Projets et candidats lauréats

La tuberculose (TB) causée par Mycobacterium tuberculosis (Mtb) est un problème majeur de santé publique dans le monde, y compris au Maroc ou l’incidence annuelle est de l’ordre de 1 pour 1000. Environ un quart de la population mondiale est infectée par Mtb, mais seule une minorité développe la tuberculose. Les études d’épidémiologie génétique suggèrent fortement que la tuberculose est aussi une maladie génétique. Les bases moléculaires de la TB ont été disséquées depuis les années 2000. Nous avons découvert deux types d’erreurs innées de l’immunité (IEI) aboutissant à la tuberculose, toutes deux altérant l’immunité liée à l’interféron (IFN)-γ: (i) des IEI rares, comme les défauts complets autosomiques récessifs d’IL-12Rβ1 et de TYK2, retrouvés chez quelques patients tuberculeux, et (ii) une IEI commune due à l’homozygotie pour le variant P1104A de TYK2 qui perturbe sélectivement l’immunité liée à l’IFN-γ, dépendante de l’IL-23, et qui représente jusqu’à 1% des cas de tuberculoses européens. Ces résultats ont fourni la preuve de principe qu’il existe à la fois des étiologies monogéniques rares et communes de la TB humaine, ils ont mis en évidence des variants spécifiques d’une origine ethnique (européen dans ce cas); ils ont établi que la production d’IFN-γ est essentielle pour l’immunité protectrice contre Mtb. Néanmoins, la grande majorité des patients tuberculeux n’ont pas d’étiologie génétique. Nous émettons l’hypothèse que la tuberculose est la conséquence d’IEIs monogéniques ou digéniques, encore à identifier, avec une pénétrance incomplète ou plus rarement complète, dans une proportion importante de la population. Pour découvrir ces variants, nous utiliserons une approche génome entier avec séquençage complet des exons et du génome si nécessaire. Les patients tuberculeux seront recrutés au Maroc, en particulier ceux appartenant à des familles consanguines et/ou multiplex (plusieurs atteints dans la famille) et/ou avec des formes récurrentes de tuberculose, car ces patients sont plus susceptibles d’être porteurs d’IEI. Notre projet suivra une stratégie combinant: (i) une étude génétique complète basée sur le séquençage de nouvelle génération de plus de 600 patients TB Marocains (dont 505 exomes déjà disponibles) et plus de 300 individus sains infectés pour rechercher des variants candidats à l’origine de la tuberculose à l’aide d’analyses de pointe testant différentes hypothèses génétiques (hétérogénéité ou homogénéité génétique, hérédité monogénique ou digénique), et (ii) des études fonctionnelles approfondies pour caractériser biochimiquement les effets des variants candidats nouvellement découverts, et pour valider immunologiquement leur rôle causal au niveau moléculaire et cellulaire. Notre projet bénéficiera également des patients TB précédemment recrutés d’autre origine (> 1000), afin de répliquer les résultats qui seront identifiés dans l’échantillon Marocain. Notre projet est très innovant et réalisable car il se base sur une collection unique de patients recrutés avec des critères d’inclusion rigoureux, une collaboration de longue date entre les partenaires Français et Marocains, et bénéficie des fortes compétences cliniques et génétiques des partenaires Marocains sur la TB et du partenaire Français dans la découverte de nouveaux IEI impliqués dans les maladies infectieuses. Nos données préliminaires indiquent que cette approche est fructueuse, car nous avons déjà identifié des mutations candidates très prometteuses, avec les variants gain de fonction mono-alléliques de STAT1 et des variants rares de perte de fonction bi-allélique dans LY9 et BTN3A3, et des variations mono- ou bi -alléliques communes de IL10RA. Notre recherche de variants rares et communes amenant à des IEI monogéniques ou digéniques qui contrôlent le développement de la TB à forte pénétrance permettra de déchiffrer les mécanismes de l’immunité protectrice contre Mtb chez l’homme. Cette approche ouvrira également la voie au développement de nouvelles approches préventives et thérapeutiques, visant à restaurer des réponses immunitaires déficientes, en particulier en rapport avec l’IFN-γ.

SAMHD1 est une triphosphohydrolase cellulaire (dNTPase) qui inhibe la réplication du VIH-1 dans les cellules immunitaires non cyclantes. Selon le modèle actuel, la fonction antivirale de SAMHD1 est basée sur sa capacité à hydrolyser les dNTP, ce qui entraîne une diminution de leur concentration en dessous du niveau requis pour une transcription inverse efficace.

SAMHD1 est une protéine ubiquitaire et stable. Pourtant, son activité anti-VIH-1 n’est observée que dans les cellules non cyclantes, suggérant l’implication de mécanismes de régulation post-traductionnels. Il est bien établi que dans les cellules qui se divisent et permissives au VIH-1, le résidu T592 de SAMHD1 est phosphorylé par les complexes cycline-CDK. En revanche, ce résidu est déphosphorylé dans des cellules non cyclantes réfractaires à l’infection. De plus, un mutant phosphomimétique de SAMHD1 est incapable d’inhiber le VIH-1. Sur la base de ces observations il a été proposé que la phosphorylation de T592 inactive la restriction médiée par SAMHD1. De manière surprenante, un nombre croissant de preuves indique que cette modification n’influence pas l’activité dNTPase. Ainsi, outre l’épuisement du dNTP, le mécanisme de restriction de SAMHD1 semble nécessiter d’autres fonctions régulées par la phosphorylation de T592 et / ou d’autres modifications post-traductionnelles.

Des travaux récents de notre équipe ont confirmé que le contrôle de l’activité antivirale SAMHD1 implique également la SUMOylation du résidu K595. Comme le mutant phosphomimétique, les variants de SAMHD1 qui ne peuvent pas être SUMOylés sur K595 ont une activité antivirale défectueuse, mais une fonction dNTPase intacte (manuscrit en révision à Nature Communications).

Afin de définir quels sont les mécanismes moléculaires de la restriction de SAMHD1 indépendants de son activité dNTPase, et régulés par la phosphorylation de la T592 et/ou la SUMOylation de la K595 nous développerons les axes de recherche suivantes :

1- Caractériser les conséquences de la phosphorylation de T592 et/ou de la SUMOylation de K595 sur la dynamique de la réplication virale

2- Définir le rôle de l’interaction entre SAMHD1 et les acides nucléiques dans la restriction du VIH-1 et étudier si et comment les MPTs influencent cette association ;

3- Etudier l’implication cofacteurs viraux et/ou cellulaires dans le mécanisme de restriction de SAMHD1.

Ces connaissances seront nécessaires pour pouvoir envisager des stratégies visant à manipuler spécifiquement l’activité antivirale de SAMHD1 sans modifier ses autres fonctions cellulaires.

Les études sur la transmission du VIH-1 par voie sexuelle suggèrent que les virus T/F (Transmitted/Founder) à l’origine de l’infection possèdent des propriétés biologiques spécifiques leur permettant d’être transmis. Cependant, des incertitudes persistent sur les éléments phénotypiques particuliers associés à leur sélection.  Au niveau du tractus génital, les macrophages (MP) et les lymphocytes T CD4+ (LTCD4) font partie des premières cellules immunitaires cibles des virus T/F. L’infection de ces cellules cibles peut se faire par les virus libres circulants mais la transmission des virions entre cellules infectées et cellules cibles semble plus efficace pour la dissémination du VIH-1. Malgré l’importance des macrophages dans l’infection VIH, les mécanismes conduisant à leur infection et à leur capacité à transmettre des virions infectieux restent méconnus. Dans le contexte de transmission du VIH-1 par voie sexuelle et en tenant compte du rôle prépondérant des MP au niveau des sites de transmission, la comparaison des virus T/F issus d’un transfert intercellulaire pourrait contribuer à la compréhension du processus de transmission des virus à l’origine d’une nouvelle infection.

Afin de mieux caractériser le rôle des MP dans l’établissement de l’infection initiale, nous proposons de comparer les propriétés infectieuses de virus T/F issus de différents transferts cellulaires impliquant les MP et les LTCD4.

Pour cela, nous utiliserons deux populations d’étude. La première population d’étude correspond à un panel de 10 clones moléculaires infectieux de virus T/F de sous-type B obtenus auprès du NIH (NIH Aids Reagent Program). Ce panel de virus T/F bien caractérisé nous permettra de rechercher si le passage de ces virus dans des macrophages par transfert intercellulaire modifie leurs propriétés infectieuses. La seconde population d’étude est issue de 5 patients infectés par des variants très proches d’un virus de sous-type B et faisant partie d’un cluster de transmission que nous avons étudié précédemment. Des virus réplicatifs exprimant les enveloppes représentatives de la population virale infectant les 5 patients (6 variants T/F et 7 variants chroniques) seront générés. Cette population nous permettra de rechercher si les virus T/F présentent un avantage sélectif à transiter par les MP par rapport aux virus chroniques.

L’analyse des propriétés infectieuses des virus T/F après transit lymphocytaire ou macrophagique constitue une réelle opportunité d’apporter des éléments phénotypiques nouveaux sur les virus impliqués dans la transmission de l’infection et de comprendre le rôle des MP dans la dissémination du VIH-1, avec en perspective le développement de mesures préventives adaptées.

Le virus de l’immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1) requiert la contribution concertée de nombreux facteurs cellulaires et de différentes voies de signalisation pour se répliquer. Parallèlement, les cellules de mammifères expriment de nombreuses protéines qui agissent de façon dominante et autonome afin de supprimer la réplication virale. Ces facteurs de restriction définissent la première ligne de défense contre les infections. Parmi eux, les protéines de la famille APOBEC3 (apolipoprotein B mRNA-editing enzyme catalytic polypeptide-like 3 ou A3) et en particulier A3G et A3F, sont des désaminases de cytosines dont l’action d’édition des cytosines en uridines lors de la transcription inverse du génome viral est létale pour le virus. L’activité antivirale d’A3G/3F est contrecarrée par la protéine Vif (virion infectivity factor) du VIH-1, qui réduit considérablement leur taux d’expression et leur incorporation dans les particules virales (i) en recrutant une E3 ubiquitine ligase et en induisant la dégradation d’A3G par le protéasome, (ii) en réduisant la transcription des gènes dépendant de RUNX, dont A3G, et (iii) en régulant négativement la traduction de l’ARNm d’A3G. Concernant ce dernier mécanisme, nous avons récemment découvert la présence d’un uORF (upstream ORF) dans la région 5’ non traduite (5’UTR) de l’ARNm d’A3G et montré son importance non seulement pour la traduction intrinsèque d’A3G, qui serait traduit par un mécanisme original de leaky-scanning et de ré-initiation, mais également pour sa régulation par Vif.

Au vu du rôle des uORF dans la répression traductionnelle en général, notre projet s’articulera autour de 3 axes majeurs :

1. Explorer la conservation phylogénétique de l’uORF chez les hominoïdes et son impact dans la réplication virale. Nous avons montré la conservation de l’uORF d’A3G pour A3F chez l’humain, avec des propriétés similaires vis-à-vis de Vif. Nous élargirons nos connaissances phylogénétiques au niveau de l’uORF à l’ensemble des APOBEC3 issues des hominoïdes et étudierons l’impact du polymorphisme sur l’expression protéique et la réplication virale (collaboration avec Lucie Etienne, ENS-CIRI, Lyon).
2. Identifier les facteurs protéiques cellulaires requis pour l’inhibition traductionnelle. Par des techniques de pull-down basées sur la biotinylation des ARNm d’A3G ou par l’utilisation d’une biotine ligase (BirA), suivie d’une analyse par spectrométrie de masse, nous identifierons les facteurs protéiques cellulaires spécifiques de Vif et de l’uORF de l’ARNm d’A3G.
3. Cartographier les ARNm cellulaires régulés par Vif. Vif étant une protéine chaperon d’ARN, nous chercherons à identifier par la technique de PAR-CLIP les ARN cellulaires qui interagissent avec Vif (potentiellement via une uORF). Ces ARN, et/ou leur produit d’expression, pourraient être des régulateurs potentiels de la réplication virale (collaboration avec Sarah Gallois-Montbrun, Institut Cochin, Paris).

L’ensemble de ces résultats devrait apporter une vision nouvelle sur un mécanisme original d’inhibition traductionnelle induit par une protéine virale. Cette nouvelle compréhension élargie du phénomène de restriction cellulaire pourrait permettre à l’ensemble de la communauté scientifique d’imaginer de nouvelles stratégies d’inhibition de la réplication virale qui ciblerait spécifiquement l’interaction de Vif avec les ARNm d’A3G/3F, le complexe d’initiation de la traduction dépendant de Vif ou encore les nouveaux partenaires identifiés.

Les macrophages et cellules dendritiques (DCs) sont des cibles cellulaires du VIH-1 qui participent à la transmission et à la dissémination virales, ainsi qu’à l’établissement de réservoirs tissulaires viraux. Alors que les DCs et les macrophages sont difficilement infectés in vitro par des particules virales libres en raison de la forte expression de facteurs cellulaires de restriction tels que SAMHD1, nous avons mis en évidence un mécanisme très efficace pour la dissémination intercellulaire du VIH-1 à partir de cellules T infectées vers les macrophages et DCs par un processus de fusion cellulaire en deux étapes conduisant à la formation de cellules géantes multinucléées (MGCs) capables de produire de grandes quantités de virus par un mécanisme court-circuitant la restriction par SAMHD1. Dans la première étape, les cellules T infectées établissent des contacts avec les macrophages ou les DCs, entraînant la fusion des cellules T infectées avec les cellules myéloïdes cibles. Les cellules fusionnées VIH-1+ nouvellement formées acquièrent alors la capacité de fusionner avec les macrophages ou DCs non infectés environnants, conduisant à la formation de MGCs infectées contenant au moins un noyau de cellules T infectées provenant de la fusion initiale. Notre hypothèse est que ce mode original de transmission intercellulaire par fusion cellulaire est modulé et contrôlé par des facteurs cellulaires et viraux afin de permettre une propagation efficace du virus et l’infection productive des macrophages et DCs. Après la fusion initiale entre les cellules T infectées et les cellules cibles myéloïdes, la présence et le maintien dans un nouvel environnement cellulaire d’au moins un noyau de cellules T transcriptionnellement actif dans les MGCs infectées par le VIH-1 devraient déboucher sur un nouveau programme transcriptionnel conduisant à l’expression de facteurs cellulaires permettant des changements phénotypiques et une production élevée de nouvelles particules virales infectieuses. Nous proposons également que le transfert et le maintien du noyau des cellules T, contenant déjà au moins une copie d’ADN proviral intégré, pourraient permettre de contourner les premières étapes du cycle de réplication virale restreintes par les protéines SAMHD1, APOBEC3, UNG2, SERINC ou d’autres facteurs cellulaires non identifiés, menant à une expression virale élevée par ces cellules géantes mutltinucléées.

En raison du rôle important dans la pathogenèse des macrophages et des DCs en tant que cellules cibles primaires du VIH-1, il est donc essentiel de caractériser, au niveau cellulaire et moléculaire, les mécanismes qui régissent, contrôlent et modulent ces mécanismes de fusion intercellulaire pour le transfert et la dissémination optimales du virus dans ces cellules myéloïdes. Ainsi, l’objectif général de notre projet est de caractériser les facteurs cellulaires et viraux, ainsi que les voies de signalisation cellulaires, modulant (ou modulées lors) la transmission et la dissémination intercellulaires efficaces du VIH-1 des cellules T infectées vers les cellules cibles myéloïdes. Ce projet se concentrera sur 3 objectifs spécifiques principaux:

1) Analyse du devenir du noyau des cellules T infectées par le VIH-1 après fusion avec les cellules cibles myéloïdes et la formation de cellules géantes multinucléées productivement infectées.

2) Analyse du rôle des facteurs de restriction cellulaires et des protéines auxiliaires du VIH-1 pour une infection intercellulaire efficace des cellules cibles myéloïdes.

3) Identification par RNA-sequencing de nouveaux facteurs cellulaires modulant la propagation intercellulaire du VIH-1 dans les cellules myéloïdes.

Ce projet représente une sous-partie d’un programme général développé dans notre équipe concernant l’étude du transfert et de la dissémination intercellulaires du VIH-1 dans les cellules myéloïdes. Étant donné que tous les outils biologiques et approches expérimentales nécessaires à la réalisation de ce projet sont déjà disponibles dans notre laboratoire et à l’Institut Cochin, au moins 2 ans seront nécessaires pour réaliser les trois principaux objectifs.