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Les métabolites sont des petites molécules biologiques qui participant a de nombreux processus cellulaires. Ils sont impliqués par exemple dans la glycolyse et la respiration mitochondriale (aussi appelée Oxphos), les deux principales méthodes de production d’énergie dans les cellules. Les particules virales de virus enveloppés comme le VIH se composent de protéines et d’acides nucléiques d’origine à la fois cellulaire et virale. Les composants provenant de la cellule sont incorporés dans la particule virale au moment de sa formation à la membrane de la cellule productrice. Il a été récemment montré que les particules virales peuvent également contenir une petite molécule ayant des propriétés de modulation de la réponse immunitaire : l’AMP-GMP cyclique (cGAMP). Lorsque ces virus contenant cGAMP entrent dans une nouvelle cellule cible, cGAMP se lie à son récepteur STING ce qui induit l’activation de la cellule qui produit alors des cytokines pro-inflammatoire et augmente son expression de gènes antiviraux. L’incorporation de cGAMP dans des particules virales utilisées dans un contexte de vaccination augmente l’efficacité du vaccin. Ainsi, une petite molécule incorporée dans une particule virale peut avoir un effet significatif sur l’organisme. Nous avons émis l’hypothèse que les particules virales peuvent également incorporer des petites molécules d’origine cellulaires et en particulier des métabolites. Des expériences préliminaires nous ont permis d’identifier des métabolites dans des préparations virales par une approche metabolomique semi-ciblée. Dans ce projet, nous souhaitons confirmer la présence de ces métabolites cellulaires dans les particules virales (« métabolites viraux »), développer des méthodes pour moduler les quantités de métabolites présents dans les particules virales et décrire les effets de ces métabolites viraux sur la cellule cible.

Les préparations virales contiennent à la fois les particules virales et des petites vésicules extracellulaires (sEVs) qui ont des caractéristiques morphologiques et physico-chimiques similaires aux particules virales. Dans un premier temps, nous testerons donc plusieurs méthodes de séparation des particules virales et des sEVs et nous identifierons la plus efficace par western blot et par microscopie électronique. Nous confirmerons ensuite que les métabolites identifiés dans nos expériences préliminaires sont présents dans les particules virales ainsi purifiées en utilisant des méthodes plus ciblées telles que des ELISAs, des tests enzymatiques in vitro et de la spectrométrie de masse ciblée. Ces métabolites viraux peuvent être incorporés soit de manière passive lors de la formation de la particule virale à la membrane cellulaire, soit par des processus actifs qui pourraient alors impliquer des protéines virales. L’existence de tel mécanismes viraux pour l’incorporation de métabolites spécifiques suggèrerait que ces métabolites sont importants pour la pathologie du VIH. Dans un second temps, nous identifierons donc des méthodes pour moduler l’incorporation des métabolites viraux en modifiant soit la cellule productrice, soit le virus. Cela nous permettra de produire des particules virales contenant des quantités plus importantes ou moins importantes de certains métabolites choisis. Nous utiliserons ensuite différentes méthodes pour étudier les effets des métabolites viraux sur le métabolisme de la cellule cible ainsi que sur la réplication virale et la réponse immunitaire a l’infection.

Ce projet décrira pour la première fois la présence de métabolites cellulaires dans les particules virales et montrera les effets de ces métabolites sur la réplication virale et la réponse immunitaire à l’infection dans les cellules cibles du VIH. Il révèlera ainsi un nouvel aspect de la relation hôte-pathogène et permettra d’envisager de nouvelles stratégies thérapeutiques innovantes.

Le virus de l’hépatite E (HEV) est le 1er agent viral d’hépatite à l’échelle mondiale. Il peut être responsable d’une hépatite E chronique, définie par la persistance du virus pendant plus de 3 mois, chez les patients immunodéprimés. Des virus recombinants ayant incorporé des fragments de gène humain dans la région riche en proline (PPR) de leur génome ont été décrits au cours des infections chroniques. Ces fragments de gène humain possédaient une origine variée : protéine ribosomale S17, S19, tyrosine aminotransférase, inter alpha trypsine inhibiteur et favorisaient la réplication du HEV in vitro. Les mécanismes conduisant à cet avantage réplicatif comparativement au virus dépourvu du fragment humain sont actuellement inconnus.

L’objectif de ce projet est d’étudier le(s) mécanisme(s) conférant un avantage réplicatif aux virus recombinants ayant incorporé un fragment de gène humain.

 Dans la première partie de ce projet (semestre 1 et 2), nous allons étudier l’impact de 7 fragments humains récemment identifiés par notre équipe à l’aide d’une technique de séquençage haut-débit (SMRT PacBio). Les différents fragments seront insérés dans la PPR du plasmide codant pour le virus Kernow, principale souche de laboratoire utilisée pour l’étude du HEV. Le plasmide Kernow sans fragment humain sera utilisé comme contrôle. Après transcription in vitro, l’ARN obtenu sera transfecté dans la lignée cellulaire hépatique HepG2/C3A. Le stock viral obtenu après transfection sera utilisé pour infecter la lignée cellulaire hépatique HepG2/C3A. La capacité réplicative de chaque virus recombinant sera évaluée par quantification par RT-qPCR de l’ARN viral dans le surnageant de culture. Le nombre de foyers infectieux à J5 sera déterminé par immunofluorescence. Ces résultats seront confirmés sur des cellules d’hépatocytes primaires. L’impact de ces fragments humains sur le franchissement de la barrière d’espèce sera également étudié en introduisant ces fragments de gène humain dans une souche de génotype 1, génotype strictement humain. La capacité de ces virus recombinant à infecter des lignées cellulaires animale LLC-PK (rein de porc) et OHH1.Li (foie de biche) sera étudiée.

La deuxième partie de ce projet (semestre 3 et 4) vise à identifier les protéines interagissant avec la PPR. La région codant pour la PPR des virus recombinants possédant un avantage réplicatif sera amplifiée en utilisant une amorce permettant d’ajouter un tag HA et introduite dans un vecteur d’expression. Le plasmide sera ensuite transfecté dans la lignée cellulaire HepG2C3A. La protéine PPR sera concentrée par immunoprécipitation à l’aide de billes magnétiques coatés avec un anticorps anti-HA. Les protéines interagissant avec la PPR seront séparées par migration sur un gel SDS-PAGE et identifiées par spectrométrie de masse. L’identité des partenaires d’interaction sera confirmée par des approches de knock-down et surexpression pour mettre en évidence la perte/le gain d’avantage réplicatif en l’absence ou en présence de la cible de la PPR.

Ce projet permettra :

• de décrire le rôle de la PPR dans le cycle de réplication du HEV
• de déterminer l’impact de ces fragments humains dans le franchissement de la barrière d’espèce
• de préciser les mécanismes conduisant à l’amélioration de la capacité réplicative du HEV en présence de fragments de gènes humains.

Problématique : La population vivant avec le VIH (PVVIH) vieillissante souffre de comorbidités. Ces comorbidités, altérant progressivement leur état de santé, et associées à des conditions de vie initiales hétérogènes pourraient entraîner ou aggraver avec le temps des inégalités de santé entre les différents groupes de patients infectés par le VIH ou selon le genre, et par rapport à la population générale. Aucune étude n’a jusqu’ici permis d’évaluer si, à situation sociale comparable, l’état de santé des PVVIH pris en charge dans les système de soins de pays industrialisés est le même que celui de la population non infectée. Une limite générale des études publiées réside dans la difficulté à disposer d’un groupe de comparaison approprié, où soient pris en compte les facteurs de risque de comorbidités d’une part, notamment le poids, l’IMC, le tabagisme, l’alcool, les paramètres métaboliques, l’hypertension artérielle, et d’autre part la position sociale. Nous posons l’hypothèse que l’inclusion dans la cohorte Constances de PVVIH permet de pallier ces limites méthodologiques. Le projet JASMIN vise à comparer l’état de santé de PVVIH à celui de groupes de sujets non pvVIH, son évolution au cours du temps, ses déterminants en termes de facteurs de risque médicaux, mode de vie, conditions sociales, en utilisant les mêmes outils d’évaluation sociodémographique, comportementale, biologique et morphologique.

Objectifs :
Au sein de la cohorte CONSTANCES:

• Comparer l’état de santé des PVVIH à celui de la population non-infectée, en prenant en compte les conditions socio-économiques et le mode de vie des sujets, sur 1) des paramètres généraux de santé : poids, index de masse corporelle, tension artérielle, lipidiques et glucides dans le sang, fonction rénale, hémoglobine, formule sanguine, 2) la santé mentale, 3) des paramètres plus approfondis de vieillissement tels la cognition et la fragilité.
• Etudier les inégalités sociales produites ou aggravées par le diagnostic VIH et au cours du vieillissement avec l’infection, notamment l’impact sur la vie professionnelle des PVVIH en comparaison avec les personnes non-infectées.

Méthodes
PVVIH et non-PVVIH inclus dans la cohorte de population générale CONSTANCES (critères d’inclusion : âge 18 à 69 ans, affilié au régime général de Sécurité sociale par la Caisse Nationale d’Assurance Maladie ou une section locale mutualiste, résidant en Ile-de-France ou dans un département avec un centre d’examen de santé CES participant à Constances). Ne sont pas éligibles les indépendants et les agricoles.
Echéancier : La description des caractéristiques des PVVIH à l’inclusion dans Constances permettra de guider la sélection du /des groupes de comparaison des personnes non-infectées par le VIH. On anticipe que l’on sélectionnera dans le groupe de comparaison non pvVIH l’ensemble des personnes originaires d’Afrique Sub-Saharienne et les HSH, et une fraction des autres personnes. Un 1er travail en 2024 portera sur l’analyse à l’inclusion des paramètres généraux de santé. Ces analyses seront stratifiées sur le sexe, et menées également dans le groupe des HSH. En parallèle un 2ème travail portera sur la description de la situation professionnelle des PVVIH au moment du diagnostic, et les trajectoires professionnelles des deux groupes (PVVIH et non-PVVIH). L’implémentation d’une technique statistique pour garantir la comparabilité des deux groupes en termes des caractéristiques individuelles et professionnelles à la date de diagnostic des PVVIH permettra de comparer les trajectoires professionnelles et l’éventuel effet du diagnostic du VIH. En 2025 les analyses porteront sur des paramètres plus approfondis du vieillissement tels la cognition et la fragilité chez les personnes âgées de 45 ans et plus, chez qui ces paramètres ont été explorés dans Constances, et sur la santé mentale.

Résultats attendus : Ce travail permettra de mieux comprendre, et à terme de prévenir au moins en partie, l’impact de l’infection VIH dans le champ de la santé, dont la santé mentale, les fonctions cognitives, la fragilité, et les parcours professionnels.