Projets et candidats lauréats

Contexte, 
Malgré l’existence d’options thérapeutiques efficaces antirétrovirales (ARV) orales à prise unique quotidienne, les problématiques d’adhésion au traitement ARV persistent et sont responsables d’un non contrôle virologique dans environ 7% des personnes vivant avec le VIH (PVVIH) en France. Aujourd’hui, les traitements antirétroviraux injectables à longue durée d’action (ARV-LA) font l’objet d’un intérêt croissant et apparaissent comme une option thérapeutique intéressante chez ces PVVIH qui ont des difficultés de prise quotidienne d’ARV oral. En effet, les rares données disponible issues d’études rétrospectives retrouvent un taux de succès virologique variant de 75% à 94% sous bithérapie ARV-LA Cabotegravir + Rilpivirine (CAB+RPV) chez des patients virologiquement non contrôlés. De plus, l’utilisation du Lenacapavir (LEN), un inhibiteur spécifique de capside du VIH, chez des patients multirésistants en échec virologique a montré un taux de succès virologique de 82% à 2 ans. Ainsi l’utilisation des combinaisons ARV-LA Cabotegravir + Rilpivirine et Cabotegravir + Lenacapavir chez des patients virologiquement non contrôlés et inobservants aux ARV oral semble pertinente.

Méthode
L’essai CABAN est un essai prospectif interventionnel, multicentrique, en ouvert, non randomisé et non comparatif visant à évaluer l’efficacité virologique des bithérapies ARV-LA CAB 600 mg + RPV 900 mg (bras 1) et CAB 600 mg + LEN 927 mg (bras 2), sans phase orale préalable de CAB ou de RPV, chez des PVVIH virologiquement non contrôlés avec des difficultés d’observance au traitement ARV oral. Au total 60 patients devront être inclus et seront suivi pendant 44 semaines. En fonction de la présence d’une résistance à la RPV ou d’un antécédent d’échec virologique sous INNTI, les participant seront répartis dans les bras 1 ou 2. Un accompagnement ETP standardisé sera réalisé à chaque visite. 

Population de l’étude
PVVIH-1 ≥ 12 ans virologiquement non contrôlé (dernière CVp ≥ 200 cp/mL et antécédent d’échec virologique avec au moins une CVp ≥ 200 cp/mL réalisée ≥ 12 mois) malgré la prescription d’un traitement ARV depuis plus de 24 mois et rapportant des difficultés d’observance au traitement ARV par voie orale. Les participants co-infectés par le VHB (AgHbs positif), présentant une résistance au CAB ou un antécédent de traitement ARV par CAB et/ou RPV LA et/ou LEN seront exclus. 

Critères de jugement
Le critère de jugement principal est la proportion de participants avec CVp < 50 cp/mL sous bithérapie ARV-LA injectable à S44. 
L’échec virologique est défini par la non réponse au traitement (diminution de la CVp < 1 log cp/mL à un S4, ou la persistance d’une CVp ≥ 50 cp/ml à S20, ou une augmentation confirmée de la CVp ≥ 1 log de cp/mL par rapport au Nadir de la CVp) ou le rebond virologique après au moins une CVp < 50 cp/mL (une CVp ≥ 200 cp/mL, ou deux CVp successives ≥ 50 cp/mL à S2-S4 d’intervalle, ou une CVp ≥ 50 cp/mL suivie de l’arrêt du suivi).
Les critères de jugement secondaires sont les suivants : La proportion de patients ayant présentés un échec virologique, le délai d’obtention de l’indétectabilité, le profil de résistance en cas d’échec virologique, les effets indésirables, les arrêts de traitement et leur(s) motif(s), l’évolution des paramètres immunologiques, l’évolution des critères de vulnérabilité, de qualité de vie et de satisfaction liée aux traitements ARV-LA. Les évolutions du réservoir viral et des concentrations plasmatiques d’ARV seront également analysées. 

Enjeux de l’étude
L’essai CABAN cible une population prioritaire dans le contrôle de l’épidémie VIH. L’efficacité virologique des combinaisons ARV-LA évaluées dans l’essai CABAN permettrait de proposer une alternative thérapeutique pour ces PVVIH en situation d’échec virologique liée à une problématique d’adhésion au traitement ARV oral. 

Le virus de l’immunodéficience humaine (VIH) reste un problème de santé publique dans le monde entier malgré le développement d’antirétroviraux efficaces. Il est toujours mal compris comment l’infection par le VIH persiste toute la vie de son hôte. Plusieurs réservoirs viraux ont pu être identifiés mais les atteindre reste un challenge. Les macrophages représentent l’un des réservoirs principaux du VIH car ce sont des cellules cibles du virus qui résident dans tous les tissues (cerveau, poumons, foie, …). Comment s’établit ce réservoir n’est pas bien connu et il est donc essentiel d’intensifier les recherches afin de mieux comprendre les mécanismes moléculaires régissant leur mise en place au cours de l’infection. Il est supposé que le VIH utilise la stratégie du « cheval de Troie » afin d’être transporté dans les tissues via les monocytes circulants, passant la barrière endothéliale par transmigration avant de se différentier en macrophages. Cette migration trans-endothéliale requière que les monocytes traversent les jonctions serrées (TJs), structures qui fournissent l’imperméabilité entre deux cellules endothéliales. Les partenaires impliqués, le rôle des protéines associées aux TJs (TJAPs) et l’impact du VIH lors de ce processus restent obscures.

Ce projet a pour but de caractériser les mécanismes moléculaires impliqués lors de la transmigration des monocytes à travers les endothéliums, et l’influence du VIH-1 durant ces étapes. Pour se faire, nous avons d’abord déterminé que le VIH-1 induit une transmigration significativement plus importante des monocytes primaires au travers d’une barrière endothéliale. De plus, le virus n’a pas d’influence sur les niveaux d’attachement des monocytes à la monocouche endothéliale, la première étape du processus de transmigration, mais à des étapes plus tardives. Ainsi, nous avons cherché si les protéines associées aux jonctions serrées exprimées par les monocytes (mTJAPs) pouvaient représenter des molécules participant aux étapes post-adhésion de la transmigration. Dans ce contexte, une mTJAP a été identifiée comme étant un acteur important de la transmigration des monocytes infectés par le VIH. Nous avons mis en place un système de micro-fluidique qui nous a permis d’observer que cette mTJAP promeut l’étalement des monocytes rapidement après une exposition à un flux (à vitesse physiologique de la circulation sanguine). Dans ces conditions, alors que la capacité des monocytes à adhérer reste inchangée, l’augmentation de l’étalement est fréquemment associée à une augmentation des capacité pro-migratoire des cellules. De plus, nous avons pu déterminer par microscopie confocale 3D en temps réel que les monocytes infectés par le VIH transmigrent via la formation de structure ressemblant à des « lamélipodes », un processus pour lequel notre mTJAP a été impliquée. Enfin, la combinaison de l’infection par le VIH et la surexpression de la mTJAP entraine une forte augmentation de la transmigration, à des valeurs synergétiques plutôt qu’additives. Nos résultats suggèrent que HIV et la mTJAP coopèrent pour faciliter la transmigration des monocytes.

Afin de valider le rôle de la mTJAP durant la transmigration de monocytes infectés par le VIH-1, nous proposons maintenant d’utiliser une combinaison de microscopie en temps réel et micro-fluidique associées à des techniques classiques de virologie et biologie cellulaire. Nous allons disséquer en détails le mécanisme de transmigration médié par la mTJAP et déterminer comment le VIH-1 subverti cette protéine pour induire la transmigration du monocyte au travers des endothéliums.

Ce projet devrait fournir les bases moléculaires nécessaires pour mieux comprendre comment est initié la formation de réservoirs du VIH et ainsi apporter de nouvelles approches afin d’imaginer des stratégies antivirales innovantes visant les réservoirs.

Contexte :

La protéine régulatrice Rev du VIH-1, est une protéine nucléocytoplasmique de liaison à l’ARN, essentielle à la réplication virale. Rev est responsable de l’export nucléaire des ARN viraux non ou partiellement épissés, qui codent pour les protéines structurelles et enzymatiques virales et constituent l’ARN génomique incorporé dans les nouvelles particules virales. Rev est importée dans le noyau par le facteur de transport nucléaire de la cellule hôte, Importin β (Impβ). L’interaction entre Rev et Impβ est directe, et son inhibition bloque l’importation nucléaire de Rev et la réplication virale. Malgré le rôle essentiel du complexe Impβ/Rev dans le cycle d’infection virale, la base moléculaire de cette interaction reste mal comprise.

Objectif :

L’objectif à long terme de ce projet est de comprendre, à l’échelle atomique, comment Rev est importée dans le noyau de la cellule hôte. Pour atteindre cet objectif, nous cherchons à obtenir une structure 3D à haute résolution du complexe Impβ/Rev par cryo-microscopie électronique (cryo-ME). Nos efforts pour obtenir cette structure, en utilisant des méthodes conventionnelles, se sont jusqu’à présent avérés infructueux en raison de la petite taille et de la pseudo-symétrie du complexe Impβ/Rev. Pour surmonter ces obstacles, nous proposons une approche innovante, basée sur l’expérience que nous avons développée au sein du laboratoire, qui consiste à fusionner génétiquement Impβ à une protéine modèle dimérique. L’objectif spécifique du contrat d’initiation est de démontrer la faisabilité de cette approche, en déterminant une structure cryo-ME initiale du complexe Impβ/Rev à une résolution subnanométrique (idéalement inférieure à 5 Å).

Approche méthodologique :

Les données préliminaires révèlent que la fusion de Impβ au domaine de dimérisation d’une petite protéine bactérienne, EsxA de S. aureus, permet la production d’un homodimère soluble de 219 kDa, (EsxA-Impβ)2, qui forme des particules de taille et de forme attendues en microscopie électronique (ME) à coloration négative. Nos résultats montrent que cette construction initiale présente un degré de flexibilité au niveau de la liaison qui relie les deux protéines, et nécessite d’être optimisée afin d’obtenir un ensemble de particules plus homogène pour l’analyse par cryo-ME. L’optimisation sera réalisée en criblant un ensemble de mutants de délétion dans lesquels les résidus de liaison flexibles seront supprimés un par un. Chaque construction sera systématiquement exprimée et purifiée pour être caractérisée biophysiquement et visualisée par ME à coloration négative. Les constructions qui permettront d’avoir un ensemble de particules uniformes  seront ensuite analysées par cryo-ME à l’aide de notre microscope Glacios interne à l’institut, et les structures 3D correspondantes seront déterminées par analyse de particules uniques.

Résultats attendus :

L’approche développée devrait permettre d’obtenir une reconstruction cryo-ME du complexe Impβ/Rev à une résolution subnanométrique. Du fait que les hélices α sont visibles à cette résolution, et que Impβ et Rev sont des protéines hélicoïdales, ces premiers résultats nous permettront de positionner sans ambiguïté les structures atomiques connues de Impβ et Rev dans la carte cryo-ME et d’obtenir un premier aperçu de la façon dont Impβ reconnaît Rev. Il est important de souligner que ces résultats nous permettront de demander l’accès à un microscope cryo-électronique plus puissant (Titan Krios ou équivalent), qui nous permettra de déterminer une structure à haute résolution (idéalement mieux que 3 Å) qui révélera le détail des interactions impliquées dans la reconnaissance de Rev par Impβ. À plus long terme (au-delà de la portée de la présente demande de financement), nous exploiterons ces résultats pour identifier et générer des mutants qui compromettent l’interaction de Impβ et Rev. Ces mutants seront ensuite testés in vitro par des essais d’interaction et in vivo par des essais d’importation nucléaire de Rev dans des cellules, afin de confirmer l’implication des interactions moléculaires, structuralement identifiées, dans l’import nucléaire de Rev.

But. Le but de ce projet est de mieux comprendre le rôle de la protéine Vpr de la lignée VIH-2/SIVsmm et de déterminer comment les protéines Vpr et Vpx de cette lignée coopèrent pour favoriser l’expression virale. Les résultats pourraient conduire à la découverte de protéines antivirales agissant à l'interface hôte-virus.

Hypothèses et résultats et préliminaires. Une partie du projet est en ligne avec nos travaux actuels qui visent à comprendre comment Vpx du VIH-2 antagonise la protéine TASOR du complexe HUSH; une autre partie est basée sur un crible protéomique quantitatif, qui a été conçu à l’origine pour comparer la façon dont les protéines virales de la famille Vpr/Vpx influencent différemment le protéome des cellules humaines et celui des cellules simiennes. Le crible a été validé avec Vpx de SIVsmm, qui induit la dégradation de HUSH.  A noter aussi que le niveau d’expression de peu de protéines est significativement diminué en présence des protéines virales, alors qu’environ 8000 protéines ont été quantifiées dans chaque condition. Parmi les protéines dont le niveau d’expression diminue en présence de Vpr de SIVsmm se trouve la protéine ZFC3H1, qui fait partie du complexe PAXT et qui interagit avec TASOR. Le complexe PAXT coopère avec l’exosome pour favoriser la dégradation des ARNs nucléaires naissants. Une deuxième protéine est également impliquée dans le métabolisme de l’ARN et, selon la littérature, pourrait être liée à ZFC3H1. Ainsi, nous faisons l’hypothèse que Vpx et Vpr de SIVsm/HIV-2 ciblent le même complexe macromoléculaire, afin de favoriser l’expression virale. Enfin, une troisième protéine, dont l’expression est très diminuée en présence de Vpr de SIVsmm, est une protéine de fonction inconnue mais identifiée précédemment en tant que facteur de restriction potentiel.

Dégradation et interaction. Nous proposons de valider et d’étudier la déplétion de ces trois candidats par Vpr de SIVsmm, mais aussi par des protéines Vpr et Vpx issues de différentes lignées lentivirales. Nous allons examiner si la déplétion dépend d’un mécanisme dépendant du protéasome et de l’utilisation de l’adaptateur de l’ubiquitine ligase DCAF1, comme pourraient le suggérer les études antérieures sur le mécanisme d’action de Vpr. Nous rechercherons des mutants de Vpr de SIVsmm (et HIV-2) incapables de diminuer l’expression des substrats. Nous testerons si les protéines de l’hôte et les protéines virales interagissent et si interaction et dégradation sont corrélées. Nous nous demanderons comment Vpr et Vpx peuvent cibler le même méga-complexe (HUSH associé aux facteurs de dégradation de l’ARN), en utilisant des mutants de troncation de TASOR et de ZFC3H1.

Rôle. Nous nous demanderons quel est le rôle de la déplétion des différents substrats par Vpr de SIVsmm (et donc probablement par Vpr de HIV-2). Nous testerons un panel de mutants de Vpr et nous nous demanderons si la dégradation d’un substrat donné corrèle avec une activité spécifique de la protéine virale (arrêt G2, dommages à l’ADN). Nous nous demanderons si la déplétion d'un substrat par siRNA, shRNA ou CrisPR, mime l'une des activités de la protéine virale. Gardant à l’esprit le rôle endogène de deux des substrats dans le métabolisme de l’ARN, nous nous demanderons en priorité si la déplétion des substrats favorise l’expression virale comme c’est le cas avec Vpx, et si Vpr et Vpx coopèrent pour améliorer l’expression virale. Nous testerons si les candidats sont connectés physiquement ou fonctionnellement. Enfin, nous testerons si la déplétion des substrats améliore la réplication des VIH-1 et 2 et des virus delta-Vpr dans les macrophages.

Conclusion. Nous espérons que ce projet conduira à une meilleure compréhension de la façon dont le VIH-2 favorise l’expression des gènes viraux en utilisant Vpx et, peut-être, Vpr. Ce projet pourrait mener à la découverte d’une fonction spécifique de Vpr du VIH-2/SIVsmm et aider à revisiter la fonction de Vpr du VIH-1. Nous espérons découvrir de nouvelles voies antivirales et/ou facteurs de restriction. L’un d’eux est un candidat prometteur de fonction inconnue et notre travail pourrait aider à le caractériser.