs cruciaux de la réponse immunitaire contre M. tuberculosis. Ainsi, la production des cytokines de la famille de l’IL-1 nécessite la détection microbienne par les recepteurs intracellulaires et pro inflammatoires inflammasomes, un processus que M.tuberculosis évite efficacement grâce à ses facteurs de virulence. Cela soulève la question de savoir si d’autres recepteurs intracellulaires ont le potentiel de surmonter l’evitement de la détection immunitaire provoquée par M. tuberculosis. Ici, nous avons isolé un recepteur immunitaire spécifique, le complexe inflammasome NLRP1, fortement exprimé dans les macrophages alvéolaires humains et capable de détecter un facteur clé de la virulence de M. tuberculosis, PknG. Par conséquent, ce projet vise à déterminer les mécanismes moléculaires qui favorisent l’activation de l’inflammasome NLRP1 et son implication dans la modulation de la réponse immunitaire à M. tuberculosis.

Les macrophages sont l’une des cibles de l’infection du virus de l’immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1). Ces cellules jouent à ce titre un rôle majeur dans la physiopathologie de l’infection en favorisant la dissémination du virus lors de contacts cellule à cellule ainsi qu’en constituant l’un des réservoirs viraux chez l’individu infecté même sous traitement antirétroviral hautement actif. Les macrophages infectés produisent également des particules virales sur une période de temps élevée et les séquestrent dans des compartiments intracellulaires spécifiques appelés VCC, issus de l’invagination de la membrane plasmique. Dans ces compartiments, les virus restent pleinement infectieux et sont libérés ultérieurement lors des contacts cellules à cellules. Ces particules virales séquestrées échappent ainsi à la surveillance du système immunitaire des patients infectés et aux traitements antirétroviraux. Bien que la présence de ces compartiments chargés de virus ait été rapportée dès 1988 , les mécanismes moléculaires participant à l’établissement de ces sanctuaires viraux sont encore peu décrits. Comprendre comment les particules virales sont séquestrées et persistent dans les macrophages est donc un enjeu majeur pour progresser dans l’éradication de ces sanctuaires viraux.

Nos données récemment publiées montrent que le facteur de restriction BST2/Tetherin est présent dans les VCC et le volume des VCC au cours de l’infection dépend de l’expression de BST2 (Leymarie, J. Virol 2020). Acteur de l’immunité innée, BST2 restreint la dissémination de virus enveloppés et notamment du VIH-1. La protéine Vpu du VIH-1 est l’un des acteurs viraux capable de contrer cette restriction. De manière intéressante, nos études révèlent que, dans les cellules HeLa, le VIH-1 est capable d’engager un mécanisme de d’autophagie non canonique, semblable à la LC3-associated phagocytosis (LAP-like) pour contrer la restriction BST2. Ce mécanisme favorise la dissémination du virus. Au cours de ce processus, Vpu recrute la protéine d’autophagie LC3C et engage un mécanisme de LAP-like accélérant la phagocytose des molécules de BST2 associées aux virus, présentes au site de bourgeonnement (Madjo et al. Cell report 2016).

Dans ce projet, nous émettons l’hypothèse que les VCC seraient le résultat d’une LAP abortive en réponse à la restriction imposée par BST2 sur la production de particules virales. A la différence de ce que nous avons pu décrire dans les cellules HeLa, dans les macrophages, ce processus débuterait mais n’aboutirait pas/ou moins efficacement à la dégradation du contenu des LAPosomes, ces LAPosomes devant alors des VCC. Les virions persisteraient intracellulairement dans les VCC, faute d’une fusion efficace ou plus lente entre VCC et lysosomes.
L’objectif de ce projet est donc de définir les mécanismes moléculaires qui conduisent à la séquestration et à la persistance du VIH-1 dans les macrophages, et plus particulièrement la contribution de la LAP dans ce processus.

Aussi, proposons-nous dans ce projet de définir, lors d’une infection de macrophages primaires par le VIH-1,

• Si les VCC sont des LAPosomes induits par l’infection VIH-1 par des approches d’imagerie et biochimiques.
• La contribution de la LAP dans la séquestration des virions dans les VCC, en utilisant dans nos essais virologiques des approches d’ARN interférence et Crispr/Cas9.
• Les mécanismes cellulaires empêchant la fusion des VCC avec les lysosomes, en analysant notamment la phosphorylation des protéines autophagiques LC3. 

Ce programme de recherche permettra de déterminer les acteurs de la LAP indispensables au développement et au maintien des VCC dans le macrophage , mais aussi d’identifier les protéines virales qui contrôlent ces processus. Ce travail apportera également des connaissances nouvelles quant à la régulation de la production du VIH-1 dans le macrophage, ouvrant le champ à de nouvelles stratégies thérapeutiques pour contrôler la réplication du virus et l’éradiquer.

La recherche sur les vaccins contre le VIH-1 a connu un essor considérable depuis la découverte de nombreux anticorps largement neutralisants (bnAbs) ciblant divers sites de la glycoprotéine d’enveloppe (Env) du VIH-1.

Bien qu’aucun vaccin capable d’induire une réponse anticorps neutralisante d’un large spectre (bnAb) n’ait encore été mis au point, des progrès considérables ont été réalisés pour comprendre la complexité de la réponse humorale au cours de l’infection. Ces études ont conduit à la découverte d’une pléthore d’anticorps ciblant divers sites de la protéine d’enveloppe (Env)  tels que les régions V1/V2, V3, le site de liaison aux CD4, sur la sous unité gp120 , le peptide de fusion sur la sous unité gp41 et/ou l’interface gp120/gp41, la face silencieuse de la gp120 et la région externe proximale de la membrane (MPER) de la gp41. La biologie structurale, associée à des études longitudinales sur le développement de la lignée des cellules B, a joué un rôle clé dans la compréhension du rôle de l’hypermutation somatique dans la génération d’anticorps largement neutralisants. Malgré ces avancées, le développement d’un vaccin pose toujours d’énormes défis et les approches vaccinales actuelles utilisant des trimères Env natifs induisent au mieux une neutralisation autologue.

La région externe proximale de la membrane (MPER) de la gp41 est l’une des régions de l’Env les plus conservées et les anticorps bnAbs spécifiques de la MPER sont parmi les anticorps les plus largement neutralisants. Les bnAbs MPER reconnaissent des épitopes linéaires courts et utilisent un long CDR3 de la chaîne lourde (HCDR3) qui n’est pas nécessaire à la reconnaissance de l’épitope, mais essentiel pour la neutralisation. HCDR3 contient généralement des résidus hydrophobes aromatiques à son extrémité qui sont positionnés pour s’insérer dans la bicouche lipidique. En outre, les bnAbs MPER interagissent avec la membrane via des contacts électrostatiques ou une interaction lipidique spécifique. Cela a conduit à la proposition que les bnAbs MPER sont autoréactifs et donc difficiles à induire par la vaccination. Une structure récente de la gp41 réalisée par notre laboratoire suggère que les bnAbs MPER entrent également en contact avec le peptide de fusion (FP) via le hCDR3 en plus de l’interaction MPER établie. Nous émettons donc l’hypothèse que toutes les tentatives passées d’induire des anticorps neutralisants MPER ont échoué parce que les immunogènes employés manquaient de FP. A partir de nos résultats acquis ou préliminaires sur des anticorps neutralisants ciblant l’interface du MPER et du FP, nous proposons donc de caractériser davantage l’interaction HCDR3-FP et de tester l’immunogénicité d’un ensemble de nouveaux immunogènes qui incluent le MPER et le FP dans un environnement de bicouche lipidique. L’objectif principal de cette proposition est de (i) concevoir de nouveaux antigènes de la gp41 qui présentent le MPER et le FP, (ii) présenter le ou les immunogènes dans un environnement membranaire via une formulation vaccinale d’ARNm ou des nanoparticules, (iii) tester l’immunogénicité chez les petits animaux et (iv) évaluer la neutralisation, y compris l’isolement de bnAbs comme preuve de concept.

La tuberculose est une maladie infectieuse chronique causée par Mycobacterium tuberculosis responsable de 10 millions de cas de maladie active et 1,4 million de décès en 2019. Le vaccin vivant atténué BCG dérivé de M. bovis par Calmette et Guérin il y a 100 ans, représente toujours le seul vaccin antituberculeux autorisé. Cependant, alors que la vaccination des jeunes enfants par le BCG les protège efficacement, elle ne prévient pas la tuberculose pulmonaire à l’âge adulte. Le développement d’un vaccin plus puissant est donc urgemment nécessaire pour contrôler l’épidémie mondiale.

En comparant le BCG à M. bovis et M. tuberculosis, nous avons montré que la région génomique de différence 1 (RD1) est absente de toutes les souches de BCG mais qu’elle est conservée dans tous les isolats virulents de M. bovis et MTB. Les protéines codées par le segment RD1 sont impliquées dans plusieurs processus biologiques et interactions hôte-pathogène importants. Elles comprennent les antigènes immunodominants ESAT-6 et CFP-10, qui concourent à la capacité de MTB à s’échapper du phagosome en rompant la membrane phagosomale du phagocyte hôte, ainsi que les composants structurels du système de sécrétion ESAT-6 (ESX)-1 qui participent à la sécrétion de ces deux antigènes. Nous avons construit des souches de BCG recombinantes capables d’accéder au cytosol comme MTB en clonant le système de sécrétion ESX-1 de MTB ou M. marinum dans le génome du BCG. L’insertion du locus esx-1 de M. marinum dans le BCG (BCG:ESX-1Mmar) a conféré une protection plus forte par rapport au BCG chez la souris, avec une immunogénicité et une efficacité similaires au BCG:ESX-1Mtb mais avec une virulence plus faible. L’expression d’ESX-1 a entraîné une signalisation cytosolique suivant l’axe cGas/STING/TBK1/IRF-3/interféron de type I et une activité accrue de l’inflammasome AIM2 et NLRP3, ainsi que l’augmentation de la fréquence des cellules T CD4+ et CD8+ spécifiques des mycobactéries.

Le BCG est connu pour ses effets protecteurs non-spécifiques qui reposent sur l’immunité entraînée, également appelée mémoire immunitaire innée. Les monocytes et les neutrophiles entraînés présentent une réactivité accrue, y compris des fonctions anti-mycobactériennes améliorées, qui participent aux effets protecteurs du BCG.

Nous évaluerons si le BCG:ESX-1Mmar peut reprogrammer fonctionnellement et durablement les cellules myéloïdes innées, de manière similaire ou différente du BCG, sachant que l’IFN-g et l’IL-1b produits en réponse au BCG et au b-glucan (un autre stimulus d’immunité entrainée canonique), respectivement, favorisent l’immunité entraînée, alors que les IFN de type I induits par MTB au contraire l’empêchent, et que BCG :ESX-1Mmar provoque la sécrétion d’IFN-b par les monocytes in vitro, contrairement au BCG mais à un niveau inférieur par rapport au MTB, et d’IL-1b de manière similaire au MTB mais à un niveau supérieur au BCG.

Nous comparerons BCG:ESX-1Mmar et BCG pour leur capacité à entraîner des monocytes in vitro et à induire une mémoire immunitaire dans le compartiment myéloïde inné in vivo en immunisant des macaques (n=5/groupe). L’hypothèse d’une contribution de l’inflammation systémique précoce et/ou de la présence du vaccin dans la moelle osseuse, qui devraient différer entre BCG:ESX-1Mmar et BCG, à la reprogrammation de la myélopoïèse et à la modification à long terme des monocytes et neutrophiles sanguins sera testée avec une analyse de corrélation multivariée, et in vitro en utilisant un modèle cellulaire basé sur la différenciation de progéniteurs hématopoïétiques en présence de plasma d’animaux immunisés et/ou de monocytes infectés in vitro autologues.

Ce travail collaboratif implique deux équipes aux expertises complémentaires dans le domaine des interactions de MTB avec les cellules immunitaires de l’hôte, de l’immunologie des vaccins, y compris l’immunité entraînée, et des modèles primates non humains. Il devrait accélérer le développement du BCG:ESX-1Mmar en tant que vaccin en élucidant davantage ses modes d’action. Il devrait aussi contribuer à mieux comprendre les mécanismes d’induction de l’immunité entraînée en utilisant BCG:ESX-1Mmar comme outil.

Différents processus cellulaires controlant la stabilité de l’ARN peuvent avoir de effets sur la réplication virale. C’est notamment le cas du nonsense mediated mRNA decay (NMD) qui dégrade les ARN messagers présentant un codon stop dans un contexte atypique. Récemment, la caractérisation des ARN retroviraux comme des cibles potentielles du NMD nous a amené à nous demander comment ces retrovirus arrivent à contourner cette menace et comment cela peut modifier l’expression des genes cellualires : une cis-inhibition du NMD qui n’impacte que l’ARN viral et/ou une trans-inhibition du NMD qui modifie également la stabilité des ARN cellulaires. Dans le cas du VIH, l’ARN viral semble globalement protégé mais nous ne savons pas encore ce qui empeche le NMD de cibler cer ARN. De plus, il n’a jamais été demontré si l’expression du VIH peut moduler l’efficacité du NMD en trans, affectant alors les ARN cellulaires et comment cela se traduit sur les voies associées que sont le splicing alternatif et la traduction.  

Dans ce programme de recherche nous prévoyons de démontrer tout d’abord que le NMD est sensible à l’expression du virus VIH en mesurant la stabilité des ARN et les niveaux de protéines traduites dans des cellules. Pour ce faire, nous utiliserons des ARN rapporteurs sensibles au NMD que nous avons déjà largement utilisés dans le passé. Dans un second temps, nous décrirons le mécanisme d’inhibition après avoir identifié son effecteur viral.Chaque protéine d’VIH sera testée seul ou en combinaison. Des résultats préliminaires ont déjà montré que Rev peut inhiber le NMD. Sur la base de ce travail et notre connaissance de l’autre rétrovirus humain HTLV  (notamment de l’homologie entre Rev et HTLV-1 Rex), nous suspectons que l’inhibition dependante de Rev soit liée à son activité de transfert nucléo-cytoplasmique à travers son interaction avec CRM1. La caractérisation de l’effet de Rev sera aussi analysé du point de vue des facteurs du NMD : en utilisant des protéines mutantes et des drogues déjà décrites, nous pourrons definirà quelle(s) etape(s) du nmd VIH manipule. dans la troiseme partie du projet, nous voulons cribler  les arn dont la dérégulation est liée 0 l’inhibition du NMD. La caractérisation des ½ vies des ARN cellulaires srea réalisée par RNAseq dans des cellules exprimant Rev. Nous avons déjà mis au point cette procédure pour des analyses similaires avec des portéines d’HTLV-1 au laboratoire.  De ces résultats de RNAseq et en utilisant des outils de bioinformatique developpées par d’autres équipe du LBMC, nous analyserons l’impact de cette inhibition du NMD sur le splicing alternatif. Finallement nous réaliserons des ribosomes footprintings afin de corréler la dérégulation du NMD à une possible modification de l’éfficacité traductionnelle.

Des résultats préliminaires ont déjà validé Rev comme inhibiteur du NMD. Ainsi, dès le début du projet, nous pourrons commencer à travailler sur 2 axes en parallèle : la description du mécanisme d’inhibition et l’identification des cibles NMD cellulaires en RNAseq.