Projets et candidats lauréats

Aujourd’hui, les personnes vivant avec le VIH sous traitement antirétroviral efficace ont une espérance de vie proche des personnes non infectées par le virus. En France, 4% des PVVIH sont âgés de 70 ans et plus et cette proportion va augmenter dans les décennies à venir. Cependant les comorbidités associées à l’âge, en particulier les maladies cardiovasculaires, l’ostéoporose, les troubles métaboliques, hépatiques, rénaux, fractures osseuses et certains cancers sont plus fréquentes dans un contexte d’exposition au VIH, d’immunodépression, d’exposition prolongée à certains ARV, de polymédications et de mode de vie à risque plus importants. Dès lors, une approche de prise en charge globale présente l’intérêt de pouvoir réduire l’apparition d’évènements de santé péjoratifs et la perte d’autonomie chez les personnes âgées vivant avec le VIH. Le dépistage de la fragilité, syndrome gériatrique caractérisé par une perte des réserves physiologiques où la personne perd ses capacités d’adaptation au stress permettrait de détecter précocement les sujets à risque et de construire des programmes d’interventions de santé du fait de la réversibilité de cet état.

C’est dans ce contexte que s’est inscrite l’étude ANRS EP66 SEPTAVIH, étude prospective, multicentrique, nationale dont l’objectif initial était d’évaluer la prévalence de la fragilité chez les PVVIH âgés de 70 ans et plus et d’étudier la faisabilité du dépistage via différents outils d’évaluation. Cette étude démarrée en mai 2019 a recruté 512 patients dans les 16 centres participants et prévoit un suivi sur 12 mois. Les données recueillies vont permettre d’identifier les facteurs de risque associés à la survenue d’évènements péjoratifs de santé à court terme comme les chutes graves, la diminution des capacités fonctionnelles, le recours aux soins non programmés et les institutionnalisations.

Nous souhaitons désormais proposer aux sujets inclus dans SEPTAVIH un suivi sur 5 ans. L’organisation d’un suivi long terme d’une population de PVVIH gériatrique en France nous permettra de disposer de suffisamment d’éléments pour identifier le ou les critères de fragilité les plus discriminants chez cette population émergente, ceci avec un rapport coût/efficacité favorable puisque l’évaluation initiale des PVVIH âgés a été très exhaustive, les patients se prêtent volontiers à l’évaluation et les équipes sont maintenant aguerries à l’évaluation des sujets âgés. Cela laisse présager d’un faible nombre de perdus de vue et d’une excellente qualité des données de suivi.  

Le suivi SEPTAVIH Long terme comprendra 1 visite par an pour un suivi total de 5 ans, correspondant aux visites annuelles de suivi de l’infection VIH. Ces visites seront complétées par une évaluation gériatrique simplifiée réalisée dans le service d’infectiologie.

Cette évaluation long terme contribuera ainsi à disposer de connaissances supplémentaires pour adapter les recommandations de prise en charge dans cette population particulière de PVVIH gériatriques. Elle permettra également de servir de base à la construction d’essais pragmatiques d’évaluation d’interventions ciblées pour prévenir/ralentir la perte d’autonomie dans cette population comme cela peut être observée en population générale.

A l’instar des lymphocytes T, les cellules myéloïdes apparaissent aujourd’hui comme des cellules essentielles lors du développement de la pathologie liée à l’infection par le VIH-1. Ces différentes cellules cibles du virus, les lymphocytes T mais aussi les macrophages (MFs), les cellules dendritiques (DCs) et les ostéoclastes (OCs), peuvent être infectées par transmission du virus de cellule à cellule. Ce mode de transmission jouerait un rôle essentiel lors de la transmission sexuelle au niveau des muqueuses mais aussi lors de la dissémination du virus dans l’organisme. En effet, des cellules myéloïdes infectées sont retrouvées dans tous les tissus, notamment dans le cerveau, mais aussi dans les os, où l’infection des OCs pourrait participer aux déficits osseux induits par le virus. La dissémination du virus par transfert de cellule à cellule est non seulement plus efficace que l’infection par du virus libre, mais elle permettrait également au virus d’échapper au système immunitaire et aux traitements antiviraux.  Cependant, les mécanismes impliqués dans ces processus de transfert viral intercellulaire sont mal connus. Notre équipe a récemment mis en évidence un transfert du VIH-1 rapide et efficace des lymphocytes T infectés vers les MFs via un processus de fusion en deux étapes (première fusion d’un lymphocyte T infecté avec un MF, puis fusion MF-MF), qui mène à la formation de cellules géantes multinucléées (MGCs) capables de produire de grandes quantités de virus.

Au vu de l’importance des cellules myéloïdes dans la pathologie du VIH-1 et de l’efficacité du transfert viral de cellule à cellule, il est primordial de mieux comprendre les mécanismes qui contrôlent la transmission du virus des lymphocytes T infectés vers les cellules myéloïdes. Ainsi, l’objectif de ce projet sera de caractériser les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans le transfert du VIH-1 vers les cellules myéloïdes (MFs, DCs et OCs).    

Dans une première partie, nous déterminerons in vitro, en utilisant des systèmes de co-cultures et des approches de microcopie sur cellules fixées et vivantes, si les OCs et les DCs sont infectés via les lymphocytes T infectés selon un processus de fusion en deux étapes comparables à celui décrit pour l’infection des MFs. De plus, nous déterminerons l’efficacité de cette voie de transmission dans des modèles d’explants humains (synoviaux et cervico-vaginaux) contenant des MFs, DCs et OCs tissulaires.

Le deuxième objectif sera d’étudier les mécanismes moléculaires impliqués dans ce processus de fusion en deux étapes. Nous nous focaliserons sur le rôle des protéines liées au cytosquelette d’actine, sur les voies de signalisation qui régulent l’actine et sur les protéines impliquées dans la fusion cellulaire. Pour cela, en parallèle des systèmes de co-culture, nous développerons un système microfluidique original permettant d’optimiser le couplage entre deux cellules d’une manière contrôlée, efficace et synchrone.

Enfin, le dernier objectif sera d’examiner les fonctions des MGCs infectés obtenues par ces processus de fusions cellulaires. En particulier, nous étudierons si la présence de matériel provenant des lymphocytes T dans les MGCs modifie leur phénotype et/ou leurs fonctions. Nous étudierons en particulier la phagocytose, la migration cellulaire et la dégradation de la matrice osseuse.   

Ce projet ambitieux est programmé sur une durée de 3 ans. Il bénéficie de la collaboration déjà solidement établie entre l’équipe de Serge Bénichou (Institut Cochin, Paris) et de Christel Vérollet de l’équipe d’Isabelle Maridonneau-Parini (Institut de Pharmacologie et Biologie Structurale, Toulouse).

Ce projet permettra de mieux comprendre le rôle des cellules myéloïdes dans la pathologie liée à l’infection par le VIH-1, au niveau de la transmission, de la dissémination du virus et de l’établissement des réservoirs viraux tissulaires. De plus, il pourrait permettre, à plus long terme, de développer de nouvelles approches thérapeutiques ciblées. 

Les virus ont développé différentes stratégies pour prévenir la réinfection des cellules productivement infectées. Ces mécanismes d’interférence virale ont probablement pour objectif d’éviter un stress additionnel qui pourrait induire la mort des cellules qui ont survécu à une première infection. Par la délétion de chaque gène viral, ou son expression isolée, nous avons montré précédemment que la protéine virale Rev est responsable de l’interférence virale indépendante des récepteurs, qui se met en place 18-24h post-infection par le VIH.

Notre but est de déterminer les mécanismes et les facteurs impliqués dans l’interférence virale médiée par Rev. Dans le cadre d’un projet actuellement soutenu par l’ANRS (jusqu’en mars 2019) nous avons déjà identifié les fonctions de Rev nécessaires pour l’interférence et l’étape du cycle réplicatif du virus qui est ciblée. Sur la base de nos résultats et des données de la littérature, notre objectif principal est de tester l’implication des facteurs viraux et cellulaires dans l’interférence médiée par Rev. De plus, nous souhaitons valider nos résultats dans des lymphocytes T-CD4+ primaires, et modéliser l’impact de l’interférence sur la propagation de l’infection par le VIH.

La caractérisation du mécanisme d’interférence nous permettra de mieux comprendre les interactions entre le virus et la cellule cible, et d’identifier des nouvelles approches pour réduire la susceptibilité des cellules, en profitant de stratégies virales.

Résumé:

Contexte et état actuel du sujet. L’infection chronique par le virus de l’hépatite C (VHC) est la cause majeure mondiale du carcinome hépatocellulaire (CHC). Alors que les antiviraux à action directe ont montré leur grande efficacité pour éradiquer le virus, plusieurs études cliniques ont reporté que les patients qui ont une maladie hépatique avancée demeurent des sujets à risque pour le CHC, et cela malgré l’absence du virus. A partir de nos observations montrant que les voies de signalisations intracellulaires demeurent anormales même après guérison du virus, ce projet vise à identifier les mécanismes moléculaires persistants qui sont associés au risque du CHC.

Résultats. Nous avons récemment démontré en utilisant les tissus de foie de patients, des modèles animaux, et des cultures cellulaires, que le VHC induit une altération de l’épigénôme ainsi que de l’expression des gènes, qui persiste au –delà de la disparition du virus (Hamdane et al. Gastroenterology 2019, Jühling et al. Gut 2020). Ces changements concernent la signalisation hypoxique et l’expression des gènes qui promeuvent le cancer du foie (Jühling et al. Gut 2020). Nos résultats suggèrent que le virus induit des changements épigénétiques persistants qui entrainent une progression de la maladie hépatique vers le CHC.

Objectifs. Notre objectif est de comprendre les mécanismes moléculaires induits par le virus qui causent des altérations épigénétiques responsables du CHC après élimination du virus, afin d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour prévenir le CHC. Plus précisément, nous souhaitons (1) identifier les composantes de la chromatine qui participent à l’altération induite par le virus, (2) analyser le rôle fonctionnel des voies hypoxique/stresse oxydative qui sont liées aux changements induits par le virus, et (3) valider l’importance clinique de ces découvertes à travers des modèles de souris humanisées de foie chimérique qui sont permissives au VHC, et de tissus hépatiques de patients infectés par le VHC.

Méthodologie. Dans l’objectif 1, nous allons réaliser un criblage non-biaisé pour identifier les composantes de la chromatine qui participent aux altérations induites par le VHC. Simultanément, nous allons analyser deux cibles spécifiques que nous avions identifié grâce à nos études antérieures. Celles-ci consistent en une histone méthyltransférase EZH2 et une histone-lysine N-méthyltransférase 2, encore appelée G9a. Dans l’objectif 2, nous allons utiliser le système cellulaire que nous avions employé pour étudier l’acétylation des histones pendant l’infection du VHC et après guérison, afin d’analyser le rôle du stresse oxydative induit par le VHC sur l’acétylation des histones. L’objectif 3 consiste à valider ces découvertes à l’aide des modèles in-vivo et ex-vivo dérivés du patient. Ce projet est innovant car (1) il clarifie le paradigme concernant le risque du CHC malgré l’éradication du VHC, et (2) il utilise les derniers modèles innovants combinés avec les méthodes avancées de biologie du système incluant les cultures cellulaires, les animaux, et les données cliniques.

Résultats escomptés et impact sur la santé publique. Nous estimons que l’analyse et l’identification des mécanismes moléculaires qui découlent de l’interaction du VHC avec la cellule hôte, ainsi que les validations in vivo et ex vivo, vont permettre de découvrir de nouvelles cibles thérapeutique pour la prévenir le CHC après la guérison du VHC constituant un besoin médical majeur au niveau mondial et non satisfait actuellement.

Bien qu’un vaccin soit disponible depuis 1982, le virus de l’hépatite B (VHB) reste un problème de santé mondial. Le VHB est un virus enveloppé dont les glycoprotéines (GP) d’enveloppe L, M et S sont respectivement composés des domaines PreS1/PreS2/S, PreS2/S et S. PreS1 est important pour la liaison au récepteur, NTCP, et aussi à la capside. Ces GPs ont une double topologie associée à différentes étapes du cycle de vie. La première topologie, dite « immature », correspond à PreS1 exposé à l’intérieur de la particule virale et semble importante pour l’assemblage du VHB via une interaction entre PreS1 et la capside. La deuxième topologie est appelée « mature », correspond à l’exposition de PreS1 à la surface du virus, ce qui permet la liaison de PreS1 au récepteur.

La mise en évidence du mécanisme de maturation des GP du VHB restent est importante pour comprendre comment le VHB devient infectieux au bon moment et au bon endroit afin éviter une « immobilisation extra-hépatique » ou d’échapper aux anticorps neutralisants.

Aussi, nous avons initié des analyses de coévolution des GPs des différents génotypes (Gt) pour sélectionner et caractériser des résidus d’intérêt pour la maturation et/ou le switch topologique des GPs. La plupart des séquences Gt-A/B/C possèdent une extension N-terminale de 11 résidus (appelée peptide +11AA) par rapport à la plupart du Gt-D. L’un des clusters de coévolution identifié présente 9 positions d’intérêt qui sont réparties sur les 3 domaines (PreS1, PreS2 et S) et qui co-varient avec la présence ou non du peptide 11AA. Dans des études préliminaires, nous avons étudié 2 positions de ce cluster qui sont situées dans PreS1 et qui ont été mutées dans Gt-D L GP (T18V et S19P) en plus d’y introduire les 11 premiers résidus de PreS1 du Gt-C, dans le but d’étudier la production de virions, l’infectivité, les essais de liaison à NTCP et la topologie des GPs. Alors que les virus exposant le peptide +11AA étaient moins infectieux que le WT, en accord avec des études précédentes, nous avons constaté que les particules virales possédant les mutations +11AA/T18V ou +11AA/S19P avaient une infectivité restaurée à des niveaux similaires au WT, ce qui était corrélé aux niveaux de liaison à NTCP. Pour mieux comprendre ces observations, nous avons réalisé une étude topologique des particules virales WT et mutantes. Nous avons constaté que, par rapport aux particules WT, les virions possédant le peptide +11AA présentaient un plus grand nombre de L GP immature, entraînant ainsi une exposition plus faible de PreS1 à la surface du virus, tandis que les virions avec la mutation +11AA/T18V présentaient une topologie similaire au WT. Nous avons donc conclu que le peptide 11AA ainsi que ce cluster de coévolution contenant la position 18 était important pour le switch topologique de L GP.

Ce projet a trois objectifs. Premièrement, nous poursuivrons l’analyse de la coévolution de la L GP et de la protéine Core du VHB, ou de la protéine L-HDAg du VHD, afin d’explorer la coévolution potentielle GPs et de la capside/ribonucléocapside et les résidus du cluster impliqués dans la maturation ou le switch topologique. Ensuite, nous explorerons les facteurs environnementaux qui pourraient réguler la maturation des GP. Plus précisément, nous nous concentrerons sur i) le pH et la charge des acides aminés, et des facteurs ioniques; ii) les facteurs du sérum ou sécrétés par les hépatocytes; et iii) les facteurs intracellulaires. Troisièmement, nous réaliserons des essais in vitro et in vivo pour étudier la cinétique de maturation des virions et comprendre le lien entre le changement de topologie des GPs et l’échappement à la neutralisation par les anticorps et/ou à l’immobilisation extra-hépatique.

Globalement, ce projet permettra de déterminer quels résidus sont impliqués dans le changement de topologie des GPs mais aussi l’importance des différents GPs et de leurs domaines sur le processus de maturation. Nous mettrons en évidence des facteurs de l’hôte potentiellement nécessaires à la maturation des virions. Enfin, nous mettrons en évidence le lien éventuel entre la maturation et l’échappement immunitaire.

La plasticité du VHC, associée à son haut niveau de réplication, est responsable de la distribution en quasi espèces des populations virales chez les individus infectés. Certains de ces variants sont résistants aux agents antiviraux à action directe (AADs). Leur susceptibilité réduite est conférée par la présence de substitutions amino-acidiques associées à la résistance (RAS) sur leur génome. Chez 10% à 30% des patients en échec d’AADs, aucune RAS n’est observée au moment de l’échec virologique. Par analogie avec le VIH et le Virus de l’hépatite B, il est probable que d’autres substitutions amino acidiques localisées dans des gènes non ciblés par les AADs sont sélectionnées au moment de l’échec virologique. Ces substitutions exerceraient un effet positif sur la capacité réplicative de la population virale correspondante, participant à l’échec virologique. Alors que cette hypothèse a été validée in vitro, aucune donnée n’est disponible en regard de la sélection de telles substitutions in vivo après l’échec d’un traitement antiviral. Cela est dû en partie aux techniques de séquençage disponibles, limitées à la caractérisation de courts fragments géniques. Dans ce travail, nous proposons d’utiliser une méthode originale de métagénomique « shotgun » permettant le séquençage du génome entier du VHC et la caractérisation en profondeur de la quasi espèce virale pour identifier les substitutions amino acidiques sélectionnées dans des régions non ciblées par les antiviraux au cours d’échecs virologiques des AADs.

Pour cela, nous caractériserons l’évolution des quasi espèces virales avant traitement et au moment de l’échec virologique à partir d’une cohorte monocentrique de patients non sélectionnés, en échec d’AADs présentant des RASs (n=21) ou pas de RASs (n=21) à l’échec, comparés à l’évolution naturelle de la quasi espèce virale dans un 3ème groupe de patients non traités (n=21). Le séquençage à haut débit par métagénomique shotgun constituera une approche intégrative puissante pour caractériser les substitutions sélectionnées au cours des échecs virologiques dans des régions non ciblées directement par les AADs. Ces substitutions, ainsi que les substitutions connues pour conférer la résistance aux antiviraux identifiées au cours de l’étude génétique, seront caractérisées sur le plan phénotypique (niveau de résistance conféré, effet sur la capacité réplicative) dans des modèles de réplicons transitoires et stables des différents génotypes du VHC disponibles sur la plateforme phénotypique du laboratoire.

Ce programme de recherche s’inscrit dans la continuité des travaux menés depuis plusieurs années par notre équipe de recherche concernant l’étude des quasi espèces virales et des mécanismes de résistance des traitements de l’hépatite C par AADs. L’expertise et l’ensemble des outils et systèmes expérimentaux permettant la réalisation pratique du projet sont disponibles et maîtrisés.

La réalisation de ce programme s’étalera sur une année. L’échéancier prévu est le suivant :

Mois 1-6: caractérisation génotypique par métagénomique des virus plasmatiques des patients de la cohorte.

Mois 7-12: réalisation des tests phénotypiques.