Projets et candidats lauréats

Le Sida est caractérisé par une perte des lymphocytes T CD4 suite à l’infection, mais surtout une mauvaise qualité de la réponse immune et un état d’activation chronique du système immunitaire ainsi qu’une inflammation chronique et un épuisement du système immunitaire. Parmi les patients vivants avec le VIH (PVVIH) sous traitement anti-viral (TARV) qui ont été traités en phase chronique avec un niveau de LT CD4 bas (< 200 ou 350/mm3 selon les définitions), on identifie le groupe défini comme « bons répondeurs » immunologiques au TARV qui se caractérise par une bonne reconstitution immune et un nombre de LT CD4 > 500/mm3. En revanche, un autre groupe est défini comme « moins bons répondeurs » immunologiques car leur système immunitaire n’arrive pas à se reconstituer correctement et présente un nombre de LT CD4 < 500/mm3 malgré le TARV. Ces deux groupes, caractérisés par une histoire d’infection prolongée avant la mise sous TARV sont différents sur des aspects immunologiques : le groupe « moins bons répondeurs » immunologiques au TARV présente une inflammation et une activation immune significativement supérieures à celle présente chez les « bons répondeurs ».

Le lien entre l’infection virale, l’inflammation, l’activation immune et l’immunométabolisme est de plus en plus évident avec l’apparition de plusieurs études élucidant ce lien.

Les cellules immunes dont les lymphocytes T (LT) se caractérisent par des signatures métaboliques spécifiques au niveau énergétique qui contrôlent leurs fonctions cellulaires à travers l’engagement de voies de signalisation et de métabolites nécessaires à leur fonction au niveau de l’activation, la prolifération, la différenciation, la polarisation et la production des cytokines. Aujourd’hui, multiples travaux montrent que les LT CD4 de PVVIH avec ou sans TARV présentent des défauts métaboliques avec un switch vers la voie glycolytique aérobique pas très bénéfique à long terme pour la cellule. En revanche, beaucoup d’informations nous manquent actuellement sur l’origine de ces défauts bioénergétiques, leur caractérisation au niveau des sous-populations LT CD4 et les conséquences des modulations métaboliques sur les fonctions des cellules immunes. En plus, nos travaux réalisés récemment sur les LT CD4 de rhésus macaques VIS+ en phase chronique mettent en évidence ces défauts bioénergétiques au niveau des LT CD4 périphériques. Nos travaux montrent que les LT CD4 majoritairement non infectés présentent des défauts majeurs de la phosphorylation oxydative (OXPHOS), voie principale pour produire l’énergie dans les cellules T naïfs et mémoires. En plus, on montre que ces défauts sont liés à la perte de la protéine OPA1 et de la mitofiline, deux piliers de la structure et morphologie mitochondriale. Ces défauts étaient plus drastiques chez les singes VIS+ à progression rapide que chez les singes VIS+ à progression lente.

Les principaux objectifs de ce projet seraient de chercher le rational de nos observations sur le modèle VIS des primates non humain (PNH) chez des PVVIH sous TARV avec deux profils immunologiques complémentaires, des « bons répondeurs » versus des « moins bons répondeurs », en comparaison avec des sujets sains : I) la présence de défauts bioénergétiques au niveau des LT CD4 qui serait à l’origine de ces différences immunologiques, II) A comprendre les origines de ces défauts et leurs conséquences sur les fonctions immunes, et enfin III) A proposer en ex vivo et in vitro une reprogrammation énergétique bénéfique pour les cellules par des métabo-modulateurs pour retrouver les bonnes signatures énergétiques et rétablir une bonne fonction immune des LT CD4. Cela permettra plus tard d’utiliser les signatures bioénergétiques définis pour détecter des PVVIH qui peuvent évoluer vers des profils de « moins bons répondeurs immunologiques » et leur proposer une reprogrammation métabolique bénéfique pour les transformant en profile de « bons répondeurs immunologiques » en renforçant leur reconstruction immunologique.

Les traitements antituberculeux actuels consistent en une polychimiothérapie où une combinaison d’antibiotiques est utilisée d’une part pour accélérer la réduction de la charge bactérienne  et d’autre part pour minimiser la sélection des mutants résistants. Malgré ces cocktails d’antibiotiques, les formes multirésistante et ultrarésistante de tuberculose représentent un problème majeur, ces infections ne pouvant, jusqu’à récemment, être traitées qu’avec des combinaisons antibiotiques (pendant deux ans à minima) moins efficaces et présentant des effets secondaires accrus et. Les progrès récents dans le développement des médicaments contre la tuberculose ont permis de proposer une nouvelle combinaison de médicaments (BPaL : combinaison de bedaquiline, pretomanid et linezolid), qui est active à la fois sur les souches sensibles et résistantes aux antibiotiques traditionnels. Malgré cela, une résistance inévitable aux antibiotiques de la combinaison BPaL est déjà en train d’émerger, et il reste important que de nouvelles molécules antituberculeuses soient découvertes et développées au sein de nouvelles combinaisons, afin de proposer de nouvelles alternatives thérapeutiques.

Dans ce contexte, les membres de ce consortium ont récemment découvert et développé une nouvelle classe de molécules antituberculeuses puissantes (appelée TriSLa) qui agissent sur une nouvelle enzyme de la chaîne de transport d’électrons bactérienne. Les composés TriSLas se sont montré actifs (bactéricide) aussi bien contre les formes en réplication de Mycobacterium tuberculosis (Mtb) que contre les formes dormantes et intracellulaire du bacille. De plus, ils se sont révélés efficaces dans un modèle d’infection mycobactérienne in vivo, ce qui confère aux chefs de file de la famille TriSLa un grand nombre d’attributs nécessaires à la progression vers un candidat préclinique. Au regard de ces données prometteuses, AC-DC a pour objectif de mener à bien le développement des molécules TriSla seules, mais également au sein de nouvelles poly-thérapies optimisées pour le traitement d’ infections à Mtb. Ces objectifs ambitieux seront atteints grâce à une approche multidisciplinaire, menée par des collaborateurs de renommée internationale, et respectivement experts en biologie structurale, en métabiologique mycobactérienne et en modèles murins d’infections mycobactériennes. Les objectifs visés au sein du programme AC-DC seront 1) d’optimiser la puissance, les propriétés pharmacologiques et l’efficacité des molécules TriSLa 2) de préciser la poche de liaison des composés TriSLa en utilisant des études de biologie structurale de pointe par CRYO-EM, 3) de définir l’impact des combinaisons d’antibiotiques incluant des composés TriSLa dans des modèles in vitro de Mtb en réplication et en dormance 4) de définir l’impact de l’exposition aux molécules TriSLa sur les réseaux métaboliques de Mtb en réplication et en dormance 5) d’évaluer in vivo l’efficacité d’une combinaison optimisée d’antibiotique contenant un chef de file de la famille TriSLa dans un modèle murin d’infection à Mtb, et enfin 6) de définir le potentiel des molécules TriSLa dans une thérapie échelonnée pour le traitement des infections murines à Mtb.

Dans l’ensemble, le programme AC-DC va permettre de développer un candidat préclinique issue de la famille TriSLa, et de définir clairement comment une telle molécule doit être combinée avec d’autres antibiotiques pour traiter efficacement les infections de tuberculose.

Le nouveau coronavirus dénommé SARS-CoV-2 (severe acute respiratory syndrome -coronavirus 2) a été signalé pour la première fois en décembre 2019. Sa propagation est telle qu’il a été depuis déclaré pandémique et constitue une urgence de santé publique. L’Europe a rapidement été le nouvel épicentre de l’épidémie, maintenant rejointe par l’Amérique du Nord avec les USA, zones dans lesquelles les autorités politiques et sanitaires s’efforcent de contenir l’épidémie qui affecte gravement les personnes âgées ou co-morbides.

La pandémie de COVID-19 risque maintenant de toucher des zones plus fragiles aux systèmes de soins vulnérables, telles que l’Amérique du Sud ou l’Afrique. Quatre-vingt-six cas ont en effet déjà été confirmés au Mali, touchant quatre régions. Bamako est la ville la plus touchée, avec 90% des cas à elle seule. Le personnel soignant, en première ligne dans la prise en charge des patients Covid19, peut accidentellement être infecté et représenté une source d’infection pendant la phase d’incubation ou en cas d’infection asymptomatique ou pauci-symptomatique.

Les objectifs de ce projet sont ainsi i) de limiter la diffusion du SARS-CoV-2 au sein des services hospitaliers de Bamako en effectuant un dépistage systématique par biologie moléculaire des personnes symptomatiques (soignants/soignés) et en mettant en évidence les clusters de transmission, et ii) d’évaluer faisabilité d’un dépistage de biologie moléculaire par tests Point-of-Care au Mali. Par ailleurs, iii) la propagation et l’immunité acquise vis-à-vis du SARS-CoV-2 chez les soignants par des tests sérologiques seront évaluées, permettant également une évaluation de la proportion de soignants asymptomatiques et la vérification de l’absence de re-contamination parmi le personnel soignant immunisé. Enfin, iv) la variabilité du virus au cours du temps et la diffusion des différents variants dans le monde seront étudiées par séquençage total du génome viral.

Les données obtenues lors de ce travail collaboratif permettront ainsi de mieux caractériser l’infection COVID19 à Bamako et de lutter contre en temps réel, alors qu’il apparaît aujourd’hui primordial d’au maximum œuvrer pour limiter la propagation du virus dans les pays à ressources limitées. Notre projet vise également à améliorer nos connaissances virologiques sur ce virus émergent.

Les protéines d’enveloppes du VHB sont indispensables à l’assemblage des virions infectieux contenant le génome viral (virions-ADN). Cependant, la quantité de ces virons est inférieur de 3 à 5 log à la quantité des particules sous virales (PSV) constituées des seules protéines d’enveloppes L, M et S portant l’antigène VHB de surface (AgHBs). D’autres particules sous virales correspondant à des virions vides enveloppés circulent à une concentration 100 fois plus élevées que les virions-ADN. Enfin, certaines études ont documenté la présence dans le sérum de porteurs chronique de capsides virales nues. La faible quantité de virions ADN d’une part et la taille de ces particules produites de 20 à 40 nm rendent très difficile la description de la morphogenèse des virions-ADN du VHB par les méthodes conventionnelles d’observation par microscopie dans les cellules permissives. L’objectif de ce projet est donc de décrire l’assemblage du VHB en identifiant chacun des constituants viraux afin de distinguer la formation des virons-ADN de celle des autres particules virales et de suivre leurs trafics intracellulaires respectifs. Nous avons récemment caractérisé l’assemblage des protéines core (C) en capside et l’interaction entre les protéines L et C. Nos observations par microscopie électronique montrent que L se concentre dans des régions riches en membranes cellulaires dans lesquelles sont condensées un grand nombre de capsides vides. Nous proposons de poursuivre ce travail 1- en définissant le domaine cellulaire dans lequel les amas de L s’accumulent et en suivant l’effet de S sur cette localisation, 2- en caractérisant l’interaction et la localisation cellulaire des protéines L, C et S et, 3- en comparant l’assemblage et le trafic des virions vides et virions-ADN. Ce travail sera réalisé grâce à des plasmides qui expriment, dans des cellules hépatocytaires, de manière séquentielle ou combinée, l’ensemble des acteurs viraux impliqués dans l’assemblage des virions (protéines L, S et C en présence ou en absence du l’ADN viral). En plus des méthodes de biochimie et de microscopie optique, la seule méthode ayant une résolution nanométrique est la microscopie électronique qui, grâce à l’expertise du laboratoire, permettra sans ambigüité d’imager et d’identifier les différents types particules virales. Ces approches expérimentales seront étendues à l’étude de l’assemblage du HDV et les résultats obtenus trouveront une application directe dans la description du mécanisme d’action des inhibiteurs du VHB.

Introduction.La surinfection par le virus de l’Hépatite Delta (HDV) de patients chroniquement infectés par le virus de l’Hépatite B (HBV) induit une des formes les plus agressives d’hépatite virale chronique. Plus de 40 ans après sa découverte, cette surinfection reste énigmatique à la fois pour les chercheurs et les cliniciens. Les raisons de l’échec du traitement par l’Interferon-α(IFN-α), de l’aggravation de la pathologie hépatique et les interactions entre HDV, HBV et le microenvironnement hépatique sont toujours méconnues. En utilisant des hépatocytes primaires humains (PHH) et des cellules HepaRG différenciées (dHepaRG), nous avons identifiés une signature de gènes stimulés par l’IFN (ISGs) qui sont induits en même temps que la réplication/l’amplification des ARNs HDV. En parallèle, et comme décrits chez les patients, nous avons observé un effet suppressif d’HDV sur HBV dans les PHH, les dHepaRG et les souris aux foies humanisés (HuHep). Les résultats d’expériences pour lesquelles la réponse IFN des hépatocytes a été inhibée suggèrent que l’interférence d’HDV sur HBV repose à fois sur des mécanismes dépendent de l’IFN et des mécanismes indépendants, les derniers reposant possiblement sur l’association des protéines HDV avec les ARNs HBV.

Objectifs. L’objectif du présent projet est de décortiquer les mécanismes responsables de l’interférence d’HDV sur HBV. En particulier, (i) nous décrirons plus en détails l’interférence d’HDV sur HBV avec des modèles in vitro, ex vivo, in vivo en utilisant des méthodes très pertinentes comme les analyses au niveau d’une cellule, (ii) nous déterminerons quel(s) ISG(s) induits par HDV sont responsables de l’inhibition partielle d’HDV sur HBV et/ou de la réponse au traitement à l’IFN-α, (iii) nous mettrons en évidence les mécanismes moléculaires responsables de l’effet des protéines HDV sur la biologie de l’ADNccc et/ou des ARN HBV.

WP#1: Caractérisation de l’interférence d’HDV sur HBV. Des expériences seront réalisées pour déterminer si HDV est capable d’interférer avec différents génotypes HBV en utilisant des cellules HepaRG-HBV et des souris HuHep. Nous confirmerons la signature des ISGs induits par HDV en utilisant des modèles ex vivoet in vivo. Des analyses au niveau d’une cellule seront effectuées pour mieux comprendre la contribution des mécanismes dépendants et indépendant de l’IFN dans l’interférence d’HDV sur HBV.

WP#2: Identifications des ISGs induits par HBV impliqués dans l’interférence d’HDV sur HBV et/ou de la résistance au traitement par l’IFN-α. Des pertes de fonction des ISGs induits par HDV seront réalisées pour identifiés ceux impliqués dans l’interférence. Des analyses par RT-qPCR pour mesurer les niveaux des ARNm des ISGs induits par HDV seront effectuées sur des biopsies de patients co-infectés par HBV/HDV avant et après traitement par l’IFN-α pour déterminer si des corrélations peuvent être faites entre la signature des ISGs induits par HDV et la réponse à l’IFN-α. Si cela est le cas, des pertes de fonction de certains des ISGs induits par HDV dans les dHepaRG traitées ou non par de l’IFN-α seront réalisées pour identifier ceux impliqués dans la résistance à l’IFN-α.

WP#3: Mécanismes moléculaires responsables de l’interférence des protéines HDV sur HBV indépendamment de l’IFN. Des expériences d’immunoprécipitations des ARNs ainsi que des marquages en immunohistochimie seront réalisées sur des biopsies de patients et des liveroids pour confirmer l’association des protéines HDV avec les ARNs HBV. Des expériences de stabilité des ARNs seront effectuées dans des cellules HepaRG où la réponse IFN est invalidée pour déterminer si HDV diminue la stabilité des ARNs HBV. De plus, des expériences seront réalisées pour déterminer si HDV inhibe la transcription/l’élongation des ARNs HBV par des modulations épigénétiques de l’ADNccc.

Perspectives. Notre programme de recherche, qui se focalise sur la compréhension des interactions entre HBV, HDV et les hépatocytes, permettra de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques innovantes basées sur une meilleure utilisation de l’IFN-α ou sur le développement de nouveaux agonistes de l’immunité innée.

Les atteintes pathologiques du foie constituent actuellement l’un des groupes de pathologies les plus fréquents au niveau mondial, et leur incidence est en constante augmentation ces dernières années. Le virus de l’hépatite E (VHE) induit généralement des infections aiguës qui peuvent chez certains patients (patients immuno-compromis) évoluer en infections chroniques. Cette pathologie est en train de devenir globale.

Le VHE a longtemps été considéré comme un virus non-enveloppé (VHE-nucléocapside). Toutefois, si le virus est bien retrouvé sous forme de nucléocapside dans les selles, on sait maintenant que le VHE est associé à une membrane lipidique dans le sérum des patients et en culture cellulaire (eVHE). Le mécanisme de formation, la nature et la structure de cette membrane restent à caractériser précisément. La stratégie d’entrée du virus dans les cellules cibles, que ce soit pour le VHE-nucléocapside ou le eVHE, ainsi qu’un potentiel récepteur spécifique, restent à identifier. Il est toutefois possible d’envisager qu’un facteur de l’hôte (non-viral) permette au virus de se fixer sur la cellule cible, puis d’être internalisé par celle-ci.

Des publications récentes ainsi que les résultats préliminaires obtenus au laboratoire suggèrent qu’a l’instar du virus de l’hépatite C, le VHE a la capacité de détourner certains acteurs du métabolisme des lipides. Ainsi, ces composants pourraient participer à la formation de la particule virale, mais également être impliqués dans l’entrée des eVHE dans les cellules cibles.

Notre projet va consister à valider l’implication des acteurs du métabolisme des lipides dans la morphogenèse virale. Nous contrôlerons si certains composants des lipoprotéines (ApoE, lipides) sont directement associés au virus. Nous examinerons s’il existe une association différentielle de ces composants aux deux formes virales, VHE-nucléocapside et eVHE. Nous souhaitons également déterminer si les variations de taille des particules eVHE observée durant les tests préliminaires sont liées au contenu lipidique. Enfin, nous établirons si la formation de la particule virale est dépendante de l’ApoE et/ou de la microsomal triglyceride transfer protein (MTP), deux actrices majeures du métabolisme des lipides.

Ces travaux pourraient indiquer que divers virus hépatiques partagent la capacité d’exploiter à leur avantage certains composants métabolisme des lipides, de façon plus ou moins étendue.