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La réplication du génome ARN du VIH-1 est un processus essentiel dans le cycle de vie du virus. La réverse transcriptase codée par le virus utilise l’ARNt3Lys de la cellule hôte pour amorcer la transcription inverse de son génome ARN en ADN proviral. Comme l’étape clé d’initiation de ce processus est réalisée en milieu clos, dans la capside, avant ou après infection des cellules cibles par les particules virales, une étape primordiale et incontournable de la transcription inverse de l’ARN du VIH-1 en ADN proviral est l’encapsidation de l’ARN amorce, l’ARNt3Lys de la cellule hôte, dans les particules virales au cours de l’assemblage des nouveaux virions. Les polyprotéines Gag et GagPol, ancrées à la membrane plasmique de la cellule hôte via la myristoylation de leur résidu Gly2, sont essentielles au recrutement des protéines et ARN viraux ou cellulaires qui seront encapsidés.

Nous avons montré que la lysyl-ARNt synthétase mitochondriale (mLysRS) de la cellule hôte est sélectivement encapsidée dans les particules du VIH-1 et sert de transporteur des ARNtLys au cours du processus d’encapsidation. Associée à l’ARNtLys , mLysRS interagit avec les domaines transframe (TF ou p6*) et surtout intégrase (IN) du domaine Pol de la polyprotéine GagPol. Ce complexe d’encapsidation a pu être reconstitué in vitro. L’association entre l’intégrase et la mLysRS est robuste (Kd de 13 nM) et des molécules inhibitrices de cette interaction ont été isolées in vitro. Dans un test ex vivo de développement viral, ces molécules inhibent la réplication virale sans effet toxique sur la viabilité cellulaire.

L’objectif de ce projet de recherche est de comprendre les modalités d’assemblage du complexe d’encapsidation, et plus particulièrement de l’interaction mLysRS:IN. La validation d’un modèle atomique de l’interface mLysRS:IN sera un support essentiel à la sélection et à l’évolution moléculaire d’inhibiteurs capables de bloquer l’association entre mLysRS et IN, et donc d’inhiber le cycle viral. Ce type de molécule constituerait une nouvelle cible thérapeutique.

Ce projet de recherche est basé sur deux axes principaux :

• La validation d’un modèle atomique de l’association mLysRS:IN, responsable de la capture de l’ARN amorce dans les particules virales ;

• La caractérisation du mode d’action sur le cycle viral de molécules capables de bloquer cette association in vitro.

Mycobacterium tuberculosis (Mtb), la bactérie responsable de la tuberculose (TB), et le virus de l’immunodéficience humaine (VIH-1), l’agent du syndrome de l’immunodéficience acquise (SIDA), accélèrent leurs progressions mutuelles chez les patients co-infectés. Alors que de nombreuses données cliniques rapportent une augmentation de la charge virale dans les sites anatomiques co-infectés, tels que les poumons, les mécanismes qui en sont responsables restent insuffisamment décrits. Nous avons fait l’hypothèse que les macrophages pourraient être importants puisqu’ils sont la cible commune de Mtb et du VIH-1, en particulier dans l’environnement pulmonaire. Nous avons montré que la formation des nanotubes membranaires (« Tunneling NanoTubes » en anglais, TNT) dans les macrophages infectés par le VIH-1 dans un environnement associé à la TB était fortement induite, ce qui favorise le transfert du VIH-1 entre les macrophages et ainsi la production virale (Souriant et al., Cell Reports, 2019). Ces mécanismes peuvent expliquer pourquoi la charge virale est augmentée chez les patients co-infectés. Tout récemment, nous avons réalisé un transcriptome de ces macrophages (qui forment des TNT) dans un environnement tuberculeux et révélé la surexpression de Siglec-1/CD169. Cette lectine, spécifique des cellules myéloïdes, est connues pour s’attacher de manière très forte au VIH-1 et être impliquée dans le transfert du virus en trans vers les lymphocytes T CD4. De plus, non seulement l’inhibition de Siglec-1 diminue l’exacerbation du VIH-1 induite par la TB dans les macrophages, mais aussi Siglec-1 est associée aux TNT qui contiennent du virus. L’objectif de ce projet est donc d’étudier le rôle de Siglec-1 dans le transfert du VIH-1 entre les macrophages et en particulier dans le cadre du transfert dépendant des TNT.

Dans une première partie, nous utiliserons des modèles in vitro de transfert viral entre les macrophages pour évaluer la contribution de Siglec-1 induite par la TB dans (i) la capture du VIH-1, (ii) la formation des compartiments intracellulaires contenant le virus (VCC), (iii) les mécanismes de transfert viral et (iv) la fusion des macrophages en cellules géantes multinucléées. Dans le deuxième objectif, nous étudierons les interactions de Siglec-1 and son ligand principal, le ganglyoside GM3, dans les processus de transfert cellulaire, notamment ceux identifiés dans la première partie. De plus, nous rechercherons de nouveaux ligands de Siglec-1 par une approche de spectrométrie de masse. Dans la troisième partie du projet, nous nous focaliserons sur le rôle de Siglec-1 dans la biologie des TNT : nous étudierons la dynamique des TNT et leur fonction in vitro, ainsi que la localisation du complexe Siglec-1/GM3 par de la microscopie super-résolutive et la tomographie cryo-électronique. Enfin, la relevance physiologique des TNT positifs pour Siglec-1 et du transfert du VIH-1 dépendant des TNT sera analysée in vivo chez la souris, en utilisant la microscopie intravitale dans des souris wt et déficientes en Siglec-1, co-infectées ou non avec Mtb.

Les résultats qui découleront de ce projet apporteront des connaissances fondamentales sur la pathogénèse de la co-infection VIH-1/TB, notamment sur les mécanismes de transfert du VIH-1 dans un contexte tuberculeux, et potentiellement sur l’établissement des réservoirs viraux chez les patients co-infectés. A plus long terme, ce projet permettra de proposer de nouvelles cibles

Les anticorps neutralisants à large spectre (bNAbs) se développent chez des patients infectés par le VIH-1 (VIH) suivant un processus de co-évolution avec le virus se diversifiant. La génération des bNAbs par les cellules B nécessite plusieurs cycles de maturation d’affinité du récepteur des cellules B (BcR). Les cellules T CD4+ folliculaire (Tfh) contrôlent cette maturation du BcR. Les interactions entre les cellules B et les Tfh reposent sur la reconnaissance par les lymphocytes T de peptides présentés par les molécules du CMH-II exprimées par les lymphocytes B. Ainsi, la présentation de l’antigène par les cellules B est nécessaire pour qu’elles reçoivent de l’aide des Tfh spécifiques de l’antigène, et ainsi pour générer des bNAbs.

Nous proposons de caractériser les étapes limitantes de la présentation de l’antigène restreint par le CMH-II par les cellules B: de la capture de l’antigène par le BcR à l’activation des lymphocytes T. Nous étudierons l’impact de la spécificité et de l’affinité du BcR sur (i) la cinétique d’internalisation du virus entier et de Env, (ii) les voies de dégradation et la nature des compartiments de chargement des CMH-II et (iii) la qualité de l’activation des cellules T CD4 + spécifiques du VIH.

Pour cela, nous établirons deux modèles innovants pour étudier la présentation des antigènes par les lymphocytes B spécifiques du VIH aux cellules T CD4 + anti-VIH. Premièrement, nous créerons un panel de lignées de cellules B exprimant de manière stable des bNAbs recombinants ancrés à la membrane. Nous avons choisi des bNAbs ayant différentes spécificités et affinités pour Env. Afin de comprendre l’influence de la présentation de l’antigène par le BcR sur la sélection des cellules B par les cellules T, nous clonerons également sous forme de BcR des immunoglobulines de la lignée germinale. Deuxièmement, pour étendre les données obtenues avec des BcR recombinants, nous générerons une bibliothèque de clones de cellules B primaires spécifiques de Env. Ces cellules B spécifiques de Env seront triées à partir du sang de contrôleurs élites (ECs, de la cohorte Codex) et la spécificité et l’affinité de leurs BcR caractérisées. Sur la base de nos travaux antérieurs, nous sélectionnerons des ECs avec une fréquence élevée de cellules B mémoires spécifiques de Env et présentant un large potentiel de neutralisation croisée.

Plus spécifiquement, nous comparerons les cellules B exprimant des BcR ayant différentes affinités (y compris les BcR de la lignée germinale) dans leur capacité à activer des clones de lymphocytes T CD4 + spécifiques de Env et de Gag. Nous analyserons la capacité des BcRs reconnaissant différents domaines de Env à présenter des épitopes distincts aux clones T CD4 + spécifiques de Env. Nous étudierons si, en fonction de l’affinité et / ou de la spécificité, un seul BcR peut favoriser la présentation d’un épitope restreint au CMH-II tout en supprimant la présentation d’autres. Nous utiliserons des virus pseudotypés avec Env d’isolats primaires. En utilisant l’imagerie, la cytométrie de flux et des inhibiteurs spécifiques, nous définirons les mécanismes sous-jacents, notamment l’influence de l’affinité et / ou de la spécificité du BcR sur l’acheminement du complexe BcR-antigène dans différents compartiments de chargement (les endosomes précoces, tardifs ou autophagosomes). En fonction des compartiments de chargement de l’antigène, un répertoire différent d’épitope du CMH-II est probablement généré, avec un impact sur l’activation des cellules T.

Ces résultats permettront de concevoir de nouveaux immunogènes afin d’améliorer les interactions des cellules B et T, de soutenir l’aide des cellules T et in fine d’accélérer la génération de bNAbs. Les banques de clones de cellules B spécifiques au VIH offriront également la possibilité de sélectionner des vaccins candidats capables de fixer des BcR spécifiques du VIH et d’activer des réponses T auxiliaires CD4 + appropriées, fournissant de puissants moyens d’information pour concevoir des vaccins induisant des anticorps.

La glycoprotéine d’enveloppe (Env) est la protéine la plus diversifiée du VIH-1. Exposée à la surface du virus sous la forme d’un trimère de gp120/gp41 et jouant un rôle fondamental dans les premières étapes du cycle d’infection, elle est la cible privilégiée des anticorps neutralisants (AcN). Cependant, une fois l’infection établie, ces AcN favorisent l’apparition de variants d’échappement et ne permettent pas de contrôler la réplication virale. Plusieurs études récentes montrent que Env est également une cible importante des protéines de l’immunité innée. Différentes protéines antivirales dont l’expression est, pour la plupart d’entre elles, induite par les interférons de type I agissent sur Env en limitant sa synthèse, en dérégulant sa glycosylation, son clivage, son incorporation dans les virions ou encore en bloquant la processus de fusion lors de l’entrée du virus dans ses cellules cibles. Néanmoins, comme pour les AcN, nos récents travaux portant sur l’étude d’un de ces facteurs (IFITM3) ont montré que certains variants viraux sont capables d’y échapper.

Si l’activité antivirale de chaque facteur de restriction a été démontrée dans des modèles de culture cellulaire in vitro, la façon dont ces facteurs coopèrent in vivoentre eux et avec les AcN, une fois la réponse immune adaptative mise en place, n’a pas été explorée. Nous proposons d’aborder cette question grâce à 2 populations d’étude. La première est constituée de 5 sujets infectés par le VIH-1 chez lesquels nous suivrons l’évolution depuis la primo-infection jusqu’au stade d’infection chronique de la sensibilité/résistance des Env aux différents facteurs de restriction et aux AcN. Ce suivi longitudinal nous permettra de mieux comprendre quelle pression exerce chaque facteur de restriction sur Env, conjointement à celle exercée par les AcN, et quel est leur impact sur l’évolution de Env. La seconde population est constituée de 4 sujets appartenant à une chaîne de transmission identifiée par des analyses phylogénétiques au sein de la cohorte PRIMO 06 de l’ANRS. Grace à nos travaux antérieurs, nous disposons pour chacun de ces patients de virus pseudotypés exprimant les Env précoces (< 3 mois d’infection) et tardives (18 ou 24 mois d’infection) de la quasi-espèce virale les infectant. Cette population nous permettra d’étudier l’impact de la pression exercée par les facteurs de restriction et par les AcN sur Env dans la sélection des variants transmis et leur adaptation à un nouvel hôte. Enfin, la comparaison de séquences d’Env résistantes ou sensibles aux facteurs de restriction et la construction d’Env mutées ou chimères devraient également nous permettre d’identifier des déterminants moléculaires de Env qui modulent sa capacité d’échappement.

Selon les données épidémiologiques de l’UNAIDS, plus de 50 millions de personnes sont actuellement infectées par le VIH. L’arsenal thérapeutique actuel ne permet pas l’éradication finale de la maladie et provoque également des effets secondaires graves. La recherche de nouvelles molécules antivirales reste donc très importante tant du point de vue économique que sociétal.
Les G-quadruplexes (ou “G4”) sont des structures d’acide nucléique composées de quatre brins. Ces conformations inhabituelles ont longtemps été considérées comme de simples curiosités. Cependant, l’intérêt pour les G4 est en plein essor et plusieurs publications récentes dans des revues prestigieuses démontrent leur implication dans des processus biologiques clés.
Grâce au soutien de l’ANRS, nous commençons à déchiffrer le lien existant entre la formation des structures G4 et le cycle de réplication du VIH-1. L’utilisation de sondes G4 spécifiques nous a permis de démontrer qu’une structure G4 est formée dans la région U3 au cours du processus de transcription inverse. La liaison de ces sondes chimiques au G4 de l’U3 inhibe le processus. Ces effets inhibiteurs pourraient ouvrir la voie à des voies thérapeutiques anti-VIH sans précédent construites autour de ces G4 viraux. Nous voulons d’abord savoir comment les ligands de la porphyrine interagissent avec l’U3G4. Nous voulons fournir aux chimistes des données structurelles précises leur permettant d’améliorer les propriétés des ligands.