Projets et candidats lauréats

Introduction : Les infections sexuellement transmissibles (IST) sont un facteur de risque pour l'acquisition du virus de l'immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1). Le virus de l'herpès simplex de type 2 (VHS-2) y contribue le plus, tandis que le rôle du VHS-1 transmis sexuellement reste largement inexploré. Les VHS-1/2 infectent principalement les cellules épithéliales lors de la partie infectieuses lytique du cycle virale. Ces virus atteignent ensuite les neurones périphériques sensoriels transmettant la douleur, appelés nocicepteurs, et y établissent une latence à vie. Lors de leur transmission sexuelle, le VHS-1/2 et le VIH-1 ciblent également les cellules de Langerhans (CL), cellules présentatrices d'antigènes des muqueuses. En étudiant les interactions neuro-immunes dans les muqueuses pendant les infections virales, nous avons montré que le neuropeptide « calcitonin gene-related peptide » (CGRP) qui est sécrété par les nocicepteurs innervant tous les épithéliums génitaux inhibe l’infection des CL par le VIH-1 et le VHS-1/2.

Résultats obtenus : Les modèles expérimentaux actuels des muqueuses ne parviennent pas à reproduire complètement le réseau tissulaire neuro-immunitaire. Par conséquent, grâce à un financement antérieur de l'ANRS, nous avons développé un modèle microfluidique de "muqueuse sur puce", intégrant des nocicepteurs murins CGRP+ avec des lignées de cellules épithéliales génitales humaines et/ou des CL et nous avons constaté que : i) les CL induisent la croissance axonale des nocicepteurs ; ii) les CL infectées par le VHS-2 relaient le virus aux axones des nocicepteurs ; iii) le VHS-2 induit une dégénérescence axonale accompagnée d'une réduction de la teneur en CGRP. Nous avons également constaté que le VHS-1/2 augmente l'infection des CL par le VIH-1 in vitro et que le CGRP inhibe le VIH-1 dans de tels contextes de co-infection.

Hypothèse de travail : Nous supposons que le mécanisme par lequel la co-infection du VIH-1 avec le VHS-1/2 augmente l'acquisition du VIH-1 implique une réduction de la sécrétion de CGRP dans les muqueuses par le VHS-1/2, contrecarrant ainsi les actions protectrices anti-VIH-1 du CGRP.

Objectifs et objectifs spécifiques (WPs) : Notre objectif est d'explorer les rôles antiviraux du CGRP pendant la co-infection VHS-1/2 et VIH-1 dans un contexte de muqueuse neuro-immune et de démontrer que la réduction du CGRP médiée par VHS-1/2 facilite le transfert du VIH-1 des CL aux cellules T CD4+. Nos objectifs spécifiques sont les suivants : WP1) améliorer le modèle de "muqueuse sur puce" en intégrant des nocicepteurs humains et des cellules épithéliales génitales primaires ; WP2) déterminer les effets des CL et/ou du VHS-1/2 sur la croissance et la dégénérescence axonales des nocicepteurs et suivre le relais et l'établissement de la latence du VHS-1/2 associé aux CL ; WP3) étudier la capacité du VHS-1/2 lytique/latent à réduire le CGRP dans les nocicepteurs, facilitant ainsi le transfert du VIH-1 des CL vers les cellules T CD4+.

Importance : Ces expériences devraient permettre de montrer que les VHS-1/2 contrecarrent un mécanisme neuro-immunitaire antiviral endogène impliquant la CGRP, ce qui favorise l'acquisition du VIH-1. Ces études apporteront de nouvelles informations sur la contribution du VHS-1 transmis sexuellement à la co-infection génitale et révéleront des similitudes et des différences entre le VHS-2 et le VHS-1. De plus, nos études identifieront un mécanisme potentiel expliquant comment VHS-1/2 atteint les nocicepteurs, via un relais direct médié par les CL vers les nocicepteurs et/ou le maintien du réseau épidermique de nocicepteurs, soulignant le rôle crucial et méconnu des CL dans la promotion de l'établissement de la latence de VHS-1/2. Enfin, nous proposons que la dérégulation de la sécrétion de CGRP médiée par le VHS-1/2 puisse être contournée par l'utilisation de formulations topiques à base de CGRP. Cette approche neuro-immune alternative offre une stratégie originale et potentiellement avantageuse de prévention de la co-infection. 

La blennorragie ou gonorrhée est une infection sexuellement transmissible qui touche les femmes et les hommes. Elle est causée par la bactérie Neisseria gonorrhoeae ou « gonocoque ». L’incidence annuelle mondiale de cette infection est estimée à 86,9 millions d’adultes et une récente augmentation des cas, supérieure à 200 %, a été signalée dans l’Union européenne. N. gonorrhoeae infecte les sites urogénitaux, rectaux et/ou pharyngés. Les infections non traitées peuvent être responsables de graves complications, allant de l’épididymite et de la salpingite à la maladie inflammatoire pelvienne, à la grossesse extra-utérine et à la stérilité. En l’absence d’un vaccin contre le gonocoque, la gestion et le contrôle des infections reposent sur un traitement antimicrobien efficace, abordable et accessible, soutenu par une gestion clinique adéquate. Malheureusement, N. gonorrhoeae pose aujourd’hui un grave problème de santé publique puisqu’il est devenu hautement résistant à tous les antimicrobiens recommandés. Par conséquent, il est essentiel de réaliser des efforts concentrés sur la recherche sur ce germe afin de trouver de nouvelles stratégies thérapeutiques à cette infection.  

Jusqu’à présent, les chercheurs ont utilisé différents types de cellules eucaryotes et d’explants cellulaires pour étudier l’interaction de N. gonorrhoeae avec son hôte. Cependant, ces modèles ne reproduisent pas les conditions environnementales rencontrées par la bactérie in vivo, ce qui a probablement limité la compréhension complète de sa pathogénie. Aujourd’hui, les progrès dans la transcriptomique et la métabolomique ont révélé l’importance des conditions de culture et de croissance sur la physiologie bactérienne. In vitro, ces conditions ont un impact direct sur l’expression des gènes et sur le métabolisme et par voie de conséquence sur la croissance, la colonisation, la formation de biofilm et l’expression de bactériophages tempérés filamenteux. Par conséquent, nous pensons que le développement de modèles mimant au mieux les conditions in vivo sera bénéfique à une meilleure compréhension de la pathogénie des gonocoques ainsi qu’à la caractérisation de souches cliniques.

Dans ce « contrat d’initiation » d’un an, nous proposons de mettre en place de nouveaux modèles basés sur un fluide vaginal synthétique pour évaluer l’interaction de N. gonorrhoeae avec les cellules épithéliales et mieux mimer la niche vaginale normale. Ces modèles seront basés sur des précédentes études décrivant ce fluide vaginal synthétique. Nous mettrons en place deux modèles : un modèle de croissance planctonique et analyse du biofilm et un modèle d’interaction avec les cellules hôtes. Pour le premier modèle, nous préparerons un fluide vaginal synthétique modifié qui permettra la croissance bactérienne. Pour l’interaction avec les cellules hôtes, nous travaillerons dans des conditions de culture air-liquide, modèle qui a été développé pour les épithéliums pulmonaire et intestinal. Ce modèle permet l’étude de cellules recouvertes par une fine couche protectrice de mucus, comme c’est le cas chez l’hôte.

Pour mieux comprendre l’interaction de N. gonorrhoeae avec les cellules de l’hôte, ces modèles seront caractérisés en termes de croissance planctonique, de formation de biofilm, d’expression des bactériophages, de réponse des cellules épithéliales et nous mènerons une approche RNAseq, à la fois sur les bactéries et les cellules.

Ce projet, au-delà du développement de modèles innovants pour étudier la pathogénicité de N. gonorrhoeae, est l’occasion de mettre en place un programme de recherche fondamentale sur un pathogène peu étudié par les universitaires français. Nous pensons donc que, dans un contexte de compétition internationale et de résistance aux antibiotiques, ce projet nous permettra non seulement de développer de nouveaux modèles mais aussi de mettre en place de nouvelles collaborations avec des cliniciens et donc de nouvelles possibilités d’évaluer et d’étudier la virulence de N. gonorrhoeae.

Le rôle du microbiote intestinal dans la réplication, la transmission et la pathogénèse des virus est de plus en plus reconnu. Des études montrent que le microbiote facilite la prolifération et la propagation des virus par divers mécanismes. Par exemple, le norovirus humain se lie aux bactéries via les glycannes des antigènes des groupes sanguins, tandis que le poliovirus s'attache à des composants comme le lipopolysaccharide et le peptidoglycane. Ces interactions ne se limitent pas aux virus entériques. Des rétrovirus tels que le MMTV dépendent du microbiote intestinal pour leur dissémination, et des recherches récentes suggèrent que le microbiote influence l'initiation de l'infection par le virus Epstein-Barr (EBV), la progression des tumeurs induites par l'EBV, et renforce l'acquisition et la réplication du VIH dans les tissus mucosaux. Ces découvertes soulignent comment les bactéries aident les virus à échapper à la détection immunitaire et à maintenir leur persistance dans l'hôte.

Les surfaces muqueuses sont des sites clés pour l'acquisition du VIH, car elles servent de zones primaires de réplication virale, de déplétion des cellules T CD4+ et d'inflammation. Ces surfaces abritent une population bactérienne dense qui influence le succès des infections virales. Les bactéries peuvent exister librement ou au sein de biofilms, qui sont des communautés encapsulées dans une matrice extracellulaire composée de polysaccharides, de protéines, d'ADN, d'ARN et parfois de lipides.

Notre équipe de recherche se concentre sur les dynamiques entre le VIH-1 et les bactéries. Un axe majeur de notre étude est d'explorer comment le VIH interagit avec les bactéries dès la phase de transmission. La transmission du VIH-1 se produit à travers les surfaces muqueuses, notamment lors des rapports sexuels, où le virus rencontre diverses bactéries dans les régions intestinales et vaginales. Inspirés par des recherches sur les virus entériques, nous proposons que le VIH-1 pourrait utiliser des mécanismes similaires pour améliorer sa transmission. Cette hypothèse constitue la base de notre projet, qui vise à déterminer si le VIH et les bactéries mettent en place des stratégies mutualistes pour favoriser la transmission du VIH.

Nos données préliminaires suggèrent que le VIH-1 interagit avec les bactéries, notamment par la liaison des particules virales infectieuses à la matrice extracellulaire bactérienne. Nous avons pour objectif de caractériser plus en détail cette interaction, d’identifier les composants viraux et bactériens responsables de cette liaison, et de comprendre comment cela pourrait favoriser la transmission du virus. Pour répondre à ces questions, nous utiliserons différentes approches et validerons nos résultats dans un modèle expérimental pertinent, le modèle de culture d'agrégats de la lamina propria (LPAC), grâce à notre collaboration avec les laboratoires de C.C. Wilson et M. Santiago à l'Université du Colorado.

Ce projet vise à approfondir notre compréhension des interactions entre le VIH et les bactéries, et à révéler de nouvelles voies potentielles de transmission du VIH. À long terme, ces connaissances pourraient ouvrir la voie à de nouvelles cibles thérapeutiques pour perturber ces interactions et possiblement réduire la transmission du VIH.

Le complexe ribonucléoprotéique 7SK (7SKsnRNP) composé du petit ARN nucléaire non-codant 7SK et de protéines nucléaires, régule l’activité du facteur positif d’élongation de la transcription (P-TEFb), hétérodimère constitué d’une cycline T et de la kinase cycline-dépendante CDK9. P-TEFb est essentiel pour la transcription des ARN messagers par l’ARN polymérase chez les eucaryotes. L’assemblage 7SKsnRNP capture P-TEFb, inhibant ainsi son activité kinase indispensable à la levée des pauses de la transcription par l’ARN polymérase II (ARNpol II). Lorsque P-TEFb est libéré du complexe 7SKsnRNP, CDK9 phosphoryle le domaine C-terminal de l’ARNpol II ainsi que les répresseurs de transcription NELF et DSIF, restaurant ainsi la transcription par l’ARNpol II.

P-TEFb est un facteur cellulaire indispensable pour la régulation de la réplication du virus de l’immunodéficience humaine (VIH). Il joue un rôle essentiel dans l’initiation de la transcription chez le VIH-1. P-TEFb est recruté par la protéine virale Tat qui interagit avec la cycline T1 via son domaine d’activation, tandis que son domaine de liaison à l’ARN s’associe à l’ARN TAR (« trans-activating responsive ») localisé dans la région 5’ non traduite du génome viral. Des études biochimiques révèlent également que P-TEFb peut être présent dans trois complexes distincts. Le premier complexe est composé de P-TEFb et de la protéine Brd4 qui contient deux bromo-domaines se liant aux résidus lysines acétylés dans la chromatine. P-TEFb a également été trouvé associé au « Super Complexe d’Elongation » (SEC). Le troisième complexe contient P-TEFb et l’assemblage 7SKsnRNP. Tat peut capturer P-TEFb dans chacun de ces complexes.

Le complexe 7SKsnRNP contient trois protéines nucléaires dont HEXIM1 avec laquelle P-TEFb interagit de manière réversible. Tat est capable de déplacer la protéine HEXIM1 de l’ARN 7SK, provoquant ainsi la libération de P-TEFb. L’ARN 7SK régule ainsi indirectement la transcription de l’ARN du VIH en contrôlant la disponibilité de P-TEFb.

Dans le cadre du projet présenté, nous nous intéressons tout particulièrement au mécanisme fin d’interaction de l’ARN non codant 7SK avec Tat et HEXIM1. Ces deux protéines contiennent des motifs de liaison à l’ARN similaires (ARM : « Arginine Rich Motif »). Elles ciblent la même région de l’ARN 7SK mais avec des mécanismes d’interaction différents. Ceci est particulièrement intrigant : comment deux protéines comportant des domaines de liaison à l’ARN aussi similaires, peuvent-elles cibler le même ARN de manières distinctes ?

Afin de mieux comprendre les facteurs régissant ces interactions, nous proposons d’étudier les interactions HEXIM1/7SK et Tat/7SK en combinant des méthodes biophysiques et biochimiques. Nos objectifs sont de: (i) mesurer des données cinétiques et thermodynamiques pour comparer les interactions de 7SK avec Tat et HEXIM1 ; (ii) mesurer des données cinétiques et thermodynamiques du déplacement de HEXIM1 par Tat, (iii) analyser les changements conformationnels globaux de 7SK sous l’effet de l’interaction avec ses deux partenaires protéiques et (iv) élucider les structures des complexes par Cristallographie. Pour réaliser les mesures cinétiques et thermodynamiques, nous utiliserons la technologie « switchSENSE », ainsi que la titration calorimétrique isotherme (ITC). L’ITC est une technique utilisée pour mesurer les paramètres d’affinité (KD), et thermodynamiques d’interaction entre biomolécules (enthalpie et entropie), ainsi que la stoechiométrie (n). La technique « switchSENSE », nouvelle en France, permet l’analyse d’interactions entre molécules en temps réel et d’accéder à la mesure de constantes cinétiques d’association (kon), de dissociation (koff) et de la constante d’affinité KD, donc complémentaire de l’ITC. L’utilisation combinée de ces méthodes peut fournir une vue détaillée du mécanisme d’interaction entre biomolécules et ainsi, des données fondamentales sur la régulation l’activité de P-TEFb par l’ARN 7SK.

Une meilleure compréhension des facteurs régissant les interactions entre l’ARN 7SK et ses partenaires pourrait contribuer à obtenir des informations supplémentaires sur la réplication du VIH.