Projets et candidats lauréats

Introduction
Entre 257 à 291 millions de personnes dans le monde sont chroniquement infectées par le virus de l’hépatite B (HBV), entraînant plus de 820 000 décès par an. Les décès sont principalement le résultat d’une inflammation du foie entraînant une fibrose hépatique, une cirrhose et un carcinome hépatocellulaire. Les traitements actuels sont limités aux inhibiteurs de polymérase (analogues de nuclos(t)ides) et à l’interféron alpha pégylé (PEG-IFN-a), qui contrôlent l’infection mais la guérison est rare. Par conséquent, de nouvelles stratégies thérapeutiques contre le HBV son nécessaires. L’antigène de capside core du HBV est une cible antivirale pertinente en raison de ses nombreuses
fonctions dans le cycle viral. Notamment, les modulateurs d’assemblage de capside (CAM) se lient directement à core et inhibent l’assemblage des particules virales. Les CAM sont divisés en deux familles : la classe A et la classe E. Les composés de classe A (CAM-A) induisent la formation de structures aberrantes et l’agrégation de core, tandis que les composés de classe E (CAM-E) induisent la formation de capsides vides mais morphologiquement intactes. Nous avons observé que le traitement avec le CAM-A RG7907 induit l’élimination des hépatocytes exprimant core en induisant l’agrégation de core dans le noyau, l’apoptose des hépatocytes et la prolifération cellulaire dans un modèle murin AAV-HBV et dans différents modèles cellulaires. De plus, nous avons observé la modulation de la réponse immunitaire innée suite au traitement CAM-A. Nos observations préliminaires suggèrent un nouveau mode d’action des molécules de type CAM-A. Cependant, les mécanismes détaillés à l’origine de l’apoptose et de l’activation de la réponse immunitaire innée sont inconnus. Nous avons émis l’hypothèse que l’agrégation de core après le traitement par CAM-A module l’expression des protéines entraînant l’apoptose et induit la réponse immunitaire innée dans les cellules répliquant le VHB.

Méthodes
Nous tirerons parti des cellules HepG2 exprimant core permettant l’accumulation suffisante d’agrégats core lors du traitement CAM-A pour identifier les moteurs de l’apoptose. De plus, nous souhaitons confirmer l’apoptose et l’activation de l’immunité innée dans des cellules HepaRG différenciées infectées par le HBV lors du traitement à long terme par un CAM-A. Nous visons enfin à étendre nos observations à un panel de CAM appartenant à la fois aux chimiofamilles HAP et non-HAP, afin d’élucider si l’apoptose est liée à la structure CAM ou à l’agrégation de core en soi.

Objectifs
L’objectif de ce projet sera d’élucider ce mode d’action dans des modèles d’infection authentiques et d’identifier les moteurs de cette mort cellulaire dépendante de l’agrégation centrale après un traitement CAM-A. Concrètement, nos objectifs sont :
1) APOPTOSE. Validation de protéines candidates dérégulées en tant que moteurs de l’apoptose médiée par l’agrégation de core dans les cellules exprimant core et dans des modèles d’infection par HBV.

2) IMMUNITÉ INNÉE. Décrypter l’activation de l’immunité innée et le rôle des protéines candidates lors de l’agrégation de core en présence du génome du HBV.

3) PREUVE DE CONCEPT IN VIVO. Nous souhaitons valider ces résultats dans des souris chimériques infectées par le VHB.

Conclusions
Les résultats de notre programme feront progresser la compréhension de l’infection par le HBV en identifiant un nouveau mécanisme d’action antivirale pour les molécules CAM-A qui pourraient aider à adapter la durée du traitement, conduisant potentiellement à l’élimination des cellules infectées après in fine. Les résultats de ce programme ouvriront la voie à une approche multimodale pour éradiquer cette menace majeure pour la santé mondiale.

De nouvelles stratégies sont nécessaires pour infléchir de manière significative la courbe d’incidence de la tuberculose humaine dans le monde. Il faut pour cela mieux comprendre comment l’agent pathogène évolue pour échapper et/ou survivre à l’intervention humaine (vaccination ou traitements antibiotiques). Une grande quantité de données génomiques sur les bacilles de la tuberculose a été obtenue grâce au développement du séquençage à haut débit. Ces données ont permis d’explorer l’évolution de ces pathogènes et d’identifier des gènes soumis à une sélection adaptative qui façonnent l’évolution récente de Mycobacterium tuberculosis (MTB), le principal agent de la tuberculose.  Parmi eux, le gène phoR subit une forte sélection positive. Ce gène code pour la protéine senseur du système de régulation à deux composants PhoPR, un acteur majeur de la pathogénicité de MTB. PhoPR contrôle l’expression de plus de 80 gènes en réponse à des stimuli intracellulaires, tels que le pH acide ou le zinc. Les pressions responsables de la sélection de mutations dans phoR et l’impact de ces mutations sur l’activité du système PhoPR et l’interaction avec l’hôte restent inconnus. Nous émettons l’hypothèse que l’acquisition de mutations dans PhoR permet d’affiner l’interaction hôte-pathogène afin d’augmenter les chances de survie et de transmission et/ou contribue à accroître la capacité de la bactérie à survivre à de nouvelles pressions sélectives telles que la vaccination BCG ou les traitements antibiotiques.

Nous proposons ici d’aborder ce problème et de répondre à plusieurs questions importantes : 1) Quel est le moteur de l’évolution de PhoR chez MTB ? 2) Quelle est l’activité des variants de PhoR sélectionnés ? 3) Quel est l’impact de ces variants de PhoR sur l’interaction avec l’hôte ?

Tout d’abord, nous allons créer une collection de souches recombinantes isogéniques à code-barres exprimant des variants de PhoR. Ces variants ont été sélectionnés parce qu’ils sont apparus indépendamment à plusieurs reprises dans des isolats cliniques de MTB. Nous ajouterons également des variants PhoR présentant de fortes différences dans leur capacité à reconnaître le signal et à activer le régulon PhoP (sur la base de nos résultats antérieurs). Nous réaliserons ensuite une série d’expériences de compétition in vitro et in vivo afin d’évaluer l’aptitude des souches recombinantes au cours du cycle infectieux, d’un traitement antibiotique ou chez un hôte vacciné. Ces expériences nous informeront sur l’impact de ces pressions sélectives sur les souches recombinantes exprimant ces variants PhoR. Deuxièmement, nous caractériserons l’effet des mutations trouvées dans ces variants sur l’expression du régulon PhoP et la réponse aux conditions inductrices. Enfin, nous étudierons l’impact de ces variants de PhoR sur la cinétique de croissance chez l’hôte et la capacité à induire des lésions pulmonaires dans un modèle murin pertinent.

Cette proposition est très innovante car elle aborde la question des adaptations fonctionnelles sélectionnées au cours de l’infection d’un hôte, qu’il soit naïf, vacciné ou traité avec des antibiotiques. Cette question est d’une importance majeure mais reste jusqu’à présent inexplorée. Ce projet s’appuie 1) sur l’expertise du groupe dirigé par C. Guilhot, 2) sur les plates-formes technologiques de pointe de l’Institut de Pharmacologie et de Biologie Structurale de Toulouse, 3) ainsi que sur des résultats préliminaires solides. Les résultats attendus devraient permettre de mieux comprendre l’évolution des bacilles de la tuberculose et l’impact de cette évolution sur l’interaction hôte-pathogène.

Notre objectif est de concevoir une nouvelle approche pour le traitement de la tuberculose basée sur des particules poreuses pour l’inhalation, contenant des nanoconjugués innovants. Un nanoconjugué d’acide pyrazinoïque (PZA) et de poly(acide malique) associé au mannose sera synthétisé pour cibler spécifiquement les macrophages et délivrer l’antibiotique au niveau intracellulaire de manière contrôlée. Les nanoconjugués seront testés pour leur efficacité sur des macrophages infectés. Après administration intratrachéale chez la souris saine des nanoparticules sous formes de particules poreuses, les concentrations de PZA et de prodrogue seront déterminées par CLHP-SM dans le sang total, le plasma, le lavage bronchoalvéolaire (surnageants et macrophages alvéolaires) et le tissu pulmonaire. L’efficacité antituberculeuse et le devenir des nanoconjugués, seront évalués sur des souris infectées. Nous attendons de cette stratégie qu’elle ouvre une nouvelle voie au traitement de la tuberculose.

Evaluation d’un programme d’accompagnement adaptatif, multidisciplinaire et hors les murs, facilitant l’accès à la prescription de la prophylaxie de préexposition au VIH (PrEP) et la rétention dans le système sanitaire, au sein d’un groupe de femmes trans (FT) avec un risque élevé d’infection VIH.

Rationnel :

Malgré des taux élevés de prévalence du VIH, peu d’efforts et d’interventions préventives ont ciblé la population de FT.

Dans le but d’améliorer les programmes de dépistage et de prévention du VIH parmi la population trans, une convention a été établie entre l’association ACEPTESS-T, accueillant des personnes trans, et le Service des Maladies Infectieuses et Tropicales (SMIT) de l’hôpital Bichat à Paris.

L’étude PrEP à porter propose un service holistique et intégral favorisant la collaboration interdisciplinaire entre personnel de santé hospitalier, médiateurs/trices de santé et représentantes communautaires trans, sociologues psychologues et assistantes sociaux avec le but de créer un circuit de santé innovant et inclusif, centré sur la demande des usagers.

Méthodologie :

Étude de recherche opérationnelle avant et après, mono bras, mono centrique, nationale, que se déroule en 2 phases.

La première phase pilote de l’étude (phase 1, actuellement en cours) consiste en une cohorte de suivi des FT sous PrEP via le circuit multidisciplinaire et hors les murs.

Avec l’équipe interdisciplinaire, dans la phase 1 de l´étude les FT sont invitées à participer activement à la conceptualisation du service (via la réalisation de focus groups et des entretiens individuels), dans le but d’identifier les obstacles et les facilitateurs à l’accès à la PrEP et à la rétention dans le système de santé. L’objectif est de co-créer des solutions sur mesure qui répondent aux besoins de cette population et qui soient en même temps réalisables et compatibles avec l’offre de soin du système sanitaire publique.

Les nouvelles solutions pour faire face aux barrières à la PrEP sont analysées à la fin de la phase 1 et une nouvelle stratégie avec l’implémentation du service holistique est proposée en phase 2 de l´étude.

Objectifs :

L’objectif principal est d’observer une augmentation du taux de rétention dans le soin des FT prises en charge pour la PrEP dans le Service des Maladies Infectieuses de l’Hôpital Bichat à S48 avant et après l’application d’un nouveau protocole d’implémentation de la stratégie préventive centré sur la demande des usagères. Une augmentation de 40 points du taux de rétention à S48 de la phase 2 est attendue.

Objectifs secondaires :

1. Décrire les caractéristiques cliniques et épidémiologiques de la population de l´étude.
2. Évaluer l’observance thérapeutique à la PrEP
3. Évaluer la tolérance à la PrEP
4. Évaluer les traitements concomitants (incluant le traitement hormonal substitutif)
5. Évaluer le nombre de séroconversion VIH
6. Évaluer l’incidence des infections sexuellement transmisses
7. Explorer les difficultés, les barrières et les attentes des participantes de l’étude sur leur utilisation de la PrEP
8. Explorer les critères de précarité de la population de l’étude
9. Explorer l’acceptabilité du dispositif multidisciplinaire par la population de l´étude
10. Mesurer la satisfaction des participantes

Taille de la population : 100 participantes

Echéancier :

Inclusions des participantes : 12 mois (10/10/2022-09/10/2023)

Phase 1 (24 mois) : 10/10/2022-09/10/2024

Phase 2 (24 mois) : 10/10/2024-10/10/2026

Chez les eucaryotes, la traduction est un processus dynamique et rapide qui est régulé à la fois par la structure intrinsèque de l’ARN et de nombreuses protéines cellulaires qui se fixent sur l’ARNm. Contrairement au mécanisme de traduction procaryote, la sous-unité 40 S ne peut pas se lier directement sur l’ARN et l’attachement a lieu par le biais d’interactions ARN-protéines qui se mettent en place grâce à un ensemble de 12 facteurs d’initation (eIFs pour eukaryotic Initiation Factors). La sous-unité 40 S du ribosome associée à ces facteurs d’initiation constitue le coeur d’un vaste complexe macromoléculaire auquel se joint de nombreuses autres protéines de liaison à l’ARN pour former le complexe de préinitiation. Celui-ci a une composition variable en fonction de l’ARN considéré ce qui module sa fonction et lui permet de s’adapter aux contraintes structurelles que l’on trouve chez certains transcrits.

L’initiation de la traduction chez les eucaryotes, qu’elle soit opérée à partir de l’extrémité 5’ (coiffe-dépendante) ou en position interne (IRES-dépendante) consiste à attirer et lier le complexe de préinitiation sur l’ARNm afin qu’il puisse parcourir la région 5′ non traduite (5’UTR) pour accéder au codon AUG. Lorsqu’il arrive sur le site initiateur, ce complexe de préinitiation est dissocié pour permettre la liaison de la sous-unité 60 S du ribosome et constituer le ribosome 80S; celui-ci va ensuite parcourir la phase codante pour produire la protéine d’intérêt. L’étape d’initiation est l’étape limitante et elle détermine le taux de production protéique global de l’ARN concerné. A ce titre, l’initiation de la traduction est un processus extrêmement régulé et contrôlé à la fois par la structure de l’ARNm et la composition du complexe de préinitiation.

L’ARN génomique du VIH-1 est traduit dans le cytoplasme de la cellule infectée par la machinerie cellulaire de l’hôte et code pour les polyprotéines Gag et Gag/Pol. Il commence par une coiffe (guanosine méthylée-m7GTP) qui est suivie par une longue région 5′ non traduite (5’UTR) de 336 nucléotides qui contient de nombreux motifs complexes d’ARN dont la tige boucle TAR, le PBS, les signaux de dimérisation (DIS) et d’encapsidation (Psi). L’initiation de la traduction de l’ARNg est particulière puisqu’elle peut s’opérer à la fois à partir du 5′ de l’ARN (mécanisme coiffe-dépendant) ou sur 2 séquences IRES distinctes qui se trouvent dans la région 5’UTR (IRES1) et au début de la phase codante pour Gag (IRES2). Il est donc possible de recruter 3 complexes de préinitiation sur l’ARNg mais on ne sait pas si ces complexes peuvent se former simultanément ou si leur assemblage est mutuellement exclusif. On ne connait pas leur composition protéique ni leur dynamique d’assemblage au cours de la progression du cycle viral ou de l’état physiologique de la cellule hôte. En revanche, on sait qu’ils ont une composition variable en fonction de leur site de recrutement sur l’ARN.

Les objectifs de ce projet sont de cartographier et identifier la composition de ces complexes d’initiation sur leurs sites d’assemblage, c’est à dire à l’extrémité 5′ de l’ARN (coiffe/TAR) ou au niveau des 2 IRES afin de mieux comprendre comment s’articule la traduction du VIH-1. Pour ce faire, nous utiliserons la technique récente de biotinylation de proximité en combinaison avec un système d’édition de type CRISPR/Cas13 pour cibler des régions précises de l’ARN génomique. Cela permettra de cartographier les interactions protéines-protéines et déterminer le réseau complexe de ces interactants dans un rayon d’environ 10 nm autour des sites d’initiation.

L’infection chronique par le virus de l’hépatite B (VHB) est l’un des facteurs de risque majeur du développement du carcinome hépatocellulaire (CHC). Chez des porteurs chroniques du VHB, la sévérité des lésions hépatiques varie considérablement, allant de lésions hépatiques minimes à une hépatite chronique active qui peut évoluer vers une cirrhose et le développement d’un CHC. Nos précédents travaux ont mis en évidence l’existence d’un épissage alternatif des transcrits viraux et sa régulation en fonction du degré de l’atteinte hépatique. Cette régulation par épissage alternatif contribue à la synthèse de la protéine HBSP que nous avons identifié au laboratoire. Nos travaux antérieurs ont montré que l’expression de cette protéine module la voie de signalisation du TNFα, entrainant une inhibition de l’inflammation et la fibrogenèse hépatique dans un modèle de souris transgénique. Par contre in vitro, l’extinction ou la surexpression de cette protéine virale n’a pas mis en évidence d’impact sur la transcription virale. L’avènement récent des modèles d’infection par le VHB in vitro et l’exploration de l’ensemble du cycle viral a révélé un impact de l’expression de la protéine HBSP sur les étapes post-transcriptionnelles du VHB. 

Notre projet de recherche a pour but d’une part de caractériser l’impact de la protéine HBSP sur la réplication virale et au cours de la pathogenèse hépatique et d’autre part d’identifier les mécanismes impliqués.

            Ces travaux seront réalisés à l’aide de particules virales sauvages (HBSP+) et mutés (HBSP-) recombinantes du VHB dans des modèles d’infection in vitro et des modèles de souris transgénique exprimant la protéine HBSP ou le génome complet du VHB. Des résultats préliminaires obtenus à l’aide de ces modèles expérimentaux mettent en évidence que la protéine HBSP contribue d’une part à la réplication virale et à l’expression des protéines du VHB et d’autre part module la carcinogenèse hépatique. Une approche protéomique quantitative et comparative de cellules infectées par le VHB exprimant ou non cette protéine nous permettra d’évaluer l’impact de la protéine HBSP sur les étapes post-transcriptionnelles du cycle viral et de préciser les mécanismes impliqués. Un de ces mécanismes pourrait résulter de la capacité d’interaction de la protéine HBSP avec la protéine d’échafaudage Rack1, son principal partenaire, récemment identifié. Nous explorerons le statut de Rack1 in vitro et in vivo. Nous développerons également des outils capables d’interférer sur cette interaction protéique et évaluerons l’impact de cette interférence à la fois sur la réplication virale et durant de la pathogenèse hépatique.

L’ensemble de nos travaux permettra de mieux comprendre du rôle de la protéine HBSP du VHB au cours de l’histoire naturelle de l’infection virale et pourrait conduire au développement d’une  nouvelle approche thérapeutique de la pathogenèse hépatique.