Projets et candidats lauréats

La transmission hétérosexuelle de l’homme à la femme est la principale voie de transmission des infections sexuellement transmissibles (IST) et se produit via les muqueuses du tractus reproducteur féminin (TRF). Le TRF est composé d’un tractus supérieur et d’un tractus inférieur qui diffèrent par leur architecture. Le tractus inférieur du TRF (vagin/endocol) est composé d’un épithélium pluristratifié contrairement au tractus supérieur. Différents facteurs environnementaux sont présents dans le TRF, notamment le sperme, suite à un rapport hétérosexuel, et le microbiote vaginal. Le sperme est l’un des principaux vecteurs des IST et est composé de facteurs capables d’inhiber ou d’augmenter la susceptibilité aux IST dans le TRF. La composition du microbiote vaginal peut influencer l’inflammation locale, entraînant une modulation de la susceptibilité aux IST. Chlamydia trachomatis (CT) est une bactérie à Gram négatif, responsable d’une IST, qui infecte principalement les cellules épithéliales cervicales. CT induit une inflammation locale qui peut entraîner des séquelles graves, notamment l’infertilité.

Les modèles in vitro simples composés d’une monocouche de cellules sont très utiles pour comprendre le rôle de facteurs dans un environnement spécifique, cependant, ces modèles ne tiennent pas compte de l’environnement complexe d’un tissu. La muqueuse du TRF est un environnement composé de différents types de cellules mais aussi de facteurs solubles qui interagissent les uns avec les autres, par conséquent, de nouveaux modèles capables de reproduire l’environnement in vivo sont nécessaires. De nouveaux modèles sont actuellement disponibles, tels que les modèles d’épithélium en 3D, les organoïdes ou les organes sur puces.

EpiVaginal est un modèle composé d’un épithélium pluristratifié obtenu à partir de cellules épithéliales primaires de donneurs sains. Il s’agit d’un modèle commercialisé auquel des fibroblastes et des cellules de Langerhans peuvent être ajoutés. Ce modèle peut produire du mucus, du glycogène et réagir à la stimulation hormonale. Des études sur la santé du TRF (microbiote, sperme ou infection par le VIH-1) ont été réalisées à l’aide de ce modèle. Ce modèle pourrait être très utile pour mieux comprendre les facteurs pouvant inhiber ou favoriser la susceptibilité aux IST.

Les objectifs de ce projet sont donc d’établir et de valider un modèle EpiVaginal en 3D adapté à l’infection par CT et à l’évaluation de l’effet des facteurs environnementaux sur la susceptibilité aux IST. Tout d’abord, le modèle EpiVaginal sera caractérisé pour évaluer l’architecture globale, la production de glycogène, la perméabilité et la polarisation de l’épithélium, les marqueurs cellulaires et la production de mucus. Une fois le modèle validé, l’infection par CT sera réalisée à différentes doses. L’infection sera suivie par immunofluorescence et qPCR, tandis que la production de cytokines sera mesurée dans les surnageants apicaux et basolatéraux. Ensuite, l’effet du liquide séminal (LS), la fraction acellulaire du sperme, sera testé sur l’infection CT et l’inflammation. Par la suite, le modèle EpiVaginal avec les cellules de Langerhans sera utilisé en chambre double pour étudier l’infection par le VIH-1. En effet, les PBMC seront ensemencées dans le compartiment basolatéral. La perméabilité de la barrière épithéliale, l’infection par le VIH-1 et la concentration en cytokines seront évaluées.

Ce projet nous permettra de valider ce modèle en tant qu’outil précieux pour l’étude de l’infection à CT et de l’impact des facteurs environnementaux tels que le sperme ou la composition du microbiote vaginal sur l’infection à CT et/ou au VIH-1.

Malgré des efforts considérables, la tuberculose (TB) reste un problème majeur de santé publique. Il n’existe toujours pas de vaccin efficace contre la TB et des souches de Mycobacterium tuberculosis (MTB) multirésistantes aux antibiotiques, c’est-à-dire résistantes aux deux médicaments antituberculeux de première ligne, la rifampicine et l’isoniazide, continuent d’émerger. La TB sensible aux médicaments peut être guérie en associant jusqu’à 4 antibiotiques pendant 6 mois. Toutefois, il est plus difficile de guérir la TB multirésistante (MDR-TB) et ultrarésistante, qui nécessite jusqu’à deux ans de traitement avec des médicaments de deuxième et de troisième intention plus toxique et plus coûteux, souvent avec un succès limité. De nouvelles stratégies sont nécessaires de toute urgence pour prévenir l’émergence de la résistance aux antibiotiques, raccourcir la durée du traitement et limiter les effets secondaires. Outre le développement de médicaments antituberculeux « classiques » ciblant des facteurs clés de la physiologie de MTB, des approches dirigées contre l’hôte sont apparues comme une stratégie prometteuse pour compléter les antibiotiques existants ou à venir. MTB manipule les voies de signalisation de l’hôte pour affaiblir l’immunité innée et adaptative. Il pourrait donc être possible de reprogrammer le système immunitaire de l’hôte afin de mieux contrôler, voire de tuer, MTB. Les facteurs liés à l’hôte peuvent également influencer la pharmacocinétique et la pharmacodynamique des médicaments antimicrobiens, affectant ainsi leur efficacité et/ou leur toxicité. La combinaison d’antibiotiques avec des molécules ciblant l’hôte pour améliorer leur efficacité est donc très prometteuse pour améliorer le traitement des infections bactériennes, y compris la TB.

Nous proposons ici d’utiliser une combinaison d’approches immunologiques et d’imagerie à haut débit pour identifier des composés dirigés contre l’hôte qui pourraient améliorer l’efficacité des antibiotiques contre la TB.

Nos objectifs sont les suivants

1. i) Identifier des molécules qui pourraient améliorer l’efficacité de la bédaquiline et du linézolide, deux médicaments utilisés pour traiter des patients atteints de MDR-TB qui ne répondent pas au traitement ou de XDR-TB. Nous identifierons ces composés en criblant dans des macrophages humains infectés par MTB, une bibliothèque de composés approuvés par la Food and Drug Administration américaine ou testés dans des essais cliniques de phase I, à l’aide de la microscopie confocale automatisée à haut débit.
2. ii) Caractériser in vitro les mécanismes moléculaires des molécules les plus prometteuses identifiées ci-dessus.

Étant donné que ce projet identifiera de nouveaux facteurs de l’hôte et composés chimiques capables de potentialiser l’efficacité des antibiotiques, les résultats de ce projet auront un impact important et un potentiel translationnel élevé. Ils pourraient permettre le développement de stratégies innovantes pour combattre les infections bactériennes au-delà de la TB.

Le VHD est un virus à ARN singulier, satellite du VHB car il utilise les protéines d’enveloppe de ce dernier pour sa propagation. La co-infection VHB/VHD, par rapport à VHB seul, est à l’origine des formes les plus agressives d’hépatite virale, pouvant aboutir au développement rapide d’une cirrhose et à une incidence plus élevée du carcinome hépatocellulaire. Le traitement de l’infection chronique par le VHD est actuellement restreint à l’interféron alpha dont l’efficacité et la tolérance sont médiocres. L’utilisation du bulevirtide, un inhibiteur d’entrée, a été récemment approuvée en Europe, mais nécessite une injection sous-cutanée quotidienne. De nouvelles molécules antivirales sont nécessaires pour espérer un traitement plus simple et efficace d’une majorité de patients.

Le VHD ne code que pour une seule protéine, l’antigène delta, existant sous une forme courte (HDAg-S) et longue (HDAg-L). La sécrétion des virions dépend de l’interaction entre l’HDAg-L et la protéine de surface HBs du VHB, cette interaction étant elle-même dépendante de la farnésylation de l’HDAg-L. Le farnésol est un métabolite intermédiaire de la première partie de la voie de synthèse du cholestérol appelée voie du mévalonate. Les inhibiteurs de la farnesyl-transferase (comme le lonafarnib, qui est en phase 3 de R&D) ainsi que les statines (qui inhibent l’HMG-CoA-reductase, une enzyme de la voie du mévalonate) ont montré un effet antiviral sur la sécrétion du VHD. Cependant, l’impact sur le VHD des autres enzymes et métabolites intermédiaires de la voie du mévalonate n’est pas décrit. Par ailleurs, notre équipe a montré que les ligands de FXR, le récepteur nucléaire des acides biliaires, inhibaient fortement la sécrétion et surtout l’infectivité spécifique des particules virales du VHD. De façon intéressante, le farnésol a été le premier ligand identifié de FXR et les acides biliaires sont synthétisés à partir du cholestérol, suggérant des liens étroits entre la voie du mévalonate et des acides biliaires.

Les objectifs de ce projet sont donc 1) d’étudier l’impact de l’ensemble des réactions enzymatiques de la voie du mévalonate, et donc de leur inhibition sur la sécrétion et l’infectivité du VHD, permettant d’identifier de nouvelles cibles ayant un effet antiviral, 2) de mieux comprendre les liens entre les voies du mévalonate et des sels biliaires et de déterminer si le mode d’action des ligands de FXR est lié à une modulation de cette voie, en particulier de la synthèse du farnésol, 3) de tester l’impact sur la réplication et la sécrétion du VHD de combinaisons associant notamment des modulateurs de la voie du mévalonate et des ligands de FXR.

Une lignée cellulaire dérivée de cellules Huh7 exprimant HBs et l’HDAg-L couplé à un tag permettant de quantifier sa sécrétion dans le surnageant des cellules infectées a été établie dans l’équipe. Elle permettra d’étudier de façon simple l’impact sur la sécrétion du VHD de modulateurs chimiques de la voie du mévalonate ainsi que l’impact de l’extinction ou de la surexpression des enzymes. Ce modèle a déjà permis d’identifier une molécule d’intérêt (nommée APY2 dans ce projet) qui inhibe la sécrétion de l’HDAg-L dans le surnageant sans impact sur la sécrétion d’HBs, suggérant une possible inhibition de la farnésylation de l’antigène delta.

Après l’identification de cibles d’intérêt, leur impact sur le virus sera confirmé dans les modèles infectieux in vitro les plus pertinents, i.e. les cellules HepaRG différenciées et les hépatocytes primaires humains. Les combinaisons les plus intéressantes seront testées également sur un modèle de souris à foie humanisé.

Des analyses métabolomiques, notamment ciblées sur la voie du mévalonate, seront réalisées pour analyser l’impact des ligands de FXR, de la molécule candidate APY2 ainsi que d’éventuelles nouvelles cibles d’intérêt.

Ce projet sur 3 ans permettra de mieux comprendre les liens entre la voie du mévalonate, le métabolisme des acides biliaires et le cycle de réplication et de sécrétion du VHD, et d’identifier de nouvelles molécules et combinaisons avec un effet antiviral dans l’infection par le VHD.

Mycobacterium tuberculosis (Mtb), l’agent infectieux responsable de la tuberculose, tue chaque année 1,5 millions de personnes. L’antibiothérapie actuelle, administrée par voie orale, est contraignante, longue et entraîne de nombreux effets indésirables. Avec l’émergence de souches résistantes aux antibiotiques et les faiblesses de la thérapie orale, il est urgent de développer un traitement plus efficace. Dans ce projet de recherche, nous proposons d’administrer par aérosolisation des nanoparticules originales à base d’oligosaccharides (poly-beta-cyclodextrines ou pβCD) et/ou de PLGA (polymère d’acide lactique et d’acide glycolique) chargées avec une combinaison d’antibiotiques adaptée. Ce projet ambitieux est interdisciplinaire et repose sur de solides preuves de concept.

Nous avons démontré que l’encapsulation d’antibiotiques dans ces pβCD et leur administration directement dans les poumons, augmentait considérablement l’efficacité du traitement en faveur de l’administration par voie orale chez la souris. De plus, nous avons découvert que ces particules « nues » (en l’absence d’antibiotique) avaient la particularité intrinsèque d’améliorer les défenses de l’hôte et donc de diminuer la charge bactérienne. Les nanoparticules de PLGA permettront l’encapsulation des médicaments qui ne présenteront pas d’affinités avec les pβCD. Nous avons aussi montré que les PLGA utilisées dans ce projet étaient principalement internalisée par les macrophages (cellules réservoir de Mtb) et qu’elles s’y accumulaient préférentiellement lorsque la cellule était infectée. Cela renforce le rôle de vecteur d’antibiotiques pour ces molécules.

Dans le cadre de ce projet, nous souhaitons identifier la combinaison de molécules/nanoparticules idéale qui permettra une diminution drastique de la charge bactérienne pulmonaire pour un minimum d’administrations. Nous proposons de créer des nanoparticules mixtes entre PLGA et pβCD dans le but d’optimiser la combinaison de molécules incorporée tout en conservant l’activité antibactérienne intrinsèque des pβCD. Dans ce contexte nous allons aussi optimiser et caractériser au niveau moléculaire et cellulaire l’effet antibactérien des pβCD.

L’absence d’un modèle animal pleinement immunocompétent capable de soutenir la réplication du virus de l’hépatite C (VHC) et de reproduire la pathobiologie spécifique induite par ce virus a empêché l’étude approfondie des interactions complexes entre le virus et l’hôte, ainsi que des pathologies associées à la persistance virale tout au long de la vie.

Le présent projet tire parti d’un modèle animal de substitution basé sur l’infection de rats Sprague Dawley non consanguins par un hepacivirus de rongeur apparenté au VHC, que les équipes A, B et C ont récemment mis en place grâce au soutien du groupe de travail AC42 « métabolisme lipidique » et d’un contrat d’initiation attribué par ANRS|MIE. Les résultats préliminaires ont montré un taux élevé d’infections chroniques dans un petit groupe de rats et ont révélé des troubles métaboliques marqués 30 semaines après l’infection, notamment des troubles du métabolisme lipidique dans le foie des animaux présentant une infection chronique.

L’objectif de ce projet est d’utiliser ce modèle animal de substitution pour caractériser de façon approfondie ces troubles métaboliques induits par les hepacivirus au cours de l’infection chronique avec un groupe de rats plus important, et évaluer comment une combinaison de l’infection chronique par un hepacivirus et un régime riche en matières grasses et sucres (régime occidental) peut aggraver ces pathologies.

Ce projet est original car de telles études n’ont jamais été possibles avec le VHC. Le RHV-rn1 présente de nombreux atouts qui étayent sa pertinence en tant que modèle de substitution efficace pour le VHC chez l’homme, comme nous l’avons montré, ainsi que d’autres équipes. De plus, les collègues qui ont établi ce modèle d’infection par le RHV-rn1 en premier lieu aux États-Unis et qui ont généreusement partagé l’ADNc viral avec nous ne poursuivent pas d’études de pathobiologie utilisant ce modèle.

En collaboration avec deux autres équipes apportant une expertise complémentaire, nos objectifs spécifiques sont les suivants :

• Décrire les troubles du métabolisme des lipides survenant dans le foie des rats infectés chroniquement grâce à des investigations histologiques et biochimiques des sections/extractions de tissu hépatique, ainsi que par des analyses lipidomiques/métabolomiques détaillées et non ciblées des foies infectés par rapport aux foies non infectés. [WP1]
• Déterminer l’incidence du régime occidental en combinaison avec l’infection par l’hepacivirus sur le développement des troubles métaboliques du foie. [WP2]
• Identifier les voies hépatiques fortement dérégulées en réponse à l’infection par le RHV en utilisant le séquençage ARN haut débit comparatif des foies infectés par rapport aux foies non infectés. Utiliser la fluxomique pour comprendre comment le virus détourne le métabolisme des cellules hôtes. [WP3]
• Prédire la meilleure combinaison de molécules antivirales à action directe (AAD) du VHC qui soit susceptible d’être efficace contre la réplication du RHV par le biais d’analyses in silico, et évaluer son efficacité d’abord dans des modèles de culture cellulaire, puis in vivo, afin de préparer le terrain pour une analyse ultérieure de la persistance putative des troubles métaboliques après la guérison. [WP4]

Certains aspects de ces questions seront également étudiés, le cas échéant, en parallèle dans des cellules d’hépatomes de rat infectées par le RHV ou dans des hépatocytes primaires de rats infectés ex vivo.

Il est attendu que ce projet fournisse des informations précieuses sur les mécanismes moléculaires et les signatures des troubles du métabolisme lipidique associés aux hepacivirus et à la stéatose hépatique non alcoolique, ainsi que sur la possibilité que de telles comorbidités mixtes puissent se potentialiser. De plus, en utilisant ce modèle de substitution in vivo / ex vivo hautement pertinent, ce projet ouvrira la voie à d’éventuelles études ultérieures sur l’évolution de la pathologie hépatique dans le contexte de l’élimination de l’hepacivirus par les antiviraux actuellement prescrits, lorsqu’ils sont utilisés à un stade avancé de la maladie.

La tuberculose (TB), causée par la bactérie Mycobacterium tuberculosis (Mtb), reste l’une des maladies infectieuses les plus meurtrières au monde. TB est responsable de 1.6 million de décès par an au niveau mondial. Cette situation est aggravée par l’augmentation constante et alarmante du nombre de cas de tuberculose multi- et ultra-résistante, avec près d’un demi-million de cas de ce type en 2021 selon le rapport de l’OMS (Global Tuberculosis report 2022). La force de Mtb réside dans sa capacité à survivre dans un état dormant dans les macrophages et dans les granulomes de l’hôte, puis à se réactiver dans des conditions favorables. Dans cet état dormant, la plupart des fonctions biologiques de Mtb sont ralenties, expliquant en partie la perte d’efficacité des antibiotiques. Dans ce contexte, il est urgent d’identifier de nouvelles cibles, pertinentes dans les états actif et dormant de Mtb, pour le développement de nouveaux traitements contre la TB. Les protéines contenant des centres fer-soufre (Fe-S), protéines essentielles dans divers processus biologiques (régulation de la transcription, réparation de l’ADN, métabolisme central, bioénergétique, synthèse de cofacteurs,…), constituent une famille de cibles attrayante. Le génome de Mtb contient environ 60 cadres de lecture ouverts codant pour des protéines Fe-S putatives, ayant des fonctions importantes dans les états actif et dormant de Mtb. Parmi ces protéines, les protéines WhiB utilisent leur centre Fe-S comme senseur redox pour détecter les signaux de stress rencontrés au cours de l’infection et ajustent le métabolisme de Mtb pour survivre aux conditions difficiles dans les macrophages et les granulomes, permettant de rentrer en dormance. Un moyen intéressant de cibler toutes les protéines Fe-S de Mtb en même temps serait de cibler la voie responsable de la biogenèse des centres Fe-S chez Mtb. En général, les bactéries ont plusieurs systèmes de biogenèse des centres Fe-S (ISC, SUF et/ou NIF). De façon intéressante Mtb a un seul système, le système SUF. Ce système est absent chez l’homme, où l’assemblage des centres Fe-S est réalisé par d’autres machineries. Le système SUF de Mtb est essentiel à la croissance in vitro de Mtb dans des conditions normales et a été montré comme étant un point de vulnérabilité de Mtb. De plus, le système SUF est induit dans des conditions de carence en fer, situation rencontrée par le pathogène lors de l’infection. De même, le système SUF de Mtb est régulé à la hausse dans des conditions de stress nitrosant et oxydant, facteurs de stress de la réponse immunitaire innée. Collectivement, ces données soulignent l’importance de la biogenèse et du métabolisme des centres Fe-S pour le cycle de vie de Mtb et renforcent l’hypothèse selon laquelle cibler le métabolisme des centres Fe-S dans Mtb via le système de leur biogenèse (SUF) est pertinent pour le développement de nouveaux médicaments anti-TB. Cibler le système SUF par des inhibiteurs aura d’abord un effet pléiotropique sur la capacité de Mtb à synthétiser les 60 protéines à centre Fe-S. Ensuite, cette approche désarmera Mtb en altérant sa capacité à synthétiser des centres Fe-S pour détecter les signaux de stress environnementaux, via les protéines WhiB. L’inactivation de WhiB empêchera la bactérie de s’adapter pour entrer en dormance. Le projet « FeSMtb » propose d’explorer la faisabilité d’utiliser la voie SUF de Mtb comme cible pour lutter contre la tuberculose. A cette fin, une partie du projet « FeSMtb » consistera à valider le caractère essentiel du système SUF dans la pathogénicité de Mtb. Une autre partie sera dédiée à la caractérisation structurale et fonctionnelle des protéines SUF. Une troisième partie se focalisera sur l’identification d’inhibiteurs du système SUF de Mtb, par le biais d’une approche de criblage sur cellules entières de mycobactéries ; inhibiteurs qui serviront de bases pour le développement futur de médicaments. Le projet sera réalisé en utilisant une combinaison d’approches expérimentales comprenant la génétique et la physiologie des mycobactéries, la biochimie, la spectroscopie, la biologie structurale, les modèles in vitro et in vivo de l’infection par Mtb.

Les déficits immunitaires primitifs (DIPs) consistent en un large éventail de maladies héréditaires provoquant une susceptibilité infectieuse. Outre les infections, des manifestations dys-immunes mal-définies, telles qu’une lymphoprolifération chronique, la survenue d’une auto-immunité ou des manifestations inflammatoires de divers organes, y compris du foie, sont fréquentes. Ces hépatites chroniques représentent un problème médical sérieux, souvent diagnostiqués tardivement car évoluant de façon indolente. L’hyperplasie nodulaire régénérative (HNR) définie par une transformation nodulaire du parenchyme hépatique avec une infiltration fréquente de cellules T CD8+ intra-lobulaires fait partie du spectre des complications hépatiques dys-immunes dont la physiopathologie n’est pas bien définie. Elles surviennent de façon fréquentes chez les patients avec déficit humoral et en particulier les patients avec déficit immunitaire commune variable (DICV). Nous avons récemment décrit une pathologie hépatique similaire chez des patients atteints de déficit immunitaire combiné sévère ayant bénéficié d’une greffe de cellules souches hématopoïétiques (GCSH) ou d’une thérapie génique (GT). Par diverses études OMICs (séquençage métagénomique de nouvelle génération (mNGS), phénotypage par cytométrie de masse (CyTOF), séquençage de l’ARN en cellule unique), nous avons montré que cette pathologie était associée à i) une infection chronique à virus entérique (virus Aichi, Norovirus, Sapovirus) ii) une infiltration de cellules T CD8+ intra-lobulaire dans le foie et des images d’HNR iii) une expansion de cellules effectrices mémoires T CD8+ activées, non cytotoxiques, non épuisées iv) une forte signature interféron de type I et II retrouvées au niveau des leucocytes circulants et v) un déficit humoral persistant. Enfin, nous avons montré que cette pathologie, que nous avons appelée EVAH (enteric viral-associated hepatitis), était réversible après une seconde GCSH concomitante à l’élimination virale et la reconstitution immunitaire. Nous faisons l’hypothèse qu’un processus similaire pourrait expliquer les maladies hépatiques, y compris l’HNR, qui surviennent dans d’autres DIPs et en particulier dans les déficits en anticorps (DICV, agammaglobulinémie liée à l’X, déficits immunitaires combinés mais aussi déficits humoral acquis dans le cadre de thérapeutique immunosuppressive).  Dans le cadre du projet EVAHDAR, nous souhaitons apporter une description détaillée de l’EVAH avec 3 objectifs i) évaluer les patients à risque de développer cette complication dans les déficits humoraux héréditaires et acquis en recherchant les virus entériques à l’aide du mNGS (dans les selles, l’urine, le plasma et les biopsies d’organes le cas échéant), dans un grand groupe de patients présentant des signes compatibles d’EVAH et de patients asymptomatiques homologues (individus avec DIPs appariés EVAH-) ii) déterminer la relation de cause à effet entre la maladie hépatique et l’infection chronique par un virus entérique par la détection in situ du virus (hybridation in situ et/ou immunohistochimie) et l’évaluation de la spécificité des cellules T CD8+ anti-virales iii) caractériser les cellules T CD8+ et les autres sous-populations leucocytaires en réalisant un phénotypage immunitaire approfondi par CyTOF chez tous les patients EVAH+ et les individus EVAH- appariés et en réalisant un transcriptome sur lymphocytes T CD8+ triés de patients EVAH+, d’individus PIDs appariés et de contrôles sains. En conclusion, EVAHDAR aidera à décrypter la physiopathologie de la maladie hépatique chez les patients présentant des déficits en anticorps, à établir le lien avec l’infection chronique par un virus entérique et à ouvrir la voie à de futurs traitements.