Projets et candidats lauréats

L’infection par le VIH-1 requière l’intégration du génome viral dans des conditions permettant une transcription optimale. Le site d’intégration, l’association du complexe d’intégration à l’ADN nucléosomal ainsi que l’environnement chromatinien entourant le site d’intégration vont définir le devenir du provirus et son état transcrit ou latent. Ces dernières années, de nombreuses observations suggèrent un lien entre le processus d’intégration et les machineries transcriptionnelles cellulaires. L’interaction entre le domaine carboxy-terminal (CTD) de l’intégrase (IN) et l’ARN génomique viral a été notamment décrite. Or, des mutations au niveau des résidus du CTD sujets à acétylation et impliqués dans cette interaction présentent des effets sur la transcription des gènes viraux intégrés et non sur l’intégration tout en affectant la stabilité et la présence de l’enzyme sur le site après intégration. De plus, l’interaction entre ces résidus du CTD de l’IN et l’élément ARN viral TAR influence l’interaction in vitro entre cet élément et la protéine virale TAT et, ainsi, pourrait affecter la transactivation des gènes viraux soulignant un lien direct entre l’IN et la transcription. Les multiples fonctions du CTD de l’IN suggèrent que ce domaine constituerait un pivot dans les processus intégratifs et post-intégratifs et participerait, notamment, à la transactivation des gènes viraux médiée par la protéine TAT.

Alors que les étapes pré-intégratives et intégratives sont bien documentées l’ensemble de ces évènements post-intégratifs n’est pas connu. Le devenir du complexe d’intégration après l’intégration, le mécanisme et la chronologie de sa dissociation du site et les facteurs de l’hôte impliqués restent inconnus. Notre projet visera à dévoiler l’ensemble de ces évènements post- intégratifs et mettre à jour le rôle pressenti de l’IN dans ces événements. L’objectif principal de notre projet sera donc de dévoiler les liens fonctionnels existant entre intégration et transcription et, en particulier, le rôle du domaine CTD de l’IN en définissant comment l’intégration peut influencer la transcription des gènes viraux intégrés et comment la machinerie transcriptionnelle rencontrée par le complexe d’intégration sur le site d’insertion peut moduler le processus d’intégration. Nous répondrons aux questions suivantes : i) l’IN influence-t-elle la transcription des gènes intégrés, ii) la machinerie transcriptionnelle est-elle requise pour une bonne intégration ou une bonne réparation du site et notamment est-ce que l’ARN TAR transcrit sur le site est impliqué dans la dissociation du complexe post-intégratif, iii) quels sont les facteurs associés spécifiquement au complexe post-intégratif dans les régions transcriptionnelles ciblées par le VIH-1, iv) comment interférer avec ces évènements post-intégratifs impliquant l’IN et les ARN en identifiant les premiers composés chimiques ciblant ces phases précoces post intégratives.

Les données préliminaires obtenus dans notre équipe consolident fortement l’hypothèse d’implication des ARN et de TAR dans les étapes de désassemblage post-intégratives aboutissant à la libération du site. Les mécanismes moléculaires impliqués, le rôle de l’acétylation dans la régulation de ce processus, la démonstration de ce mécanisme dans un contexte cellulaire et l’identification des possibles autres partenaires cellulaires requis dans ce processus constitue les objectifs de notre projet. Pour cela nous i) confirmerons l’importance des processus de transcription pour l’intégration du VIH-1, ii) étudierons le processus moléculaire de dissociation du complexe d’intégration par les ARN et TAR par des approches biochimiques et biophysiques, iii) identifierons les facteurs cellulaires associés à la machinerie transcriptionnelle qui pourraient interagir avec le complexe post-intégratif et iv) sélectionnerons les premiers composés ciblant les phases post-intégratives impliquant l’IN et l’ARN.

L’infection chronique par le virus de l’hépatite B (VHB) augmente considérablement les risques de développer des maladies sévères du foie tel que le carcinome hépatocellulaire. Bien qu’efficaces pour maintenir l’infection sous contrôle, les traitements actuels ne permettent pas d’éradiquer le virus du fait de la persistance du minichromosome viral, l’ADNccc (circulaire clos de façon covalente). Il est donc absolument essentiel de développer de nouvelles thérapies ciblant directement cet épisome. L’interaction complexe entre le VHB et le système immunitaire de l’hôte crée un micro-environnement hépatique inflammatoire responsable des lésions du foie et du développement du cancer. Cette interaction est régie par la production de cytokines/chemokines à partir des hépatocytes ou des cellules immunitaires. Une meilleure compréhension de cette interaction intercellulaire est donc primordiale afin de ralentir significativement la progression de la maladie. Le stress du réticulum endoplasmique (RE) est une des voies de signalisation contrôlant la production de cytokines et est communément activée lors de maladies hépatiques. En particulier, le VHB, de par la production de protéines virales, induit cette voie de stress responsable d’une sécrétion plus importante de l’interleukin-8 (CXCL8), décrite pour attirer des cellules immunitaires. De manière intéressante, l’environnement pro-inflammatoire augmente la proportion de variants d’épissage du VHB, en particulier peu de temps avant l’apparition du cancer. Ce processus co-transcriptionnel génère une vingtaine de variants dont certains codent des protéines décrites pour moduler l’interaction avec le système immunitaire montrant un rôle prépondérant dans la pathogenèse induite par le VHB.

Nous avons identifié les hélicases à ARN DDX5 et DDX17 comme des régulateurs clés de l’épissage du VHB dans des cellules hépatiques primaires ou cancéreuses. Leur déplétion est notamment associée à l’induction du variant SP17 qui semble produire une nouvelle protéine virale que nous avons appelée HBc-P. De manière frappante, l’induction de ce variant et potentiellement de cette protéine est associée à l’induction d’un stress du RE et l’augmentation de l’expression de CXCL8.

L’objectif de ce projet sera donc d’établir un lien fonctionnel entre la production de HBc-P, l’induction du stress du RE et la production de cytokines pro-inflammatoires telle que CXCL8. Après avoir confirmé la production de HBc-P à partir du variant SP17 après infection d’hépatocytes primaires humains par un fractionnement de polysomes, nous générerons un vecteur lentiviral nous permettant de surexprimer cette protéine dans ces cellules. L’induction du stress du RE sera monitoré par une approche de Nanostring nCounter avec un panel de gènes dédiés associée à des expériences de Western blot quantifiant des évènements liés à cette voie de signalisation. En parallèle, les cytokines seront quantifiées par Isoplexis et leur régulation par HBc-P sera validée par de nouvelles expériences d’ELISA.   

Dans le cas où ces résultats obtenus au cours de financement corroborent notre hypothèse, ce projet fournira les bases d’un projet plus large visant à 1) caractériser le lien fonctionnel entre SP17/HBc-P et le tress du RE dans des modèles in vivo, 2) suivre l’expression de SP17/HBc-P chez les patients au cours des différénetes étapes de l’hépatite B chronique et enfin 3) caractériser la contribution d’autres variants d’épissage du VHB à l’interaction entre les hépatocytes infectés et les cellules immunitaires à la fois dans des modèles in vivo et chez les patients. Ce projet éclairera donc davantage l’importance fonctionnelle des variants d’épissage au cours de l’hépatite B chronique et ouvrira la porte au développement de nouvelles stratégies thérapeutiques, ciblant notamment le stress du RE, stratégie déjà employée contre des maladies hépatiques telle que la MASLD et dont des drogues ciblant cette voie sont actuellement en essais cliniques.  

l est désormais bien établi que la communication bidirectionnelle entre les systèmes immunitaire et nerveux joue un rôle clé dans l'initiation et le développement des réponses de l'hôte aux infections et autres signaux de danger. Le rôle du système nerveux dans la réponse de l'hôte à la tuberculose (TB) n'a pas encore été élucidé. Nous avons récemment fait l'observation que des cellules b3-tubuline (TUBB3)+ (un marqueur pan-neuronal) sont présentes dans les poumons de souris infectées par Mycobacterium tuberculosis (Mtb) à proximité des granulomes. Leur présence corrèle avec l'incidence de l'inflammation tissulaire. Grâce à un contrat d'initiation (ANRS CI ECTZ242543), nous savons maintenant que des cellules neuronales TUBB3+ sont également présentes dans les granulomes pulmonaires chez les primates non humains infectés par Mtb et chez les patients atteints de TB. De plus, nous pensons que ces cellules sont d'origine nerveuse sympathique autonome en raison de la colocalisation, au moins en partie, avec la tyrosine hydroxylase (TH), un marqueur des neurones sympathiques. Ces cellules neuronales TUBB3+ modifient-elles la progression de la TB ? Ou est-ce que la présence de ces cellules dans les lésions tuberculeuses sont le reflet d'un rôle physio-pathologique inexploré et insoupçonné du système nerveux sympathique autonome dans cette infection pulmonaire ? Ces questions nous encouragent aujourd’hui à poursuivre nos recherches sur ce sujet passionnant. Ainsi, le projet proposé visera à (i) caractériser ces nouvelles neuronales pulmonaires TUBB3+, notamment in situ dans les granulomes tuberculeux chez les souris infectées, grâce à différentes approches de pointe ; (ii) préciser l'origine, le recrutement et le processus de différenciation de ces cellules dans le poumon au cours de l'infection, en se concentrant sur deux hypothèses basées sur la manière dont le système nerveux sympathique infiltre les tumeurs solides, à savoir la neurogenèse et l'axonogenèse ; (iii) étudier les conséquences de la déplétion ciblée, par des approches chimiques et génétiques, des cellules TUBB3+ sur la dynamique des granulomes, la réponse immunitaire antimycobactérienne et la pathogénèse de la TB dans le modèle murin ; et (iv) établir une corrélation entre la présence de cellules neuronales TUBB3+ et la sévérité de la maladie dans des échantillons de poumons provenant de primates non humains infectés par Mtb et de patients tuberculeux. Ces résultats pourraient ouvrir une voie de recherche entièrement nouvelle dans le domaine de la neuroimmunologie de la TB, un domaine largement inexploré à ce jour.

Chlamydia trachomatis (Ct) est une bactérie intracellulaire obligatoire qui se développe principalement dans les cellules épithéliales. L'infection génitale à Ct, infection bactérienne sexuellement transmissible (IST) la plus courante en Europe, est particulièrement répandue chez les jeunes femmes et peut entraîner une stérilité tubaire et une grossesse extra-utérine. Les antibiotiques recommandés ne parviennent pas, chez certaines patientes, à éradiquer les formes "persistantes" de Ct. En outre, ils modifient profondément la flore naturelle du tractus génital, qui constitue une ligne de défense importante contre les infections par Ct et d'autres micro-organismes.

À la recherche de stratégies innovantes pour lutter contre les infections par Ct, nous avons décidé de cibler la capacité de Ct à détourner la machinerie épigénétique de l'hôte à leur avantage. Nous avons émis l'hypothèse que le blocage des modifications épigénétiques induites par Ct pourrait favoriser la défense de l'hôte contre l'infection et faciliter sa résolution par le système immunitaire. Un criblage de molécules ciblant les méthyltransférases agissant sur les histones ou l'ADN a permis d'identifier deux composés ayant une forte activité antimicrobienne contre Ct. Ces molécules n'affectent pas la croissance de trois autres bactéries testées, y compris des bactéries de la flore vaginale, ce qui indique qu'elles représentent des pistes prometteuses pour des traitements spécifiques contre Ct.

L'objectif du projet est d'étudier en profondeur les activités anti-Chlamydia de ces deux composés, A79 et C49, d'améliorer leur efficacité par optimisation chimique et de décrypter leur mode d'action.

Il associe une équipe experte en biologie de Chlamydia (équipe A) et une équipe experte en chimie médicinale de l'épigénétique (équipe B). Le projet nécessitera un va-et-vient continu entre les deux équipes, l'équipe B générant de nouveaux dérivés des composés, dont l'activité in vitro sera testée par l'équipe A jusqu'à l'obtention de composés optimisés qui seront finalement testés dans des modèles in vitro complexes et in vivo.

Ct suit un cycle de développement bi-phasique complexe et nous déterminerons quelle(s) étape(s) est (sont) affectée(s). Nous déterminerons si les molécules peuvent s'attaquer à la phase persistante de l'infection, soit en empêchant l'entrée ou le maintien des bactéries dans la persistance, soit en forçant leur sortie de la persistance. Grâce à des techniques de biologie chimique telles que la protéomique de profilage thermique, le pull-down chimique et la transcriptomique, nous révélerons la base mécaniste de l'activité anti-Ct des médicaments. Enfin, les composés biologiquement actifs optimisés seront testés dans des modèles cellulaires élaborés d'infection et dans des modèles murins d'infection à Ct. 

Ces travaux permettront de comprendre le mécanisme de la forte inhibition exercée par A79 et le C49 sur le développement de Ct in vitro. Ils permettront de déterminer si ces molécules peuvent s'attaquer aux formes persistantes de la bactérie et leur effet sur d'autres espèces de l'appareil génital féminin. La réalisation du projet permettra de déterminer si ces molécules, une fois optimisées, peuvent être développées en phase préclinique et en phase de développement de médicaments par le biais d'un partenariat industriel.

Les maladies du foie et les cancers posent d'importants problèmes de santé au niveau mondial, avec des taux de mortalité élevés et une incidence croissante. Les maladies chroniques du foie touchent jusqu'à 20 % de la population européenne et le cancer du foie est à l'origine de 800 000 décès dans le monde. Plusieurs facteurs contribuent notablement à cette augmentation de l'incidence, notamment l'hépatite virale. Malgré l'efficacité des antiviraux et des vaccins, l'infection chronique par le virus de l'hépatite B (VHB) reste un problème majeur de santé publique dans le monde entier et une cause majeure d'hépatocarcinome. La production de métabolites par le microbiote intestinal, notamment les acides gras à chaîne courte (AGCC), influence considérablement la défense de l'hôte contre les agents pathogènes et favorise les effets antitumoraux et immunomodulateurs qui s'étendent au-delà des sites intestinaux. Bien que des études aient observé la régulation à la baisse des bactéries bénéfiques productrices d'acides gras à chaîne courte associées à l'infection par le virus de l'hépatite B (VHB) au cours de l'hépatite et l'influence des acides gras à chaîne courte sur les voies de signalisation des hépatocytes, leurs effets multiples et leurs mécanismes complexes peuvent poser des limites à leur ciblage pour le traitement de l'hépatite virale et de ses séquelles. Dans ce contexte, notre objectif principal est d'élucider les mécanismes moléculaires par lesquels les acides gras à chaîne courte interfèrent avec la signalisation inflammatoire du foie pendant l'infection par le VHB et d'essayer de corréler leur rôle dans la progression de la maladie hépatique chronique induite par le VHB. À cette fin, nous procéderons d'abord à une exploration approfondie des données transcriptomiques et protéomiques disponibles dans notre laboratoire, afin de découvrir de nouvelles informations sur la dynamique de l'expression génique et les réseaux de régulation associés aux voies des acides gras à chaîne courte (AGCC). Afin d'étendre et de valider la pertinence biologique des AGCC, et en émettant l'hypothèse que la réduction de leurs niveaux systémiques pourrait servir de biomarqueur pour la progression de la maladie du foie due au VHB, nous visons à évaluer leurs niveaux systémiques dans le sérum d'une cohorte établie de patients atteints de VHB chronique à différents stades de la maladie.

L’étude BADASSE (BActériolical DAtura Sub StudiEs) est une sous-étude bactériologique de l’essai DATURA (Determination of Adequate TUberculosis Regimen in Adults and adolescents hospitalised with HIV-associated severe immune suppression). DATURA a pour objectif d’évaluer la possibilité de réduire la mortalité de la tuberculose chez les personnes vivant avec le VIH par grâce à une intensification du traitement antituberculeux. BADASSE vise à identifier les déterminants bactériens du succès et de l’échec du traitement antituberculeux chez les patients inclus dans DATURA. Nous allons étudier en détail la sensibilité aux antibiotiques avec une caractérisation phénotypique (mesure précise de concentrations minimales inhibitrices (CMI) des antituberculeux de première et seconde ligne) et génotypique (séquençage complet du génome et analyse par Deeplex). L’objectif principal de l’étude est d’identifier des caractéristiques bactériennes corrélées à l’issue du traitement (CMI, mutations impliqués dans le résistome ou le tolérome bactérien). L’objectif secondaire est de caractériser la sensibilité aux antituberculeux de seconde ligne du régime BPaLM (bédaquiline, prétomanide, linézolide, moxifloxacine) qui est le standard du traitement des tuberculoses à bacilles multitrésistants pour évaluer la possibilité de l’utiliser dans cette population de tuberculoses à bacilles présumés sensibles. Ainsi l’étude BADASSE permettra d’identifier des marqueurs bactériens pronostiques pour les PVVIH ayant une tuberculose et permettra d’évaluer la faisabilité du régime BPaLM pour les cas de TB à bacilles sensibles dans les pays de l’étude DATURA.

Les thérapies antirétrovirales suppriment efficacement la virémie chez les personnes vivant avec le VIH (PVVIH), mais elles échouent à éliminer la population virale non réplicative cachée dans des cellules dites « réservoirs » dans un état qu’on appelle « latent ». Ces provirus latents représentent un obstacle significatif à l'éradication du VIH. Il est donc crucial de comprendre les mécanismes qui contrôlent activement et négativement l'expression du VIH-1 pour ouvrir la voie vers l'éradication du VIH. Nous avons récemment identifié un nouveau mécanisme de répression d’expression génique chez les mammifères qui inhibe l'expression du VIH-1 aux niveaux transcriptionnels et post-transcriptionnel : Le complexe HUSH, en collaboration avec CNOT1, peut induire une répression épigénétique du provirus intégré et promouvoir la dégradation de l'ARN dirigée par le LTR du VIH-1 au niveau post-transcriptionnel. Bien que le complexe HUSH réprime le VIH-1 dans certains modèles cellulaires de latence du VIH-1 et que sa fonction repose sur l'activité de l'ARN polymérase 2, nos résultats suggèrent que CNOT1 utilise un autre mécanisme que celui de HUSH. Empêcher l’expression de CNOT1 conduit à l’augmentation d’expression du provirus VIH-1 dans tous les modèles cellulaires de latence que nous avons examinés. Nos découvertes montrent que CNOT1 cible spécifiquement une région du LTR 5’ du VIH-1. Nous envisageons donc de décrire les mécanismes de mise en latence du VIH-1 par CNOT1. À travers des études protéomiques ciblées et des techniques génomiques avancées, nous identifierons le protéome associé à CNOT1 au site de répression du LTR du VIH-1 et éluciderons comment CNOT1 est recruté, avec quels cofacteurs il collabore pour la répression épigénétique/transcriptionnelle, et les mécanismes qu'il utilise pour induire la dégradation de l'ARN issu du LTR. Cette étude devrait fournir des informations cruciales sur la régulation du mécanisme de répression d’expression du LTR du VIH-1 et pourrait offrir une nouvelle stratégie pour cibler le réservoir du VIH-1 pour l'élimination par l’approche « Shock&Kill ».