Projets et candidats lauréats

En 2021, la tuberculose demeure la principale cause de décès, d’origine bactérienne, à l’échelle mondiale. La difficulté à éradiquer la maladie est liée à trois facteurs principaux : la faible efficacité du vaccin BCG, la co-infection avec le virus de l’immunodéficience humaine et l’apparition croissante de souches multi-résistantes aux antibiotiques. En outre, la pandémie de Covid-19 a fortement aggravé la situation en déstabilisant les efforts de lutte contre la tuberculose. Par conséquent, le développement de thérapies innovantes, notamment celles dirigées par l’hôte, reste une priorité majeure. Avant tout, de telles avancées exigent une meilleure compréhension des interactions moléculaires entre l’agent étiologique, Mycobacterium tuberculosis (Mtb), et son hôte.

Mtb est un pathogène intracellulaire qui se multiplie dans l’environnement hostile des macrophages. Au départ, présent dans une vacuole appelée phagosome, Mtb peut ensuite accéder au cytosol du macrophage après avoir endommagé la membrane phagosomale. L’entrée de Mtb, ou ses facteurs, dans le cytosol entraîne la modulation de plusieurs réponses immunitaires innées, notamment la production de cytokines, l’autophagie et la mort cellulaire. A ce jour, les facteurs connus sont essentiellement des protéines et des acides nucléiques qui interagissent avec des protéines cytosoliques afin de moduler les fonctions du macrophage. Etonnamment, le rôle des lipides de Mtb dans ce processus a été largement inexploré. Pourtant, Mtb produit de nombreux lipides, de structure diverses, ayant d’importantes propriétés immunomodulatrices. Pour ce faire, ils interagissent avec des protéines présentes à la surface ou dans la voie endocytique des cellules de l’hôte. Ainsi, nous émettons l’hypothèse que les lipides de Mtb pourraient aussi se lier à des protéines cytosoliques afin de déclencher ou de détourner les réponses du macrophage.

L’objectif de ce projet « Contrat d’Initiation » est d’identifier les protéines cytosoliques des macrophages qui interagissent avec deux glycolipides majeurs, présents à la surface de Mtb, le tréhalose dimycolate (TDM) et le lipoarabinomannane mannosylé (ManLAM). Les objectifs spécifiques sont les suivants :

1. Identifier les protéines cytosoliques qui se lient, in vitro, au TDM et au ManLAM purifiés (Mois 1-2). Dans un premier temps, nous réaliserons des expériences de « pull-down » avec des billes recouvertes de ces lipides et un extrait cytosolique de macrophage. Les protéines associées aux billes seront identifiées grâce à une analyse protéomique. Un maximum de six protéines avec un domaine liant les lipides ou les sucres seront sélectionnées pour les objectifs 2 et 3.
2. Valider la liaison directe avec des protéines recombinantes (Mois 2-5). Dans un second temps, nous mesurerons la liaison de la protéine recombinante, étiquetée, avec le lipide purifié en utilisant un essai de type ELISA, et ensuite la liaison avec Mtb par Westernblot.
3. Evaluer le recrutement des protéines candidates dans les macrophages (Mois 5-12). Enfin, nous quantifierons la colocalisation de la protéine d’intérêt avec les phagosomes endommagés contenant soit une bille recouverte du lipide de Mtb, soit la bactérie entière, dans les macrophages, par microscopie de fluorescence confocale.

Dans son ensemble, le projet CyTuLip permettra de faire la preuve de concept que les lipides immunomodulateurs de Mtb peuvent aussi interagir avec des protéines cytosoliques, in vitro et dans les macrophages. Ces résultats seront le point de départ d’un projet de recherche beaucoup plus vaste dédié à l’étude de ces nouvelles interactions, à la fois leurs bases moléculaires et leurs rôles dans l’infection à Mtb. In fine, ces travaux pourraient aboutir à la découverte de nouvelles cibles thérapeutiques potentielles pour la lutte contre la tuberculose.

La tuberculose (TB) est un problème de santé mondial majeur, avec environ 10 millions de nouveaux cas signalés chaque année. Bien que la TB soit largement reconnue pour son impact sur les poumons, de nouvelles preuves suggèrent que la TB pulmonaire peut également avoir des effets significatifs sur le cerveau, même en l'absence d'infection directe du système nerveux central. Ce phénomène a été associé à des déficits cognitifs persistants chez les patients atteints de TB, et des données récentes indiquent un risque accru de démence chez les survivants de la tuberculose.

En combinant des techniques expérimentales avancées et une approche interdisciplinaire intégrant l'analyse neurocomportementale et l'immunologie, le projet TB-BRAIN vise à étudier les impacts neurologiques à long terme de la TB. Plus précisément, dans un modèle murin de TB pulmonaire, il s'agira de (1) déchiffrer l'étendue et la nature de la neuroinflammation au cours de la maladie; (2) évaluer l'intégrité et la fonction de la barrière hémato-encéphalique ; (3) étudier l'impact de la TB pulmonaire sur le vieillissement du cerveau ; et (4) examiner la fonction cognitive des souris infectées par Mycobacterium tuberculosis (Mtb).

 Le projet TB-BRAIN vise à combler les lacunes dans la compréhension des conséquences neurologiques à long terme de la TB pulmonaire. En élucidant les relations entre l'inflammation systémique, la perturbation de la barrière hémato-encéphalique et le déclin cognitif, cette étude cherchera à faire progresser les connaissances sur les impacts plus larges de la TB et les stratégies potentielles pour atténuer ses effets sur la santé du cerveau. Elle contribuera également à une meilleure compréhension de la manière dont les infections peuvent influencer les maladies neurodégénératives.

Mycobacterium tuberculosis (Mtb) expose à la surface de son enveloppe une grande diversité de MAMPs (Motifs Moléculaires Associés aux Microbes), reconnus par les récepteurs du système immunitaire inné (PRRs), notamment les lectines de type C. L’interaction MAMPs/PRRs conduit à la phagocytose des bacilles et/ou l’activation de voies de signalisation intracellulaires qui contribuent, selon les cas, à la mise en place d’une réponse immunitaire protectrice ou à la persistance des bacilles. Il s’agit donc d’un étape clef du processus infectieux. De nombreux travaux ont porté sur l’élucidation des bases moléculaires de la reconnaissance des ligands, sous forme isolée, par les PRRs, mais peu de choses sont connues sur la distribution des MAMPs à la surface des bacilles, et comment cette dernière impacte la liaison aux PRRs. Or, il apparait de plus en plus évident que la distribution spatiale des molécules à la surface des enveloppes bactériennes est hétérogène et dynamique.

Ainsi, nous avons montré récemment par l’utilisation de techniques d’imagerie moléculaire que l’organisation des MAMPs en nanodomaines est cruciale pour la reconnaissance sélective des espèces du complexe Mycobacterium tuberculosis (MtbC) par la lectine de type C DC-SIGN. En effet, bien que ces MAMPs soient également exprimés en surface des espèces n’appartenant pas au complexe tuberculosis (non-MtbC), ces dernières ne sont pas reconnues par la lectine. En étudiant deux espèces représentatives, nous avons observé que la densité des MAMPs et la taille des nanodomaines (> 0.02 µm² dans 90% des cas) est nettement supérieure pour l’espèce MtbC, favorisant ainsi une liaison efficace de DC-SIGN, et induisant un recrutement local de la lectine (phénomène de « clustering ») venant renforcer la force de l’interaction. Forts de cette observation, nous avons également mis en évidence des nanodomaines fonctionnels pour la reconnaissance par les lectines Mincle et Dectine-2, impliquées dans la réponse immunitaire à Mtb.

Sur la base de ces données, le projet MtFunDom a pour objectif de caractériser en détails les nanodomaines fonctionnels présents à la surface de l’enveloppe de Mtb, et impliqués dans la reconnaissance par les lectines de type C. Plus précisément, nous souhaitons définir la composition de ces nanodomaines, identifier les déterminants de leur formation et évaluer leur influence sur l’interaction des bacilles avec les récepteurs à la surface des cellules immunitaires. Pour ce faire, nous utiliserons des techniques d’imagerie moléculaire de pointe, avec une résolution de l’ordre de 20 nm, pour i) cartographier la distribution et ii) caractériser la dynamique des ligands de différentes lectines de type C (DC-SIGN, Mincle, Dectine-1, Dectine-2) à la surface de différentes espèces mycobactériennes (Mtb, espèces non-Mtb à croissance lente ou rapide) et de diverses souches mutantes spécialement construites.

Le projet MtFunDom devrait conduire à une meilleure compréhension des interactions moléculaires hôte/pathogène mises en jeu à l’interface bactérie/cellule immunitaire, permettant d’envisager à plus long terme le développement rationnel d’approches antituberculeuses basées sur l’immunomodulation.

Aujourd’hui l’immense majorité des patients infectés par le VIH bénéficient d’un traitement permettant le contrôle de la réplication virale. Malheureusement, si les traitements antirétroviraux réduisent la mortalité et améliorent la qualité de vie des patients infectés, ils ne permettent pas de normaliser une activation excessive non spécifique du système immunitaire. Cette activation chronique du système immunitaire est considérée comme déterminante dans l’immuno-pathologie du VIH.

D’autres éléments physiopathologiques sont à prendre en compte aujourd’hui dans le suivi des patients infectés et traités, notamment l’existence de comorbidités souvent inflammatoires : athéroscléroses, maladies cardiovasculaires, maladies rénales, troubles cognitifs, ostéoporose, et même des cancers. Indépendamment de l’infection par le VIH, dans toutes ces pathologies ainsi que dans l’activation immune il existe un point commun : une association avec l’existence de microparticules (MPs) circulantes.

Notre groupe d’étude, composé de 5 équipes, propose que lors d’une infection par le VIH et contrôlée, les MPs jouent un rôle majeur dans les pathologies que rencontrent les patients infectés. L’étude des caractéristiques phénotypiques et fonctionnelles de ces MPs aura un impact au-delà de l’infection par le VIH puisque des pathologies similaires peuvent être présentes dans d’autres infections.

Lors d’une étude préliminaire, nous avons comparé le phénotype des MPs de patients infectés traités à celui de donneurs sains. Nous montrons que les MPs plasmatiques présentes chez ces patients ont bien un profil d’activation particulier, notamment les MPs plaquettaires (PMPs), monocytaires (MMPs) ainsi que les MPs issues de lymphocytes T (LMPs). Ce projet de recherche propose un protocole expérimental visant donc à caractériser ces MPs (PMPs, MMPs, et LMPs) sur la base de leurs protéines membranaires et de leur contenu (cytokines, ARN et organelles). Ces MPS seront purifiées et leur fonctionnalité sera testée in vitro sur l’activation immune (lymphocytes T CD4+, T CD8+, et lymphocytes B) et l’inflammation (plaquettes et endothélium vasculaire). Les patients étudiés seront tous issus de la cohorte d’étude des comorbidités nommée CARDAMONE qui comporte 241 patients infectés par le VIH sous traitement efficace et qui ont bénéficiés d’un bilan clinique complet afin d’étudier précisément ces maladies non apparentées au SIDA. Cette cohorte a permis d’obtenir une cartographie bidimensionnelle des patients avec des regroupements de patients ayant des caractéristiques inflammatoires similaires. Ainsi 4 groupes de patients ont été identifiés et seront utilisés pour ce projet.

Les innovations mises en place et déjà publiées par ce groupe de recherche devraient permettre de comprendre le rôle exact de ces MPs dans l’activation immune ou liée aux comorbidités du VIH mais aussi en dehors du cadre infectieux. En effet, ces résultats permettront de proposer de nouvelles immunothérapies en ciblant ou en utilisant des MPs et permettre ainsi d’améliorer notamment des réponses immunitaires spécifiques et vaccinales.

La plupart des virus à ARN enveloppés exploitent la machinerie cellulaire ESCRT-III (endosomal sorting complexes required for transport) pour la dernière étape de leur cycle de multiplication, le bourgeonnement. Néanmoins, les virus enveloppés utilisent seulement les protéines CHMP2, CHMP3 et CHMP4 et l'ATPase VPS4. Étant donné que cette machinerie est essentielle pour les événements cellulaires de coupure de membrane, cela limite la possibilité d'acquérir des mutations qui l'inhibent. Cependant, de nombreuses espèces ont évolué pour conserver des duplications mutées de CHMP3 (appelées rétroCHMP3), qui préservent les fonctions cellulaires de l'ESCRT mais agissent comme des inhibiteurs du bourgeonnement viral à large spectre

In vitro, les protéines ESCRT-III ont la propriété de s’auto-assembler sur les membranes plasmiques en formant des filaments de composition variable, présentant également une diversité de formes : les CHMP4 forment des filaments en spirales plates et lâches, alors que les CHMP2A-CHMP3 s'assemblent en hélices compactes. Cependant, il reste encore à déterminer la composition des fibres aux sites de bourgeonnement du VIH-1 en particulier, on ne sait pas si ce sont des spirales de CHMP4B ou des polymères hélicoïdaux de CHMP2A/CHMP3 comme ceux observés in vitro. De plus, il n'est pas encore clair si ces filaments sont échangés ou s'ils sont successivement recrutés et désassemblé lors de la fission membranaire. En fin de compte, la distribution spatiale des filaments ESCRT-III et les transitions entre chaque fibre le long du col de bourgeonnement restent des sujets controversés.

La compréhension de la dynamique et de l'architecture du complexe ESCRT-III natif aux sites de bourgeonnement du VIH-1 est limitée en raison de la résolution spatiale et du recrutement transitoire des ESCRT-III. Nous proposons d'utiliser les ciseaux moléculaires pour marquer les protéines ESCRT-III par des protéines fluorescentes de différentes couleurs à leur loci chromosomiques. Nous utiliserons l'imagerie cellulaire « Total Internal Reflection Fluorescence » (TIRF) à haute résolution temporelle pour établir la cinétique de leur échange, assemblage et désassemblage lors du bourgeonnement. Pour obtenir une résolution spatiale suffisante, nous tirerons parti des récentes améliorations de la Single Molecule Localization Microscopy (SMLM) telle que les améliorations récentes de Points Accumulation for Imaging Nanoscale Topography (PAINT). De plus, nous utiliserons des techniques de microscopie électronique à cryogénie. Ces technologies de pointe promettent de fournir des images cellulaires de haute résolution des protéines ESCRT-III, dans le but d'élucider la cinétique, l'arrangement spatial, l'organisation structurelle et l'interaction de chaque filament.

Ces approches seront appliquées à divers mutants connus pour bloquer le bourgeonnement à différentes étapes, notamment des mutants de VPS4, des dominant négatifs des ESCRT-III et les mutants rétroCHMP3. Cela nous permettra de déterminer le rôle de CHMP4B, CHMP2A, CHMP3 et VPS4. De plus, l'inclusion des protéines rétroCHMP3 enrichira notre compréhension des fonctions spécifiques de CHMP3 et nous fournira des éléments pour comprendre les mécanismes altérés par les retroCHMP3.

Dans le cadre du "contrat d'initiation", nous mettrons en place les modèles cellulaires pour l'imagerie cellulaire. Nous fournirons les premières preuves de concept afin d'atteindre les objectifs décrits ci-dessus. L'utilisation de techniques d'imagerie avancées telles que la TIRF, la SMLM et la cryo microscopie électronique aidera à explorer l'organisation spatiale et la dynamique des filaments ESCRT-III, enrichissant notre compréhension de leur implication dans la fission membranaire lors du bourgeonnement viral. Cette recherche repoussera les limites technologiques de l'imagerie, contribuant à des progrès méthodologiques en biologie cellulaire. L'étude des variantes rétroCHMP3 révèlera comment ces protéines inhibent le bourgeonnement viral tout en préservant les fonctions cellulaires essentielles, offrant des pistes pour de nouveaux antiviraux moins toxiques.

Daxx est une protéine chaperonne, majoritairement nucléaire, impliquée dans de nombreux processus cellulaires, comme l’apoptose et la répression transcriptionnelle. Lors de travaux antérieurs, nous avons identifié cette protéine comme un facteur de restriction capable d’inhiber la réplication du VIH-1. Le mécanisme d’action de Daxx est particulièrement original, puisque l’infection par le VIH-1 provoque la translocation de Daxx du noyau vers le cytoplasme. De façon intrigante, d’autre rétrovirus non humains déclenchent aussi la translocation de Daxx, mais pas le virus de la grippe (un orthomyxovirus) ou le virus de la stomatite vésiculaire (un rhabdovirus). Récemment, nous avons démontré que l’infection par le SARS-CoV-2 induisait également la sortie de Daxx du noyau et que celui-ci inhibait alors la réplication du virus.

Dans le cas du VIH-1, nous avons démontré que c’est la rétro-transcription qui déclenche le signal induisant la translocation de Daxx, mais la nature de ce signal est cependant inconnue.

Une fois dans le cytoplasme, Daxx interagit, via son domaine de liaison à SUMO (SIM, pour « SUMO interacting motif) avec les capsides entrantes et recrute un complexe multi-protéique qui empêche leur décapsidation. Par ailleurs, nous avons des résultats préliminaires suggérant que Daxx est également incorporée dans les particules virales et inhibent leur réplication.

Toutes ces observations soulèvent de nombreuses questions sur le mécanisme de restriction virale médiée par la protéine Daxx et notamment sur les déterminants viraux et cellulaires qui déclenchent sa sortie du noyau et son encapsidation dans les particules virales. Notre projet de recherche vise à lever le voile sur ces zones d’ombre.

Nous étudierons donc tout d’abord la localisation subcellulaire de Daxx au cours de l’infection VIH-1, par une approche d’imagerie en temps réel, afin d’identifier quelle voie de signalisation déclenche la translocation de Daxx. Nous identifierons également les déterminants viraux permettant à Daxx d’être encapsidée dans les particules virales, ainsi que le mécanisme qui permet à Daxx d’interférer avec l’infectivité de ces particules. Ces aspects seront notamment évalués dans les principales cellules-cibles du VIH-1, afin de comparer l’expression de Daxx, sa propension à être encapsidée et les conséquences de son encapsidation sur la réplication virale. D’autres pistes de recherche seront également explorées. En particulier, étant donné que Daxx interagit avec la capside du VIH-1 via son domaine SIM et que nos résultats préliminaires font suspecter une interaction directe de Daxx avec la cyclophiline A (CyPA), nous étudierons si cette protéine cellulaire liée à la capside du virus, est SUMOylée. Enfin, nous évaluerons si le domaine D/E de Daxx est impliqué dans son activité anti-VIH. En effet, ce domaine a récemment été identifié comme étant capable de reconnaitre les protéines mal repliées et ainsi permettre à la protéine Daxx de restaurer leur conformation. Il est tentant d’imaginer que cette activité  » disaggregase » de Daxx pourrait être impliquée dans son activité antivirale.

Notre projet de recherche permettra de répondre à des questions cruciales relatives à l’activité antivirale de Daxx et de mieux comprendre les relations complexes que le virus entretient avec cette protéine cellulaire. Élucider le mécanisme d’action de Daxx constitue un important défi de la recherche sur les défenses antivirales, contre le VIH-1, mais également contre d’autres virus pathogènes.