Projets et candidats lauréats

Résumé:

Contexte et état actuel du sujet. L’infection chronique par le virus de l’hépatite C (VHC) est la cause majeure mondiale du carcinome hépatocellulaire (CHC). Alors que les antiviraux à action directe ont montré leur grande efficacité pour éradiquer le virus, plusieurs études cliniques ont reporté que les patients qui ont une maladie hépatique avancée demeurent des sujets à risque pour le CHC, et cela malgré l’absence du virus. A partir de nos observations montrant que les voies de signalisations intracellulaires demeurent anormales même après guérison du virus, ce projet vise à identifier les mécanismes moléculaires persistants qui sont associés au risque du CHC.

Résultats. Nous avons récemment démontré en utilisant les tissus de foie de patients, des modèles animaux, et des cultures cellulaires, que le VHC induit une altération de l’épigénôme ainsi que de l’expression des gènes, qui persiste au –delà de la disparition du virus (Hamdane et al. Gastroenterology 2019, Jühling et al. Gut 2020). Ces changements concernent la signalisation hypoxique et l’expression des gènes qui promeuvent le cancer du foie (Jühling et al. Gut 2020). Nos résultats suggèrent que le virus induit des changements épigénétiques persistants qui entrainent une progression de la maladie hépatique vers le CHC.

Objectifs. Notre objectif est de comprendre les mécanismes moléculaires induits par le virus qui causent des altérations épigénétiques responsables du CHC après élimination du virus, afin d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour prévenir le CHC. Plus précisément, nous souhaitons (1) identifier les composantes de la chromatine qui participent à l’altération induite par le virus, (2) analyser le rôle fonctionnel des voies hypoxique/stresse oxydative qui sont liées aux changements induits par le virus, et (3) valider l’importance clinique de ces découvertes à travers des modèles de souris humanisées de foie chimérique qui sont permissives au VHC, et de tissus hépatiques de patients infectés par le VHC.

Méthodologie. Dans l’objectif 1, nous allons réaliser un criblage non-biaisé pour identifier les composantes de la chromatine qui participent aux altérations induites par le VHC. Simultanément, nous allons analyser deux cibles spécifiques que nous avions identifié grâce à nos études antérieures. Celles-ci consistent en une histone méthyltransférase EZH2 et une histone-lysine N-méthyltransférase 2, encore appelée G9a. Dans l’objectif 2, nous allons utiliser le système cellulaire que nous avions employé pour étudier l’acétylation des histones pendant l’infection du VHC et après guérison, afin d’analyser le rôle du stresse oxydative induit par le VHC sur l’acétylation des histones. L’objectif 3 consiste à valider ces découvertes à l’aide des modèles in-vivo et ex-vivo dérivés du patient. Ce projet est innovant car (1) il clarifie le paradigme concernant le risque du CHC malgré l’éradication du VHC, et (2) il utilise les derniers modèles innovants combinés avec les méthodes avancées de biologie du système incluant les cultures cellulaires, les animaux, et les données cliniques.

Résultats escomptés et impact sur la santé publique. Nous estimons que l’analyse et l’identification des mécanismes moléculaires qui découlent de l’interaction du VHC avec la cellule hôte, ainsi que les validations in vivo et ex vivo, vont permettre de découvrir de nouvelles cibles thérapeutique pour la prévenir le CHC après la guérison du VHC constituant un besoin médical majeur au niveau mondial et non satisfait actuellement.

Bien qu’un vaccin soit disponible depuis 1982, le virus de l’hépatite B (VHB) reste un problème de santé mondial. Le VHB est un virus enveloppé dont les glycoprotéines (GP) d’enveloppe L, M et S sont respectivement composés des domaines PreS1/PreS2/S, PreS2/S et S. PreS1 est important pour la liaison au récepteur, NTCP, et aussi à la capside. Ces GPs ont une double topologie associée à différentes étapes du cycle de vie. La première topologie, dite « immature », correspond à PreS1 exposé à l’intérieur de la particule virale et semble importante pour l’assemblage du VHB via une interaction entre PreS1 et la capside. La deuxième topologie est appelée « mature », correspond à l’exposition de PreS1 à la surface du virus, ce qui permet la liaison de PreS1 au récepteur.

La mise en évidence du mécanisme de maturation des GP du VHB restent est importante pour comprendre comment le VHB devient infectieux au bon moment et au bon endroit afin éviter une « immobilisation extra-hépatique » ou d’échapper aux anticorps neutralisants.

Aussi, nous avons initié des analyses de coévolution des GPs des différents génotypes (Gt) pour sélectionner et caractériser des résidus d’intérêt pour la maturation et/ou le switch topologique des GPs. La plupart des séquences Gt-A/B/C possèdent une extension N-terminale de 11 résidus (appelée peptide +11AA) par rapport à la plupart du Gt-D. L’un des clusters de coévolution identifié présente 9 positions d’intérêt qui sont réparties sur les 3 domaines (PreS1, PreS2 et S) et qui co-varient avec la présence ou non du peptide 11AA. Dans des études préliminaires, nous avons étudié 2 positions de ce cluster qui sont situées dans PreS1 et qui ont été mutées dans Gt-D L GP (T18V et S19P) en plus d’y introduire les 11 premiers résidus de PreS1 du Gt-C, dans le but d’étudier la production de virions, l’infectivité, les essais de liaison à NTCP et la topologie des GPs. Alors que les virus exposant le peptide +11AA étaient moins infectieux que le WT, en accord avec des études précédentes, nous avons constaté que les particules virales possédant les mutations +11AA/T18V ou +11AA/S19P avaient une infectivité restaurée à des niveaux similaires au WT, ce qui était corrélé aux niveaux de liaison à NTCP. Pour mieux comprendre ces observations, nous avons réalisé une étude topologique des particules virales WT et mutantes. Nous avons constaté que, par rapport aux particules WT, les virions possédant le peptide +11AA présentaient un plus grand nombre de L GP immature, entraînant ainsi une exposition plus faible de PreS1 à la surface du virus, tandis que les virions avec la mutation +11AA/T18V présentaient une topologie similaire au WT. Nous avons donc conclu que le peptide 11AA ainsi que ce cluster de coévolution contenant la position 18 était important pour le switch topologique de L GP.

Ce projet a trois objectifs. Premièrement, nous poursuivrons l’analyse de la coévolution de la L GP et de la protéine Core du VHB, ou de la protéine L-HDAg du VHD, afin d’explorer la coévolution potentielle GPs et de la capside/ribonucléocapside et les résidus du cluster impliqués dans la maturation ou le switch topologique. Ensuite, nous explorerons les facteurs environnementaux qui pourraient réguler la maturation des GP. Plus précisément, nous nous concentrerons sur i) le pH et la charge des acides aminés, et des facteurs ioniques; ii) les facteurs du sérum ou sécrétés par les hépatocytes; et iii) les facteurs intracellulaires. Troisièmement, nous réaliserons des essais in vitro et in vivo pour étudier la cinétique de maturation des virions et comprendre le lien entre le changement de topologie des GPs et l’échappement à la neutralisation par les anticorps et/ou à l’immobilisation extra-hépatique.

Globalement, ce projet permettra de déterminer quels résidus sont impliqués dans le changement de topologie des GPs mais aussi l’importance des différents GPs et de leurs domaines sur le processus de maturation. Nous mettrons en évidence des facteurs de l’hôte potentiellement nécessaires à la maturation des virions. Enfin, nous mettrons en évidence le lien éventuel entre la maturation et l’échappement immunitaire.

La plasticité du VHC, associée à son haut niveau de réplication, est responsable de la distribution en quasi espèces des populations virales chez les individus infectés. Certains de ces variants sont résistants aux agents antiviraux à action directe (AADs). Leur susceptibilité réduite est conférée par la présence de substitutions amino-acidiques associées à la résistance (RAS) sur leur génome. Chez 10% à 30% des patients en échec d’AADs, aucune RAS n’est observée au moment de l’échec virologique. Par analogie avec le VIH et le Virus de l’hépatite B, il est probable que d’autres substitutions amino acidiques localisées dans des gènes non ciblés par les AADs sont sélectionnées au moment de l’échec virologique. Ces substitutions exerceraient un effet positif sur la capacité réplicative de la population virale correspondante, participant à l’échec virologique. Alors que cette hypothèse a été validée in vitro, aucune donnée n’est disponible en regard de la sélection de telles substitutions in vivo après l’échec d’un traitement antiviral. Cela est dû en partie aux techniques de séquençage disponibles, limitées à la caractérisation de courts fragments géniques. Dans ce travail, nous proposons d’utiliser une méthode originale de métagénomique « shotgun » permettant le séquençage du génome entier du VHC et la caractérisation en profondeur de la quasi espèce virale pour identifier les substitutions amino acidiques sélectionnées dans des régions non ciblées par les antiviraux au cours d’échecs virologiques des AADs.

Pour cela, nous caractériserons l’évolution des quasi espèces virales avant traitement et au moment de l’échec virologique à partir d’une cohorte monocentrique de patients non sélectionnés, en échec d’AADs présentant des RASs (n=21) ou pas de RASs (n=21) à l’échec, comparés à l’évolution naturelle de la quasi espèce virale dans un 3ème groupe de patients non traités (n=21). Le séquençage à haut débit par métagénomique shotgun constituera une approche intégrative puissante pour caractériser les substitutions sélectionnées au cours des échecs virologiques dans des régions non ciblées directement par les AADs. Ces substitutions, ainsi que les substitutions connues pour conférer la résistance aux antiviraux identifiées au cours de l’étude génétique, seront caractérisées sur le plan phénotypique (niveau de résistance conféré, effet sur la capacité réplicative) dans des modèles de réplicons transitoires et stables des différents génotypes du VHC disponibles sur la plateforme phénotypique du laboratoire.

Ce programme de recherche s’inscrit dans la continuité des travaux menés depuis plusieurs années par notre équipe de recherche concernant l’étude des quasi espèces virales et des mécanismes de résistance des traitements de l’hépatite C par AADs. L’expertise et l’ensemble des outils et systèmes expérimentaux permettant la réalisation pratique du projet sont disponibles et maîtrisés.

La réalisation de ce programme s’étalera sur une année. L’échéancier prévu est le suivant :

Mois 1-6: caractérisation génotypique par métagénomique des virus plasmatiques des patients de la cohorte.

Mois 7-12: réalisation des tests phénotypiques.

Le nouveau coronavirus dénommé SARS-CoV-2 (severe acute respiratory syndrome -coronavirus 2) a été signalé pour la première fois en décembre 2019. Sa propagation est telle qu’il a été depuis déclaré pandémique et constitue une urgence de santé publique. L’Europe a rapidement été le nouvel épicentre de l’épidémie, maintenant rejointe par l’Amérique du Nord avec les USA, zones dans lesquelles les autorités politiques et sanitaires s’efforcent de contenir l’épidémie qui affecte gravement les personnes âgées ou co-morbides.

La pandémie de COVID-19 risque maintenant de toucher des zones plus fragiles aux systèmes de soins vulnérables, telles que l’Amérique du Sud ou l’Afrique. Quatre-vingt-six cas ont en effet déjà été confirmés au Mali, touchant quatre régions. Bamako est la ville la plus touchée, avec 90% des cas à elle seule. Le personnel soignant, en première ligne dans la prise en charge des patients Covid19, peut accidentellement être infecté et représenté une source d’infection pendant la phase d’incubation ou en cas d’infection asymptomatique ou pauci-symptomatique.

Les objectifs de ce projet sont ainsi i) de limiter la diffusion du SARS-CoV-2 au sein des services hospitaliers de Bamako en effectuant un dépistage systématique par biologie moléculaire des personnes symptomatiques (soignants/soignés) et en mettant en évidence les clusters de transmission, et ii) d’évaluer faisabilité d’un dépistage de biologie moléculaire par tests Point-of-Care au Mali. Par ailleurs, iii) la propagation et l’immunité acquise vis-à-vis du SARS-CoV-2 chez les soignants par des tests sérologiques seront évaluées, permettant également une évaluation de la proportion de soignants asymptomatiques et la vérification de l’absence de re-contamination parmi le personnel soignant immunisé. Enfin, iv) la variabilité du virus au cours du temps et la diffusion des différents variants dans le monde seront étudiées par séquençage total du génome viral.

Les données obtenues lors de ce travail collaboratif permettront ainsi de mieux caractériser l’infection COVID19 à Bamako et de lutter contre en temps réel, alors qu’il apparaît aujourd’hui primordial d’au maximum œuvrer pour limiter la propagation du virus dans les pays à ressources limitées. Notre projet vise également à améliorer nos connaissances virologiques sur ce virus émergent.

Les protéines d’enveloppes du VHB sont indispensables à l’assemblage des virions infectieux contenant le génome viral (virions-ADN). Cependant, la quantité de ces virons est inférieur de 3 à 5 log à la quantité des particules sous virales (PSV) constituées des seules protéines d’enveloppes L, M et S portant l’antigène VHB de surface (AgHBs). D’autres particules sous virales correspondant à des virions vides enveloppés circulent à une concentration 100 fois plus élevées que les virions-ADN. Enfin, certaines études ont documenté la présence dans le sérum de porteurs chronique de capsides virales nues. La faible quantité de virions ADN d’une part et la taille de ces particules produites de 20 à 40 nm rendent très difficile la description de la morphogenèse des virions-ADN du VHB par les méthodes conventionnelles d’observation par microscopie dans les cellules permissives. L’objectif de ce projet est donc de décrire l’assemblage du VHB en identifiant chacun des constituants viraux afin de distinguer la formation des virons-ADN de celle des autres particules virales et de suivre leurs trafics intracellulaires respectifs. Nous avons récemment caractérisé l’assemblage des protéines core (C) en capside et l’interaction entre les protéines L et C. Nos observations par microscopie électronique montrent que L se concentre dans des régions riches en membranes cellulaires dans lesquelles sont condensées un grand nombre de capsides vides. Nous proposons de poursuivre ce travail 1- en définissant le domaine cellulaire dans lequel les amas de L s’accumulent et en suivant l’effet de S sur cette localisation, 2- en caractérisant l’interaction et la localisation cellulaire des protéines L, C et S et, 3- en comparant l’assemblage et le trafic des virions vides et virions-ADN. Ce travail sera réalisé grâce à des plasmides qui expriment, dans des cellules hépatocytaires, de manière séquentielle ou combinée, l’ensemble des acteurs viraux impliqués dans l’assemblage des virions (protéines L, S et C en présence ou en absence du l’ADN viral). En plus des méthodes de biochimie et de microscopie optique, la seule méthode ayant une résolution nanométrique est la microscopie électronique qui, grâce à l’expertise du laboratoire, permettra sans ambigüité d’imager et d’identifier les différents types particules virales. Ces approches expérimentales seront étendues à l’étude de l’assemblage du HDV et les résultats obtenus trouveront une application directe dans la description du mécanisme d’action des inhibiteurs du VHB.