Projets et candidats lauréats

Tout comme l’ADN ou les protéines, l’ARN est soumis à de nombreuses modifications chimiques, en particulier, les ARN viraux du VIH-1 contiennent les modifications m6A, m5C et 2′-O-Met. Même si une cartographie de ces modifications n’est pas établie de manière claire et précise, des modifications m6A et m5C sur l’ARNm du VIH-1 ont été préalablement identifiées au niveau du site de décalage du cadre de lecture entre Gag et Pol. Le VIH-1, comme beaucoup de rétrovirus, utilise un décalage du cadre de lecture programmé en -1, (-1 PRF) pour générer les protéines Gag et Gag-Pol, celui-ci est donc essentiel pour la réplication virale. Cependant, l’abondance des ribosomes sur l’ARNm est un facteur susceptible d’altérer l’efficacité du -1PRF. De manière générale, la distribution des ribosomes le long d’un ARNm, déterminée par la faible vitesse d’initiation par rapport à l’élongation, permet d’éviter les collisions. Néanmoins, des changements dans les vitesses d’initiation ou d’élongation peuvent altérer la fréquence de collisions, ce qui peut affecter de manière significative le frameshift programmé et donc l’expression de la polyprotéine Gag-pol. La modification m6A étant capable de ralentir ponctuellement le ribosome, il est possible que l’état de modification d’un ARNm soit un facteur de régulation de sa traduction.

Notre projet a pour but dans un premier temps de vérifier et caractériser la présence des modifications dans le génome du VIH en utilisant la technique de séquençage par nanopore qui permet de séquencer entièrement et de manière directe les molécules d’ARN. Afin de déduire la présence de sites portant des modifications, les molécules d’ARNm seront extraites de lymphocytes T CD4 + infectés par le VIH-1 et leur séquençage sera comparé à celui des mêmes molécules d’ARN mais transcrites in vitro et donc non modifiées. Dans un deuxième temps, afin de déterminer si les modifications de l’ARNm du VIH-1 peuvent jouer un rôle dans la vitesse de traduction et l’efficacité du frameshift, nous utiliserons la technique de ribosome profiling afin de comparer la densité des ribosomes et leur position sur les ARNm modifiés et non modifiés. Cela me permettra également de définir la phase de lecture de chaque ribosome en cours de traduction et son temps de résidence sur chaque codon. En complément nous utiliserons des systèmes rapporteurs afin de quantifier in vitro l’efficacité du décalage de cadre de lecture en -1 sur des ARNm modifiés et non modifiés. Afin d’aller plus loin dans la compréhension du rôle des modifications de l’ARNm sur la traduction, nous utiliserons une approche permettant l’étude de la traduction en molécule unique. Grâce à ce système, nous obtiendrons une quantification précise du déplacement du ribosome sur l’ARNm du VIH-1 avec ou sans modifications et en particulier au niveau du site de décalage du cadre de lecture en -1.

L’objectif de ce projet est donc d’étudier de manière complète le rôle des modifications de l’ARNm du VIH-1 dans l’expression des gènes viraux et dans la réplication du virus. Cela pourrait faire naître de nouvelles cibles thérapeutiques parmi les enzymes responsables de ces modifications capables d’impacter la pathogénicité du VIH-1.

Situation du sujet. Le VIH existe à l’état latent dans des cellules dîtes « réservoirs », dans lesquelles il s’exprime peu, voire pas du tout. L’un des principaux défis aujourd’hui est d’éliminer ce réservoir qui est inaccessible aux traitements antirétroviraux et est source de la production de virus infectieux dès l’arrêt des traitements chez les personnes infectées. La latence du VIH est gouvernée par une multitude de mécanismes moléculaires complexes. Le complexe HUSH, composé de Tasor, MPP8 et périphiline, est un complexe répresseur agissant au niveau épigénétique qui intervient très probablement dans ce processus. Il maintient à l’état silencieux des centaines de gènes, rétroéléments et en particulier, le virus VIH nouvellement intégré. Pour ce faire, il recrute l’histone méthyl transférase SETDB1 et permet le dépôt de marques épigénétiques répressives de type H3K9me3 sur le transgène. Nous avons montré récemment que certaines protéines lentivirales induisaient la dégradation du complexe HUSH, identifiant ce dernier comme un probable facteur de restriction. Comment l’activité de ce facteur est régulé et comment il réprime l’expression des trangènes est encore très peu connu.

Objectif. Afin de caractériser la restriction HUSH, nous avons conduit un crible double-hybride et avons identifié Cnot1 en tant que partenaire cellulaire de Tasor. Cnot1 est une protéine qui joue un rôle crucial dans le devenir des ARNm et leur stabilité mais qui a aussi été impliquée dans la transcription. Nos premiers résultats suggèrent que Cnot1 pourrait coopérer avec Tasor pour réprimer le virus. Dans ce projet, nous désirons étudier l’interaction Tasor-Cnot1 et son rôle dans la réplication du VIH.

Méthodologies. Nous étudierons : (i) la coopération entre Tasor et Cnot1 pour moduler l’expression virale. Ainsi, nous rechercherons des conditions d’interaction dans des lignées cellulaires et des cellules primaires et nous débuterons une analyse structure-fonction avec la recherche de mutants d’interaction. Nous nous demanderons si les deux protéines agissent dans la même voie ou si elles présentent des effets synergiques (suite à la transduction de virus ou directement sur des transgènes intégrés via les LTR). Compte-tenu des spécificités de Cnot1 et Tasor, nous nous demanderons si les deux protéines agissent au niveau épigénétique/transcriptionnel ou au niveau post-transcriptionnel. (ii) le rôle de Cnot1 et Tasor dans le maintien de la latence virale. Nous nous demanderons si Cnot1 contribue avec Tasor au maintien de la latence virale, dans un premier temps dans le modèle de latence du VIH-1 représenté par les cellules J-Lat. Nous étudierons la réactivation virale et les changements de présence de marques épigénétiques de type H3K9me3 suite à la déplétion de Cnot1 ou de celle de Tasor induite par Vpx. Nous nous demanderons si Cnot1 lie le transgène viral de la même façon que Tasor. Nous analyserons si les deux protéines répriment des cibles cellulaires communes. (iii) le rôle de Cnot1 au cours de la réplication du virus VIH-1. Nous analyserons dans quelle mesure la déplétion de Cnot1 affecte la réplication du virus complet. (iv) le rôle de Cnot1 sur l’infection virale dans les cellules primaires cibles du virus, lymphocytes T CD4+ et macrophages. (v) Enfin nous étudierons une interférence potentielle entre Cnot1 et les protéines lentivirales, à l’image de l’antagonisme de HUSH par la protéine virale Vpx du virus VIH-2.

Echéancier: Nous prévoyons d’aborder l’ensemble des propositions dès la première année.

Résultats attendus: Nous espérons montrer que Cnot1 représente un nouveau bloc cellulaire agissant contre HIV. S’il s’agit d’un bloc posttranscriptionnel, il pourrait être intéressant de le considérer dans les stratégies de réactivation du provirus, sachant que ce type de bloc pourrait contrecarrer l’activité des agents classiques de réversion de latence. Nous espérons démontrer que Cnot1 agit aussi à un niveau épigénétique/transcriptionnel en interaction avec Tasor. La démonstration de l’existence d’une « connection Cnot1 » entre épigénétique et destin des ARN serait très intéressante car peu de données existent sur ce sujet.

Les infections sexuellement transmissibles (IST) se produisent majoritairement au niveau des muqueuses du tractus reproducteur féminin (TRF), et sont principalement véhiculées par le sperme. De nombreux facteurs de l’environnement du TRF détermine la susceptibilité aux IST, de manière directe ou indirecte, par exemple en modulant l’inflammation. Ainsi, le liquide séminal (LS), la fraction acellulaire du sperme, déclenche une réponse inflammatoire dans le TRF qui faciliterait la transmission du VIH-1, en induisant l’expression de cytokines pro-inflammatoires et le recrutement de neutrophiles, puis de cellules cibles du VIH-1. De même, l’infection par Chlamydia trachomatis (CT), l’IST prédominante chez les jeunes femmes, est responsable d’une inflammation qui entraine une susceptibilité accrue à l’infection VIH-1. Cependant, le rôle de l’inflammation au niveau du TRF reste à préciser dans le cadre de co-infections. En particulier, les phénotypes et les fonctions des neutrophiles au niveau des muqueuses sont jusqu’à présent très peu étudiés, notamment dans l’infection VIH-1 et encore moins au cours des co-infections CT/VIH-1 dans un contexte physiologique d’exposition du TRF à du liquide séminal. Etant donné la mise en évidence récente de nouvelles fonctions des neutrophiles, il est important de comprendre leur rôle dans ce cadre.

L’objectif de ce projet est d’étudier l’impact du LS et de CT sur l’inflammation au niveau des muqueuses du TRF, en analysant les populations de neutrophiles et les profils de cytokines au niveau du TRF, et les conséquences de ces modifications sur la susceptibilité à la co-infection par le VIH-1 et les réponses immunitaires associées. Nous postulons que, dans un contexte physiologique en présence de LS, CT joue un rôle dans la co-infection VIH-1 en modifiant le phénotype et les fonctions des neutrophiles ainsi que l’état inflammatoire de la muqueuse cervico-vaginale.

Deux approches complémentaires seront développées : un modèle in vitro (Année 1) et un modèle in vivo (Années 2 et 3). Ces modèles sont déjà en place dans l’équipe. In vitro, des cellules épithéliales endocervicales seront infectées ou non par CT et exposées ou non à du LS. Les surnageants (SN) des différentes conditions seront récupérés et caractérisés (profil cytokinique et peptides anti-microbiens) puis testés pour leur impact sur l’infection VIH-1. Des PBMC ou des cellules isolées du TRF seront préincubées avec ces SN puis exposées au VIH-1. L’infection VIH-1 sera suivie au cours du temps et comparée dans les différentes conditions. En parallèle, nous étudierons l’impact des SN sur le phénotype et les fonctions (survie, phagocytose, production de ROS et de cytokines) de neutrophiles humains isolés du sang périphérique. Pour les expériences in vivo, des femelles macaques cynomolgus recevront 1 puis 4 doses de LS en intravaginal, puis, toujours en présence de LS, elles seront exposées (n=6, groupe 2) ou non (n=6, groupe 1) à une forte dose de CT. Ensuite, toutes les femelles seront exposées à une forte dose de SIV. A chaque étape, nous analyserons différents marqueurs de l’inflammation au cours du temps : populations de neutrophiles et profils de cytokines. Nous suivrons les infections CT et SIV ainsi que les réponses immunitaires innées et spécifiques anti-CT et anti-SIV en systémique et dans les différents compartiments muqueux du TRF dans les 2 groupes. Les résultats seront comparés entre les différentes conditions expérimentales.

L’ensemble de ces expériences permettra de déterminer les modifications de différents acteurs de l’inflammation au cours de la co-infection CT/VIH-1 dans un contexte prenant en compte la composante LS. Nous pourrons déterminer s’il y a des corrélations entre les profils de cytokines, le phénotype et la fonction des neutrophiles, l’établissement des co-infections CT/VIH-1 et les réponses immunitaires spécifiques associées.

L’ensemble de ces résultats ouvrira des pistes pour le développement de thérapies préventives contre l’acquisition des IST, notamment sur les stratégies pour y parvenir et sur les acteurs principaux à cibler : molécules anti-inflammatoires, thérapie visant les neutrophiles…

L’infection par le VIH-1 requière l’intégration du génome viral dans des conditions permettant une transcription optimale. Le site d’intégration, l’association du complexe d’intégration à l’ADN nucléosomal ainsi que l’environnement chromatinien entourant le site d’intégration vont définir le devenir du provirus et son état transcrit ou latent. Ces dernières années, de nombreuses observations suggèrent un lien entre le processus d’intégration et les machineries transcriptionnelles cellulaires. L’interaction entre le domaine carboxy-terminal (CTD) de l’intégrase (IN) et l’ARN génomique viral a été notamment décrite. Or, des mutations au niveau des résidus du CTD sujets à acétylation et impliqués dans cette interaction présentent des effets sur la transcription des gènes viraux intégrés et non sur l’intégration tout en affectant la stabilité et la présence de l’enzyme sur le site après intégration. De plus, l’interaction entre ces résidus du CTD de l’IN et l’élément ARN viral TAR influence l’interaction in vitro entre cet élément et la protéine virale TAT et, ainsi, pourrait affecter la transactivation des gènes viraux soulignant un lien direct entre l’IN et la transcription. Les multiples fonctions du CTD de l’IN suggèrent que ce domaine constituerait un pivot dans les processus intégratifs et post-intégratifs et participerait, notamment, à la transactivation des gènes viraux médiée par la protéine TAT.

Alors que les étapes pré-intégratives et intégratives sont bien documentées l’ensemble de ces évènements post-intégratifs n’est pas connu. Le devenir du complexe d’intégration après l’intégration, le mécanisme et la chronologie de sa dissociation du site et les facteurs de l’hôte impliqués restent inconnus. Notre projet visera à dévoiler l’ensemble de ces évènements post- intégratifs et mettre à jour le rôle pressenti de l’IN dans ces événements. L’objectif principal de notre projet sera donc de dévoiler les liens fonctionnels existant entre intégration et transcription et, en particulier, le rôle du domaine CTD de l’IN en définissant comment l’intégration peut influencer la transcription des gènes viraux intégrés et comment la machinerie transcriptionnelle rencontrée par le complexe d’intégration sur le site d’insertion peut moduler le processus d’intégration. Nous répondrons aux questions suivantes : i) l’IN influence-t-elle la transcription des gènes intégrés, ii) la machinerie transcriptionnelle est-elle requise pour une bonne intégration ou une bonne réparation du site et notamment est-ce que l’ARN TAR transcrit sur le site est impliqué dans la dissociation du complexe post-intégratif, iii) quels sont les facteurs associés spécifiquement au complexe post-intégratif dans les régions transcriptionnelles ciblées par le VIH-1, iv) comment interférer avec ces évènements post-intégratifs impliquant l’IN et les ARN en identifiant les premiers composés chimiques ciblant ces phases précoces post intégratives.

Les données préliminaires obtenus dans notre équipe consolident fortement l’hypothèse d’implication des ARN et de TAR dans les étapes de désassemblage post-intégratives aboutissant à la libération du site. Les mécanismes moléculaires impliqués, le rôle de l’acétylation dans la régulation de ce processus, la démonstration de ce mécanisme dans un contexte cellulaire et l’identification des possibles autres partenaires cellulaires requis dans ce processus constitue les objectifs de notre projet. Pour cela nous i) confirmerons l’importance des processus de transcription pour l’intégration du VIH-1, ii) étudierons le processus moléculaire de dissociation du complexe d’intégration par les ARN et TAR par des approches biochimiques et biophysiques, iii) identifierons les facteurs cellulaires associés à la machinerie transcriptionnelle qui pourraient interagir avec le complexe post-intégratif et iv) sélectionnerons les premiers composés ciblant les phases post-intégratives impliquant l’IN et l’ARN.

La tuberculose (TB) est l’une des principales causes de décès dans le monde, causée par la bactérie Mycobacterium tuberculosis (Mtb). La compréhension des interactions hôte-pathogène dans la TB aidera à développer de nouvelles thérapeutiques, y compris dirigée contre l’hôte pour lutter contre la résistance aux antimicrobiens. Cependant, ni les cultures cellulaires conventionnelles ni les modèles animaux ne reproduisent la complexité de la TB. Les organoïdes pulmonaires partagent les caractéristiques des poumons humains, constituant ainsi un modèle unique pour étudier les étapes précoces de la TB. L’objectif du projet, initié il y a trois ans et déjà couronné de succès avec deux articles soumis, est d’adapter la technologie des organoïdes avéolaires dans le contexte de la TB pour déchiffrer les mécanismes moléculaires et cellulaires impliqués dans la translocation de Mtb dans le tissu pulmonaire. Ce modèle sera extensible au criblage de nouvelles molécules pharmacologiques.