Winning projects and candidates

Le virus de l’hépatite E (HEV) est la cause la plus fréquente d’hépatites virales aiguës dans le monde. Le HEV est un virus à ARN simple brin de polarité positive, nu dans les selles des patients mais qui quitte la cellule infectée sous forme d’une particule associée aux lipides, dite quasi-enveloppée (eHEV). Les génotypes 1 et 2 (HEV1, HEV2) sont strictement humains et responsables d’hépatites fulminantes chez la femme enceinte. Les génotypes 3 et 4 (HEV3, HEV4) sont zoonotiques et causent des hépatites chroniques chez la personne immunodéprimée. Nous avons montré que la protéine de l’autophagie LC3B colocalise avec la protéine de capside ORF2 dans les cellules de la lignée hépatocytaire humaine HepG2/C3A/F2 et que la forme cytoplasmique de LC3B, LC3B-I, interagit avec ORF2 (thèse de Claire Allioux, ANRS 2020-2). LC3B-I est impliquée dans des phénomènes de bourgeonnement vésiculaire à partir du réticulum endoplasmique, contribuant ainsi au contrôle de sa qualité.

Afin de mieux comprendre le trafic intracellulaire d’ORF2 dans les compartiments cellulaires contenant LC3B, nous proposons d’utiliser la microscopie confocale en temps réel pour le suivre la protéine ORF2, l’ARN viral et la protéine LC3B dans des cellules HepG2/C3A/F2 polarisées. (1) Nous construirons des souches de HEV fluorescentes à partir des plasmides contenant le génome complet d’une souche de HEV3 ou de HEV1. Un tag ARN (aptamère) sera introduit dans la région hypervariable du gène orf1 codant la protéine non structurale. Un tag tétracystéine sera introduit dans la partie C-terminale du gène orf2. (2) Afin de vérifier la fonctionnalité de ces souches, nous déterminerons la concentration et la taille des particules virales obtenues par nanoparticle tracking analysis (NTA, appareil NanoSight). Nous quantifierons l’ARN viral produit en culture par RT-PCR quantitative et nous déterminerons l’infectiosité des particules virales par une méthode de culture en dilution limite permettant de calculer la TCID50 (tissue culture infectious dose 50). (3) En parallèle, une lignée stable des cellules HepG2/C3A/F2 exprimant la protéine LC3B taguée avec une protéine fluorescente sera construite.  (4) Cette lignée sera ensuite infectée avec les souches de HEV fluorescentes produites. Le trafic des marqueurs fluorescents dans les cellules vivantes sera suivi en microscopie confocale rapide (microscope confocal Spinning Disk, disponible sur la plateforme d’imagerie de l’unité). Les images obtenues seront analysées avec les logiciels de traitement d’images QuPath (2D) ou Imaris (3D). (5) Pour valider ces marquages, les cellules seront ensuite fixées et marquées avec des anticorps ciblant les protéines ORF2 et LC3B et analysées en microscopie confocale classique.

Cette étude pourra déboucher sur un projet plus large étendu à l’analyse du trafic viral dans des cellules exprimant d’autres protéines cellulaires fluorescentes. Ceci permettra de mieux comprendre la façon dont le HEV remodèle un ou plusieurs compartiments au bénéfice de sa réplication, de son assemblage et de son bourgeonnement. La comparaison des résultats obtenus pour le HEV1 et le HEV3 permettra de mettre en évidence à terme de nouveaux déterminants de la physiopathologie différente de ces deux génotypes.

Chez les virus à ARN positif, les complexes de réplication permettant la réplication du génome viral sont associés à des endomembranes cellulaires. Après traduction, l’une des protéines non structurales virales cible spécifiquement une membrane intracellulaire, s’y associe, la déforme puis recrute les autres protéines impliquées, virales et cellulaires. Ce processus est essentiel pour le cycle de réplication virale et est actuellement considéré comme une cible idéale à inhiber pour lutter contre les infections à ARN positif. Le développement d’inhibiteurs spécifiques nécessite la compréhension des processus liés à la formation du complexe de réplication membranaire, propres à chaque virus.
Ces dernières années, des travaux fondateurs ont permis de décrire les premières étapes de ce processus chez deux virus de la superfamille des Alphavirus-like, le virus du Chikungunya et le Flock house virus. Il a été montré que le complexe de réplication est formé à partir d’une structure protéique oligomérique en forme d’anneau, associée à une membrane cellulaire, qui sert ensuite de plateforme pour le recrutement des autres protéines impliquées. Il a également été montré que la protéine qui constitue cet anneau est l’enzyme responsable de l’ajout de la coiffe à l’extrémité 5’ des nouvelles molécules d’ARN viral, une propriété qui semble généralisable à l’ensemble des Alphavirus-like.
Avec ce projet, nous proposons d’étudier le rôle de l’enzyme d’ajout de coiffe du virus de l’hépatite E (domaine MetY) dans la formation du complexe de réplication. Des données de la littérature et issues d’expériences préliminaires de notre laboratoire laissent supposer que le domaine MetY interagit avec des membranes et s’oligomérise à leur contact.
Nous souhaitons spécifiquement
     i) prouver que MetY interagit avec des membranes,
     ii) identifier les motifs de MetY qui interagissent avec les membranes,
     iii) décrire la structure atomique de l’oligomère de MetY associé aux membranes.
Nous utiliserons pour cela une approche de biologie structurale intégrative, en combinant des techniques de biochimie, de biologie structurale (à la fois computationnelle et expérimentale) et de biologie cellulaire.
Nos résultats permettront pour la première fois de décrire le rôle de MetY à des échelles moléculaires et atomiques, approche unique dans les recherches qui sont actuellement menées sur le HEV à travers le monde. A terme, ces résultats permettront d’envisager la conception d’inhibiteurs destinés à inhiber spécifiquement le complexe de réplication du virus de l’hépatite E.

L’Organisation mondiale de la santé a appelé à l’élimination de l’hépatite B d’ici 2030. La vaccination universelle à la naissance, lorsqu’elle est mise en œuvre, a montré une grande efficacité pour réduire la prévalence de l’hépatite B chronique. Cependant, des infections par le VHB en absence de symptômes cliniques ont été observées chez des personnes vaccinées et présentant des niveaux détectables d’anticorps dirigés contre l’antigène de surface (anti-HBs) du virus de l’hépatite B (VHB), et pouvant éventuellement conduire à une infection occulte par le VHB caractérisée par la persistance d’un ADNccc viral fonctionnel dans le foie. La prévalence, la physiopathologie, l’évolution à long terme et les facteurs viraux et hôtes associés à ce type d’infections restent largement inconnus. Néanmoins, cet échec immunoprophylactique semble fréquemment associé à des souches de VHB de génotypes/sérotypes différents de celui utilisé dans le vaccin. Cela suggère que la capacité des anticorps induits par le vaccin à neutraliser l’infection peut être réduite par des variations antigéniques spécifiques associées à différents génotypes/sérotypes du VHB. Une étude collaborative internationale sera menée pour estimer la prévalence et les facteurs viraux et immunologiques associés aux infections B chez les donneurs de sang vaccinés. Les donneurs de sang seront utilisés en tant que population sentinelle systématiquement testée pour le VHB en dehors du domaine clinique. Cette étude collaborative impliquera des laboratoires en Europe, Chine, Afrique du Sud et Amérique du Sud afin d’étudier un large éventail de génotypes/sérotypes du VHB dans différents contextes épidémiologiques. Des échantillons de plasma de donneurs vaccinés, anti-HBs positifs, et présentant une infection VHB aiguë ou occulte seront sélectionnés. La diversité génétique du gène S des souches de VHB associées à un échec vaccinal sera étudiée en utilisant un séquençage profond de troisième génération. Les séquences obtenues seront comparées à des séquences contrôles de génotypes équivalents afin d’identifier des mutations susceptibles d’entraîner des modifications structurelles et fonctionnelles des protéines S et un éventuel échappement immunitaire. Les anti-HBs présents dans les plasmas de sujets vaccinés et infectés et de sujets contrôles non-infectés seront purifiés. L’activité neutralisante des anti-HBs contre des variants viraux autologues et hétérologues sera testée dans un essai de neutralisation in vitro en utilisant le virus de l’hépatite D (VHD) portant à sa surface des mutants d’intérêt de la protéine S du VHB. Ces pseudotypes HDV seront produits en culture de lignées cellulaires hépatocytaires. Un test de liaison anticorps-virions sera développé comme substitut pour évaluer la capacité des anticorps présents chez les sujets infectés à se lier à différents variants S autologues et hétérologues. Le suivi des donneurs vaccinés infectés par le VHB permettra de documenter la progression à court et moyen terme de l’infection (autolimitée, chronique ou abortive) en suivant les marqueurs viraux sérologiques et moléculaires dans le plasma et l’évolution génétique du virus. La détermination de la prévalence de l’infection par le VHB chez les donneurs de sang vaccinés en tant que population sentinelle fournira des informations importantes sur l’efficacité à long terme des programmes de vaccination universelle en fonction des génotypes et des variants viraux en circulation. La caractérisation génétique et fonctionnelle de ces variants d’échappement sera utile pour améliorer la conception des vaccins contre le VHB, les protocoles d’immunisation et les futures stratégies immuno-thérapeutiques.

Ce contrat d'initiation explore la manière dont les survivant·es du sida cohabitent avec les fantômes des disparu·es de l’épidémie. Il s’agit d’examiner la mémoire collective et individuelle du sida à travers les dimensions sociales, politiques et culturelles du deuil, en mettant l’accent sur les communautés LGBTQI+, immigrées et racisées, souvent exclues des récits dominants. L’étude exploratoire s’inscrit dans le « tournant hantologique » en anthropologie et s’appuie sur des travaux explorant la persistance des mort·es dans l’espace public et la mémoire collective. Elle cherche à comprendre comment les survivant·es vivent avec l’absence des disparu·es et comment la mémoire des luttes contre le sida est mobilisée dans les combats politiques contemporains, notamment contre les extrêmes droites.

Deux axes structurent la recherche :

1. La hantise en héritage : Comprendre comment les survivant·es sont marqués par l’épidémie et comment la mémoire des mort·es nourrit les luttes actuelles.
2. Le blanchiment des mémoires du sida : Mettre en lumière les expériences et luttes des personnes non blanches et issues des classes populaires, souvent invisibilisées dans les récits historiques.

Enfin, la recherche vise à accompagner un processus de « déblanchiment » des mémoires du sida, en valorisant les archives et en documentant les formes plurielles du deuil et de la commémoration.

Ce contrat d'initation s’appuie sur une approche combinant l’analyse de données existantes, la collecte de nouvelles données qualitatives et la création d’un espace collectif de réflexion.

• Analyse de données préexistantes : L’étude revisite un corpus collecté dans le cadre du programme ANRS EthnoAides, qui documente les évolutions des mobilisations associatives face au sida. Une attention particulière est portée aux récits de deuils et aux processus d’invisibilisation des militant·es non-blanc·hes.
• Collecte de données exploratoires : Une série d’entretiens biographiques (n=10) avec des proches de disparu·es du sida est prévue pour explorer les dimensions émotionnelles et intimes du rapport aux mémoires des disparu·es. Cette collecte repose sur des méthodes qualitatives créatives, telles que les entretiens répétés, les échanges à partir d’objets ou de photos, et des entretiens collectifs de type « witness seminar ». Par ailleurs, une analyse sociohistorique des mobilisations contre l’extrême droite en lien avec la mémoire du sida est également engagée.
• Construction d’un espace collectif de partage : Deux séminaires réuniront chercheur·ses, militant·es, archivistes et artistes pour co-construire une réflexion sur la mémoire des disparu·es et identifier des archives et initiatives de commémoration. Ces rencontres serviront à consolider les axes de recherche et à envisager des perspectives futures.

A terme, il s'agit de tester la faisabilité d'un projet de plus grande ampleur.

Le virus de l’hépatite E (VHE) est responsable d’infections chroniques chez les patients immunodéprimés. Les altérations immunitaires responsables de la persistance de l’infection sont largement incomprises. Nous étudions le rôle des lymphocytes T de type γδ et nos travaux récents sur des patients immunodéprimés (transplantés d’organes) ont mis en évidence une activation de ces lymphocytes et des marqueurs de leur mobilisation à la phase aigüe de l’infection. A partir d’une collection d’échantillons prélevés à la phase aigüe de l’infection chez des individus immunocompétents, nous avons confirmé que ces lymphocytes s’activent in vitro préférentiellement au contact d’hépatocytes infectés. A partir de lignées de lymphocytes γδ établies à partir de ces patients, nous avons mis en évidence que le virus modifie leur polarisation fonctionnelle et stimule une activité immunosuppressive en altérant leur réponse à certaines cytokines inflammatoires. Ceci représente un possible mécanisme d’échappement immunitaire. Notre projet vise  (i) à préciser dans un modèle d’infection in vitro les mécanismes inducteurs de propriétés régulatrices dans les lymphocytes Tγδ, en caractérisant les facteurs inducteurs au niveau du virus et des cellules infectées et en précisant comment ces facteurs modifient les cascades de signalisation de certaines cytokines. (ii) Nous voulons préciser les marqueurs phénotypiques des cellules γδ possédant des propriétés immunorégulatrices. (iii) Nous voulons préciser l’importance pathophysiologique de ces cellules γδ et des cytokines immunomodulatrices incriminées par l’étude d’échantillons sanguins issus de patients immunocompétents ou d’individus transplantés d’organes prélevés à la phase aigüe de l’infection, en recherchant la présence in vivo de ces cellules γδ régulatrices et en recherchant les cytokines incriminées afin de savoir dans quelle mesure ils corrèlent avec le statut et l’évolution clinique des patients (résolution spontanée ou chronicité). A terme, ce travail doit permettre de savoir si la mobilisation de ces lymphocytes est bénéfique ou non pour les patients et de préciser l’intérêt de cibler les lymphocytes γδ pour une immunothérapie préventive des infections chroniques par HEV.