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Tout comme l’ADN ou les protéines, l’ARN est soumis à de nombreuses modifications chimiques, en particulier, les ARN viraux du VIH-1 contiennent les modifications m6A, m5C et 2′-O-Met. Même si une cartographie de ces modifications n’est pas établie de manière claire et précise, des modifications m6A et m5C sur l’ARNm du VIH-1 ont été préalablement identifiées au niveau du site de décalage du cadre de lecture entre Gag et Pol. Le VIH-1, comme beaucoup de rétrovirus, utilise un décalage du cadre de lecture programmé en -1, (-1 PRF) pour générer les protéines Gag et Gag-Pol, celui-ci est donc essentiel pour la réplication virale. Cependant, l’abondance des ribosomes sur l’ARNm est un facteur susceptible d’altérer l’efficacité du -1PRF. De manière générale, la distribution des ribosomes le long d’un ARNm, déterminée par la faible vitesse d’initiation par rapport à l’élongation, permet d’éviter les collisions. Néanmoins, des changements dans les vitesses d’initiation ou d’élongation peuvent altérer la fréquence de collisions, ce qui peut affecter de manière significative le frameshift programmé et donc l’expression de la polyprotéine Gag-pol. La modification m6A étant capable de ralentir ponctuellement le ribosome, il est possible que l’état de modification d’un ARNm soit un facteur de régulation de sa traduction.

Notre projet a pour but dans un premier temps de vérifier et caractériser la présence des modifications dans le génome du VIH en utilisant la technique de séquençage par nanopore qui permet de séquencer entièrement et de manière directe les molécules d’ARN. Afin de déduire la présence de sites portant des modifications, les molécules d’ARNm seront extraites de lymphocytes T CD4 + infectés par le VIH-1 et leur séquençage sera comparé à celui des mêmes molécules d’ARN mais transcrites in vitro et donc non modifiées. Dans un deuxième temps, afin de déterminer si les modifications de l’ARNm du VIH-1 peuvent jouer un rôle dans la vitesse de traduction et l’efficacité du frameshift, nous utiliserons la technique de ribosome profiling afin de comparer la densité des ribosomes et leur position sur les ARNm modifiés et non modifiés. Cela me permettra également de définir la phase de lecture de chaque ribosome en cours de traduction et son temps de résidence sur chaque codon. En complément nous utiliserons des systèmes rapporteurs afin de quantifier in vitro l’efficacité du décalage de cadre de lecture en -1 sur des ARNm modifiés et non modifiés. Afin d’aller plus loin dans la compréhension du rôle des modifications de l’ARNm sur la traduction, nous utiliserons une approche permettant l’étude de la traduction en molécule unique. Grâce à ce système, nous obtiendrons une quantification précise du déplacement du ribosome sur l’ARNm du VIH-1 avec ou sans modifications et en particulier au niveau du site de décalage du cadre de lecture en -1.

L’objectif de ce projet est donc d’étudier de manière complète le rôle des modifications de l’ARNm du VIH-1 dans l’expression des gènes viraux et dans la réplication du virus. Cela pourrait faire naître de nouvelles cibles thérapeutiques parmi les enzymes responsables de ces modifications capables d’impacter la pathogénicité du VIH-1.

Le virus de l’immunodéficience humaine (VIH) reste un problème de santé publique dans le monde entier malgré le développement d’antirétroviraux efficaces. Il est toujours mal compris comment l’infection par le VIH persiste toute la vie de son hôte. Plusieurs réservoirs viraux ont pu être identifiés mais les atteindre reste un challenge. Les macrophages représentent l’un des réservoirs principaux du VIH car ce sont des cellules cibles du virus qui résident dans tous les tissues (cerveau, poumons, foie, …). Comment s’établit ce réservoir n’est pas bien connu et il est donc essentiel d’intensifier les recherches afin de mieux comprendre les mécanismes moléculaires régissant leur mise en place au cours de l’infection. Il est supposé que le VIH utilise la stratégie du « cheval de Troie » afin d’être transporté dans les tissues via les monocytes circulants, passant la barrière endothéliale par transmigration avant de se différentier en macrophages. Cette migration trans-endothéliale requière que les monocytes traversent les jonctions serrées (TJs), structures qui fournissent l’imperméabilité entre deux cellules endothéliales. Les partenaires impliqués, le rôle des protéines associées aux TJs (TJAPs) et l’impact du VIH lors de ce processus restent obscures.

Ce projet a pour but de caractériser les mécanismes moléculaires impliqués lors de la transmigration des monocytes à travers les endothéliums, et l’influence du VIH-1 durant ces étapes. Pour se faire, nous avons d’abord déterminé que le VIH-1 induit une transmigration significativement plus importante des monocytes primaires au travers d’une barrière endothéliale. De plus, le virus n’a pas d’influence sur les niveaux d’attachement des monocytes à la monocouche endothéliale, la première étape du processus de transmigration, mais à des étapes plus tardives. Ainsi, nous avons cherché si les protéines associées aux jonctions serrées exprimées par les monocytes (mTJAPs) pouvaient représenter des molécules participant aux étapes post-adhésion de la transmigration. Dans ce contexte, une mTJAP a été identifiée comme étant un acteur important de la transmigration des monocytes infectés par le VIH. Nous avons mis en place un système de micro-fluidique qui nous a permis d’observer que cette mTJAP promeut l’étalement des monocytes rapidement après une exposition à un flux (à vitesse physiologique de la circulation sanguine). Dans ces conditions, alors que la capacité des monocytes à adhérer reste inchangée, l’augmentation de l’étalement est fréquemment associée à une augmentation des capacité pro-migratoire des cellules. De plus, nous avons pu déterminer par microscopie confocale 3D en temps réel que les monocytes infectés par le VIH transmigrent via la formation de structure ressemblant à des « lamélipodes », un processus pour lequel notre mTJAP a été impliquée. Enfin, la combinaison de l’infection par le VIH et la surexpression de la mTJAP entraine une forte augmentation de la transmigration, à des valeurs synergétiques plutôt qu’additives. Nos résultats suggèrent que HIV et la mTJAP coopèrent pour faciliter la transmigration des monocytes.

Afin de valider le rôle de la mTJAP durant la transmigration de monocytes infectés par le VIH-1, nous proposons maintenant d’utiliser une combinaison de microscopie en temps réel et micro-fluidique associées à des techniques classiques de virologie et biologie cellulaire. Nous allons disséquer en détails le mécanisme de transmigration médié par la mTJAP et déterminer comment le VIH-1 subverti cette protéine pour induire la transmigration du monocyte au travers des endothéliums.

Ce projet devrait fournir les bases moléculaires nécessaires pour mieux comprendre comment est initié la formation de réservoirs du VIH et ainsi apporter de nouvelles approches afin d’imaginer des stratégies antivirales innovantes visant les réservoirs.

Les macrophages (Mϕ) jouent un rôle clé dans la physiopathologie de l’infection VIH. Ils contribuent à la dissémination et sont d’importants réservoirs du virus. Ce sont les cellules cibles du virus dans le système nerveux central (SNC), dont l’infection conduit à des troubles neurologiques chez près de 50 % des patients. Etonnament, les mécanismes qui sous-tendent l’entrée du virus dans les Mϕ ne sont pas parfaitement élucidés. La majorité des virus qui infectent les Mϕ sont de tropisme R5, mais beaucoup des virus R5 ne sont que peu ou pas capables d’infecter les Mϕ, à la différence des lymphocytes T CD4 (LTCD4). Cela a trait à l’expression de facteurs de restriction dans les Mϕ, mais aussi comme nous venons de l’illustrer (Colin, PLoS Pathog, 2018), à des blocages à l’entrée virale. Pour des raisons qu’il conviendra d’identifier, l’efficacité d’utilisation de CCR5 par les virus (inversement proportionnelle au nombre de molécules de CCR5 requises à l’entrée virale) est moindre dans les Mϕ que dans les LTCD4. Nos résultats suggèrent que cela est lié à la nature des conformations de CCR5 qui diffèrent entre les Mϕ et les LTCD4. De manière intéressante, l’efficacité d’infection des Mϕ est augmentée lorsque ces cellules interagissent puis fusionnent avec des LTCD4 infectés (Bracq, JVI, 2017 ; et nos données préliminaires). Cela suggère donc que les contraintes habituellement rencontrées par les virus R5 pour infecter les Mϕ, et donc probablement la faible efficacité de leurs interactions avec CCR5, sont contournées lors d’un transfert viral entre les LTCD4 et les Mϕ.

Nous pensons que l’interaction Env/CCR5 est l’étape clé dont dépend le tropisme Mϕ des virus R5, et pour illustrer cela, nous poursuivrons trois objectifs spécifiques. i/ Nous caractériserons ces formes de CCR5 sur les Mϕ, comparativement à celles présentes dans les LTCD4. Nous souhaitons montrer que le caractère plus ou moins marqué du tropisme Mϕ des virus R5 varie suivant qu’ils sont capables d’exploiter ces conformations particulières de CCR5 à la surface des Mϕ. La permissivité des Mϕ à VIH varie aussi considérablement d’un donneur à l’autre, suivant l’origine tissulaire ou la polarisation de ces cellules, et nous chercherons à savoir si cela a trait à des modifications des propriétés structurales du corécepteur. Nous rechercherons enfin si des différences existent dans la nature des formes de CCR5 qu’expriment les Mϕ d’individus sains et de patients selon qu’ils ont ou pas développé des troubles neurocognitifs. ii/ Nous étudierons l’hypothèse que les virus R5 M- et non M-tropiques se distinguent par la nature des voies de signalisation de CCR5 qu’ils mobilisent. En effet, nous venons de montrer que les Envs de différentes souches de virus ne se lient pas nécessairement aux mêmes conformations de CCR5 à la surface cellulaire et ce faisant, n’activent pas les mêmes voies de signalisation intracellulaires en aval du corécepteur. Or la littérature atteste que la signalisation de CCR5 régule de manière critique l’accomplissement du cycle viral dans les Mϕ. iii/ Nous voulons enfin montrer que l’accroissement de l’efficacité d’infection des Mϕ via des contacts avec des LTCD4 conduit à ce que la majorité des virus R5 infectent les Mϕ. Nous pensons en effet que des expériences basées sur l’utilisation de virus libres ont depuis longtemps sous estimé la proportion des virus susceptibles d’infecter les Mϕ. Nous évaluerons aussi l’hypothèse que la formation de complexes entre les LTCD4 et les Mϕ conduit à accroitre l’efficacité des interactions Env/CCR5. Réciproquement, nous développerons des approches de vidéomicroscopie pour montrer que ces interactions jouent un rôle clé pour stabiliser les contacts entre LTCD4 et Mϕ et ainsi permettre à ces deux cellules de fusionner.

Ce projet est le fruit d’une réflexion entre nos deux équipes spécialisées depuis longtemps dans les mécanismes de l’entrée virale (B. Lagane) et de l’infection des Mϕ (S. Benichou). Il entend éclaircir les mécanismes moléculaires de l’entrée de virus R5 dans les Mϕ et ainsi mieux appréhender le rôle de ces cellules dans divers aspects de la physiopathologie de l’infection VIH.

Contexte :

La protéine régulatrice Rev du VIH-1, est une protéine nucléocytoplasmique de liaison à l’ARN, essentielle à la réplication virale. Rev est responsable de l’export nucléaire des ARN viraux non ou partiellement épissés, qui codent pour les protéines structurelles et enzymatiques virales et constituent l’ARN génomique incorporé dans les nouvelles particules virales. Rev est importée dans le noyau par le facteur de transport nucléaire de la cellule hôte, Importin β (Impβ). L’interaction entre Rev et Impβ est directe, et son inhibition bloque l’importation nucléaire de Rev et la réplication virale. Malgré le rôle essentiel du complexe Impβ/Rev dans le cycle d’infection virale, la base moléculaire de cette interaction reste mal comprise.

Objectif :

L’objectif à long terme de ce projet est de comprendre, à l’échelle atomique, comment Rev est importée dans le noyau de la cellule hôte. Pour atteindre cet objectif, nous cherchons à obtenir une structure 3D à haute résolution du complexe Impβ/Rev par cryo-microscopie électronique (cryo-ME). Nos efforts pour obtenir cette structure, en utilisant des méthodes conventionnelles, se sont jusqu’à présent avérés infructueux en raison de la petite taille et de la pseudo-symétrie du complexe Impβ/Rev. Pour surmonter ces obstacles, nous proposons une approche innovante, basée sur l’expérience que nous avons développée au sein du laboratoire, qui consiste à fusionner génétiquement Impβ à une protéine modèle dimérique. L’objectif spécifique du contrat d’initiation est de démontrer la faisabilité de cette approche, en déterminant une structure cryo-ME initiale du complexe Impβ/Rev à une résolution subnanométrique (idéalement inférieure à 5 Å).

Approche méthodologique :

Les données préliminaires révèlent que la fusion de Impβ au domaine de dimérisation d’une petite protéine bactérienne, EsxA de S. aureus, permet la production d’un homodimère soluble de 219 kDa, (EsxA-Impβ)2, qui forme des particules de taille et de forme attendues en microscopie électronique (ME) à coloration négative. Nos résultats montrent que cette construction initiale présente un degré de flexibilité au niveau de la liaison qui relie les deux protéines, et nécessite d’être optimisée afin d’obtenir un ensemble de particules plus homogène pour l’analyse par cryo-ME. L’optimisation sera réalisée en criblant un ensemble de mutants de délétion dans lesquels les résidus de liaison flexibles seront supprimés un par un. Chaque construction sera systématiquement exprimée et purifiée pour être caractérisée biophysiquement et visualisée par ME à coloration négative. Les constructions qui permettront d’avoir un ensemble de particules uniformes  seront ensuite analysées par cryo-ME à l’aide de notre microscope Glacios interne à l’institut, et les structures 3D correspondantes seront déterminées par analyse de particules uniques.

Résultats attendus :

L’approche développée devrait permettre d’obtenir une reconstruction cryo-ME du complexe Impβ/Rev à une résolution subnanométrique. Du fait que les hélices α sont visibles à cette résolution, et que Impβ et Rev sont des protéines hélicoïdales, ces premiers résultats nous permettront de positionner sans ambiguïté les structures atomiques connues de Impβ et Rev dans la carte cryo-ME et d’obtenir un premier aperçu de la façon dont Impβ reconnaît Rev. Il est important de souligner que ces résultats nous permettront de demander l’accès à un microscope cryo-électronique plus puissant (Titan Krios ou équivalent), qui nous permettra de déterminer une structure à haute résolution (idéalement mieux que 3 Å) qui révélera le détail des interactions impliquées dans la reconnaissance de Rev par Impβ. À plus long terme (au-delà de la portée de la présente demande de financement), nous exploiterons ces résultats pour identifier et générer des mutants qui compromettent l’interaction de Impβ et Rev. Ces mutants seront ensuite testés in vitro par des essais d’interaction et in vivo par des essais d’importation nucléaire de Rev dans des cellules, afin de confirmer l’implication des interactions moléculaires, structuralement identifiées, dans l’import nucléaire de Rev.

L’hépatite B chronique (HBC) est un problème majeur de santé publique affectant 300 millions d’individus de par le monde et est la cause majeure de l’insuffisance hépatique, de la cirrhose et du carcinome hépatocellulaire. En raison de la persistance de l’ADN circulaire clos de façon covalente (ADNccc) du virus de l’hépatite B (VHB), une guérison complète par les traitements actuels n’est pas possible. De nouvelles stratégies sont requises pour le traitement du VHB, incluant l’identification de biomarqueurs sériques représentatifs de l’activité de la molécule d’ADNccc intrahépatique, afin d’améliorer la prise en charge des patients et le développement de nouveaux traitements antiviraux. De nombreuses données convergent vers l’idée que les ARN circulant du VHB (cirB-ARN) pourraient servir de biomarqueurs sériques de l’infection par le VHB, de son traitement et de son pronostic. En revanche, la nature de ces ARNs et des particules les contenant in vivo et in vitro font actuellement l’objet de débat.

            Ce projet, destiné à financer la thèse de doctorat associée, ambitionne de profiler les protéines associées aux vésicules extracellulaires sécrétées dans des hépatocytes infectés ou non par le VHB, dans des échantillons de patients chroniquement infectés, et d’évaluer l’effet de traitements par analogues de nucléot(s)ides sur le protéome sécrété. Cela permettra la génération d’un jeu de donnée sans précédent qui orientera le choix de protéines cibles pour une analyse mécanistique en profondeur. Une meilleure connaissance des mécanismes contrôlant la sécrétion des ARNs d’HBV selon les phases de l’hépatite B chronique aidera à comprendre la valeur diagnostique du biomarqueur et participera au développement d’outils de diagnostic dédiés.