Projets et candidats lauréats

Trouver des moyens pour cibler les réservoirs de VIH dans les cellules et les sanctuaires tissulaires représente un enjeu important dans la recherche sur le VIH. Des travaux récents ont identifié les cellules T auxiliaires folliculaires (Tfh), situées dans les follicules à cellules B dans les ganglions lymphatiques, comme un compartiment cellulaire important pour la persistance virale. Il est à noter que les singes verts africains (AGM) ne progressent pas vers la maladie, malgré une virémie élevée et une déplétion partielle en lymphocytes T CD4 + dans la muqueuse intestinale. Les principales caractéristiques distinctives de l’infection par le SIV chez des hôtes naturels incluent la résolution rapide de l’inflammation d’origine virale et l’absence de translocation microbienne. De plus, le contrôle rapide de la réplication virale dans les organes lymphoïdes secondaires (SLO) pourrait être un autre élément important de l’équilibre empêchant la progression vers la maladie.

Récemment, nous avons démontré que les cellules Natural Killer (NK) jouent un rôle clé dans le contrôle du virus dans les follicules B lors d’une infection par SIVagm in vivo. Les cellules NK sont connues pour exprimer une combinaison de récepteurs activateurs et inhibiteurs, y compris le récepteur inhibiteur hétérodimérique CD94 / NKG2A qui se lie au CMH-E. Les résultats préliminaires du laboratoire montrent que les cellules Tfh expriment des taux élevés de MHC-E et que, de manière frappante, les fréquences des cellules MHC-E + Tfh diminuent dans les ganglions des AGM infectés par SIVagm mais pas dans celles des macaques infectés par SIVmac. De plus, les peptides nonamères dérivés de la séquence leader Env du VIH-1 et du SIV étaient capables de se lier aux molécules MHC-E. Les cellules NK provenant d’AGM et de macaques non infectés étaient inhibés par le peptide SIVmac contrairement au peptide SIVagm qui n’inhibait par l’activité lytique des cellules NK. De plus, les cellules NK de l’AGM ont fortement inhibé la réplication de SIVagm dans les cellules T CD4 + primaires autologues, mais pas la réplication d’un SIVagm codant pour le peptide SIVmac derivé de la séquence leader du gène ENV SIVmac. Afin de comprendre l’impact de l’interaction des récepteurs CMH-peptide E / NK sur l’activité des cellules NK et le contrôle viral dans l’infection VIH / SIV in vivo, et de démontrer in vivo que le peptide leader SIVmac inhibe l’activité des cellules NK alors que le peptide SIVagm ne le ferait pas, nous proposons d’infecter les AGM avec le clone SIVagm de type sauvage ou le clone SIVagm recombinant codant pour le peptide de la leader sequence ENV SIVmac. Nous émettons l’hypothèse que les cellules NK dans l’AGM infecté par le virus recombinant présentent une réplication virale supérieure dans le LN que les AGM infectées avec le SIVagm de type sauvage, car le peptide SIVmac se lie au MHC-E sur les cellules infectées et inhibe la lyse des cellules NK. Nous allons infecter 6 AGM avec le SIVagm de type sauvage et 6 AGM avec le SIVagm recombinant. Les deux groupes d’animaux seront suivis pour les différences de charge virale dans le sang et les tissus (virémie, ARN et ADN viraux associés aux cellules, FISH), les cellules NK (phénotype, fonction de suppression dépendante du MHC-E et indépendante, expression génique, distribution tissulaire), inflammation tissulaire et évolution in vivo de la séquence codant pour le peptide. Cette étude devrait permettre de mieux comprendre le mécanisme par lequel les cellules NK contrôlent un réservoir viral tissulaire dans le modèle AGM.

La prise en charge thérapeutique de l’infection par le virus de l’immunodéficience humaine (VIH-1) nécessite une prescription à vie de traitements antiviraux afin de prévenir le rebond viral observable dans la quasi-totalité des cas après l’arrêt du traitement antirétroviral (ART). Ce rebond est lié à la persistance de réservoirs viraux. Un enjeu thérapeutique essentiel est donc actuellement de parvenir à les éliminer. Une piste prometteuse est de réactiver le virus présent à l’état latent dans les lymphocytes T (LT) quiescents infectés et de les éliminer grâce à l’activité lytique du virus – avec éventuellement une augmentation de la réponse immunitaire antivirale – tout en empêchant par le traitement ART une réinfection des cellules saines par les virus libérés. Notre équipe s’intéresse aux étapes précoces de l’activation des LT, tout particulièrement au rôle du facteur de transcription FOXO1. Cette molécule est au centre de très nombreuses recherches au vu de sa position centrale dans de très nombreuses voies métaboliques. Une de ses fonctions essentielles est de contrôler l’homéostasie lymphocytaire, en maintenant en particulier les LT à l’état quiescent. C’est dans ce contexte que nous avons récemment mis en évidence les conséquences de l’inhibition de FOXO1 dans des LT primaires humains à l’aide d’un agent pharmacologique nouvellement identifié, l’AS1842856. Nos résultats montrent que cette drogue entraîne à elle seule la transition G0/G1 de ces cellules. Cette transition s’accompagne de modifications phénotypiques et fonctionnelles, qui suggèrent que la seule inhibition de FOXO1 induit une différenciation des LT en effecteur/mémoires, indépendamment de toutes autres stimulations. Nos données montrent de plus que l’AS1842856 permet à elle seule la réactivation de provirus VIH-1 latents. Cette réactivation a été observée dans deux modèles humains ou l’infection et la latence  ont été obtenus in vitro (modèle JLAT, LT primaire humain) et d’un modèle simien (cellules obtenus à partir de singe infectés par SIV et sous ART). Les objectifs de ce projet s’organiseront donc autour de trois grands axes : (i) valider le rôle de l’AS1842856 sur la réactivation ex vivo de formes virales silencieuses présentes dans les LT de patients infectés sous ART, (ii) identifier de potentielles synergies de l’AS1842856 avec des agents pharmacologiques dont l’activité sur la réactivation des provirus latents a déjà été décrite, (ii) évaluer la potentialisation de la réponse immune antivirale. Les résultats de notre projet permettront donc d’envisager que cette drogue soit un nouveau candidat thérapeutique, seul ou en association avec d’autres agents pharmacologiques, pour stimuler la réactivation des provirus latents présents dans les réservoirs viraux et potentialiser la réponse immune anti-VIH 1.

Près de 38 millions de personnes dans le monde sont infectés par le virus de l’immunodéficience humaine (VIH). Face à cette pandémie, des traitements antirétroviraux existent, auxquels certains patients deviennent cependant résistants. Le but de notre projet est d’identifier des inhibiteurs d’une nouvelle cible thérapeutique, la capside du VIH-1 (p24VIH-1), avec un coût de production limité car le prix élevé des traitements est un frein à leur accès dans de nombreux pays.

Des expériences préliminaires nous ont permis d’identifier, parmi les composés à faible coût de synthèse de la chimiothèque de l’équipe partenaire, deux molécules capables d’inhiber la réplication du VIH-1 in cellulo. L’une de ces deux molécules, le composé 696, est apparue comme se fixant dans la zone de la capside du VIH-1 ciblée par le lenacapavir, le premier médicament anti-VIH-1 ciblant p24VIH-1 à avoir vu son usage thérapeutique autorisé par l’Agence Européenne du Médicament en août 2022.

En parallèle, un criblage virtuel assisté par un algorithme d’intelligence artificielle (IA) a permis d’identifier 84 molécules se fixant dans cette même zone et donc candidats inhibiteurs du VIH-1. Nous avons testé dix de ces 84 molécules in cellulo, ce qui nous a permis d’observer que deux d’entre elles présentent un potentiel inhibiteur intéressant.

Pour ce projet, nous allons terminer le criblage in cellulo des molécules identifiées par IA in silico. Nous allons également synthétiser des dérivés du composé 696 à faible coût de synthèse, visant à améliorer l’interaction avec p24VIH-1, qui seront ensuite criblés in cellulo. Tous les composés qui auront été identifiés comme inhibiteurs in cellulo seront alors évalués de façon plus approfondie, notamment par des études structurales, pour comprendre leur mécanisme moléculaire d’inhibition. Ceci permettra des optimisations des molécules tête de série qui permettent d’améliorer leur interaction avec p24-VIH1, en gardant comme objectif un coût minimal de synthèse. Tous ces dérivés seront alors synthétisés puis testés in cellulo de façon systématique.

Ainsi, ce projet permettra d’identifier des candidats inhibiteurs prometteurs et à faible coût de synthèse ciblant la capside du VIH-1.

Depuis la découverte du VIH comme agent causal du SIDA en 1983, un long chemin a été parcouru dans la compréhension de la réplication du virus ce qui a permis le développement d’antiviraux efficaces. Bien que nous soyons aujourd’hui capable de limiter la transmission du virus et l’évolution de la maladie, la présence d’un réservoir viral archivé au sein des cellules du patient ainsi que les problèmes de résistance aux traitements posent de vrais problèmes de santé publique. Les procédures actuelles de suivi des mutations de résistance sont basées sur la technologie Sanger, standard très largement accessible, peu coûteuse et ne nécessitant que de très peu de ressources informatiques. La limite technologique du séquençage à quelques centaines de bases oblige la mise en place de réactions indépendantes multiples pour couvrir toutes les régions d’intérêts, et ne permet de distinguer que les formes majoritaires. A l’inverse, les technologies de séquençage nouvelle génération permettent de faire un séquençage du génome entier avec une très grande profondeur de lecture à partir de fragments de petites tailles (150 bases). Toutefois, l’accès aux variants minoritaires se fait ici au sacrifice du cout et de la lourdeur de l’analyse bio-informatique qui en découle. Ces technologies ont également été employées avec succès pour étudier les sites d’intégration du virus dans le génome cellulaire. Cependant, c’est un procédé lourd (grand nombre d’étapes de biologie moléculaire) et seule une petite fraction des sites d’intégration sont in fine analysables du fait même de la technologie. En effet, la petite taille des fragments ne permet pas de séquencer plus de quelques dizaines de bases du génome humain. Il est alors extrêmement difficile de repositionner sans ambiguïté le site d’intégration, notamment lorsque celle-ci se trouve dans des régions répétées du génome humain.

Le projet présenté propose de mettre en place une méthodologie permettant de séquencer le provirus en seulement quelques étapes simples, rapides et peu couteuses (moins de 2 heures contre plus de 3 jours actuellement). Pour cela, nous proposons d’associer la technologie Nanopore de séquençage de grands fragments à un procédé d’enrichissement basé sur le ciblage par la Cas9 sans aucune étape d’amplification et seulement une étape de purification. Cette méthode doit permettre de produire des données de séquençage génome entier associé à une identification sans ambiguïté du site d’intégration. Ce nouveau procédé de séquençage direct (sans amplification PCR) devrait de plus permettre d’accéder au statut de méthylation de l’ADN proviral archivé et de son environnement cellulaire. Ces données impossibles à obtenir actuellement sont clés pour comprendre la dormance virale. Ce développement technologique permettra donc à tout un chacun de faire le séquençage soit même en quelques heures et avec seulement très peu d’investissement financier pour une avancée majeure dans l’étude de la latence virale, de la relation intégration/cancer, et peut-être de se rapprocher de l’objectif « Cure HIV ».

Le Sida est caractérisé par une perte des lymphocytes T CD4 suite à l’infection, mais surtout une mauvaise qualité de la réponse immune et un état d’activation chronique du système immunitaire ainsi qu’une inflammation chronique et un épuisement du système immunitaire. Parmi les patients vivants avec le VIH (PVVIH) sous traitement anti-viral (TARV) qui ont été traités en phase chronique avec un niveau de LT CD4 bas (< 200 ou 350/mm3 selon les définitions), on identifie le groupe défini comme « bons répondeurs » immunologiques au TARV qui se caractérise par une bonne reconstitution immune et un nombre de LT CD4 > 500/mm3. En revanche, un autre groupe est défini comme « moins bons répondeurs » immunologiques car leur système immunitaire n’arrive pas à se reconstituer correctement et présente un nombre de LT CD4 < 500/mm3 malgré le TARV. Ces deux groupes, caractérisés par une histoire d’infection prolongée avant la mise sous TARV sont différents sur des aspects immunologiques : le groupe « moins bons répondeurs » immunologiques au TARV présente une inflammation et une activation immune significativement supérieures à celle présente chez les « bons répondeurs ».

Le lien entre l’infection virale, l’inflammation, l’activation immune et l’immunométabolisme est de plus en plus évident avec l’apparition de plusieurs études élucidant ce lien.

Les cellules immunes dont les lymphocytes T (LT) se caractérisent par des signatures métaboliques spécifiques au niveau énergétique qui contrôlent leurs fonctions cellulaires à travers l’engagement de voies de signalisation et de métabolites nécessaires à leur fonction au niveau de l’activation, la prolifération, la différenciation, la polarisation et la production des cytokines. Aujourd’hui, multiples travaux montrent que les LT CD4 de PVVIH avec ou sans TARV présentent des défauts métaboliques avec un switch vers la voie glycolytique aérobique pas très bénéfique à long terme pour la cellule. En revanche, beaucoup d’informations nous manquent actuellement sur l’origine de ces défauts bioénergétiques, leur caractérisation au niveau des sous-populations LT CD4 et les conséquences des modulations métaboliques sur les fonctions des cellules immunes. En plus, nos travaux réalisés récemment sur les LT CD4 de rhésus macaques VIS+ en phase chronique mettent en évidence ces défauts bioénergétiques au niveau des LT CD4 périphériques. Nos travaux montrent que les LT CD4 majoritairement non infectés présentent des défauts majeurs de la phosphorylation oxydative (OXPHOS), voie principale pour produire l’énergie dans les cellules T naïfs et mémoires. En plus, on montre que ces défauts sont liés à la perte de la protéine OPA1 et de la mitofiline, deux piliers de la structure et morphologie mitochondriale. Ces défauts étaient plus drastiques chez les singes VIS+ à progression rapide que chez les singes VIS+ à progression lente.

Les principaux objectifs de ce projet seraient de chercher le rational de nos observations sur le modèle VIS des primates non humain (PNH) chez des PVVIH sous TARV avec deux profils immunologiques complémentaires, des « bons répondeurs » versus des « moins bons répondeurs », en comparaison avec des sujets sains : I) la présence de défauts bioénergétiques au niveau des LT CD4 qui serait à l’origine de ces différences immunologiques, II) A comprendre les origines de ces défauts et leurs conséquences sur les fonctions immunes, et enfin III) A proposer en ex vivo et in vitro une reprogrammation énergétique bénéfique pour les cellules par des métabo-modulateurs pour retrouver les bonnes signatures énergétiques et rétablir une bonne fonction immune des LT CD4. Cela permettra plus tard d’utiliser les signatures bioénergétiques définis pour détecter des PVVIH qui peuvent évoluer vers des profils de « moins bons répondeurs immunologiques » et leur proposer une reprogrammation métabolique bénéfique pour les transformant en profile de « bons répondeurs immunologiques » en renforçant leur reconstruction immunologique.

En 2019, la population d’enfants non infectés exposés au VIH (HEU) a atteint 15,2 millions. Cette population continuera de s’accroître, avec près d’un million d’enfants nés de mères infectées par le VIH (HEU) chaque année. Les données récentes montrent que les HEU sont en moins bonne santé que les enfants non infectés et non exposés au VIH (HUU), sans que les mécanismes sous-jacents qui expliquent cette différence essentielle ne soient clairement établis. La plupart des femmes vivant avec le VIH tombent enceintes alors qu’elles suivent déjà un traitement antirétroviral, exposant ainsi les HEU aux antirétroviraux maternels (ARV) et au VIH, de la conception à la naissance. Ces HEU peuvent par la suite continuer d’être exposés à la fois aux ARV maternels et au VIH par le biais du lait maternel, et à leur propre régime ARV prophylactique, le cas échéant. Cette situation a d’ailleurs incité Powis et Siberry à plaider en faveur d’un suivi à long terme des HEU, indépendamment de leur exposition au VIH/ARV.

De nombreuses déficiences chez les HEU pourraient être liées à des dysfonctionnements mitochondriaux. Les signes cliniques des mitochondriopathies pédiatriques, principalement associés à des troubles neuromusculaires, neurologiques et du développement neurologique, pourraient recouper les dysfonctionnements observés chez ces enfants. Par ailleurs, l’exposition au VIH est connue pour modifier l’activité mitochondriale et les ARV induisent une instabilité de l’ADN mitochondrial (ADNmt).

La génotoxicité mitochondriale a été étudiée depuis de nombreuses années chez les HEU, les études se concentrant principalement sur le nombre de copies d’ADNmt par cellule (MCN). La plupart de ces études ont fait état d’un MCN inférieur chez les HEU par rapport aux HUU. Outre ce résultat, l’intégrité de la molécule d’ADNmt, c’est-à-dire les mutations ponctuelles et les grandes délétions (délétome), peut également être altérée dans le contexte de l’infection par le VIH, bien que les données pédiatriques soient rares et obtenues à partir de techniques non quantitatives. 

Avec le Centre national de référence des maladies mitochondriales (Angers), nous avons eu accès à un outil de diagnostic robuste combinant une approche de séquençage de nouvelle génération et un algorithme original d’analyse des séquences. Dans une étude préliminaire, nous avons établi les profils du délétome et de mutations ponctuelles de l’ADNmt dans le sang total de 32 HEU âgés de 7 jours. Nous avons observé que 24 des 32 enfants (75%) avaient des molécules d’ADNmt délétées, avec un taux d’hétéroplasmie, c’est-à-dire la coexistence de molécules d’ADNmt de type sauvage et de molécules d’ADNmt délétées au sein d’une cellule, allant de 0,01% à 84%. Étant donné que ces molécules ne peuvent pas être réparées et continuent de s’accumuler tout au long de la vie, il est nécessaire de procéder à une caractérisation complète de la génotoxicité mitochondriale chez les enfants HEU, qui tienne compte des expositions actuelles au VIH et aux ARV.

Nous profiterons du projet PROMISE-EPI en cours, de phase II/III, qui recrute des paires mère-enfant pour évaluer une intervention de secours de prévention de la transmission mère-enfant du VIH. Nos objectifs spécifiques visent à décrire la toxicité mitochondriale chez des HEU, des enfants non infectés non exposées et des enfants séropositifs au cours de la première année de vie, à évaluer l’innocuité des différents régimes de PrEP et à déterminer si les délétions de l’ADN mitochondrial sont héritées verticalement ou acquises de novo après l’exposition.

La génotoxicité mitochondriale sera évaluée en mesurant le MCN, le délétome de l’ADNmt, le pourcentage d’hétéroplasmie et la présence de mutations ponctuelles.

La sécurité est la priorité absolue pour les interventions de prévention visant un grand nombre de personnes. Bien que les effets néfastes à long terme de l’exposition aux ARV pour la PTME restent mal identifiés, ce projet contribuera à l’étude des mécanismes potentiels qui expliqueraient la santé des HEU, c’est-à-dire l’association entre la génotoxicité mitochondriale et l’exposition au VIH/ARV.