Winning projects and candidates

Une des dernières étapes du processus d’entrée du virus de l’hépatite B (VHB) dans la cellule implique la fusion de sa membrane avec celle de la cellule afin de libérer son génome. Ce processus semble être indépendant de l’acidification des endosomes dans lesquels le virus est internalisé suite à son attachement à ses récepteurs de surface cellulaire. Le VHB comporte trois protéines de surface (L, M et S) qui ont en commun leurs derniers 226 acides aminés ainsi que quatre régions transmembranaires (TM) permettant leur insertion dans l’enveloppe du virus. Il a été proposé qu’une séquence de 23 acide-aminés juxtaposée à la première région TM (TM1), serait responsable de cette fusion. Cependant, il n’y a que très peu d’évidences expérimentales directes, utilisant notamment des tests d’infection, sur la participation de ce segment dans le processus de fusion. Par ailleurs, des résultats récents de notre équipe montre la présence d’un peptide de fusion potentiel dans la région PreS1 identifié par analyse de coévolution et confirmé depuis de manière fonctionnelle. Un autre déterminant impliqué dans l’entrée du VHB est la région AGL (antigenic loop), située dans l’ectodomaine de S, et notamment ses nombreux résidus cystéines qui, expérimentalement, semblent impliqués dans des modifications conformationnelles de S nécessaires pour entrainer le processus de fusion du VHB. Enfin, nos études en cours ont permis de modéliser un pont disulfure dit « allostérique » dont la modification abolie le processus de fusion membranaire. Néanmoins, la nature, la fonction et la coordination de l’ensemble de ces déterminants restent encore très mal connus.

L’objectif de ce projet est de mieux comprendre comment le VHB induit la fusion de sa membrane lipidique avec celle de la cellule en utilisant une combinaison d’outils bioinformatiques et expérimentaux. Dans une étude antérieure sur le virus de l’hépatite C, nous avions montré que la combinaison d’analyses bioinformatiques et de virologie moléculaire est une approche particulièrement efficace pour disséquer les modifications des protéines de surface du virus impliqués dans les processus de fusion membranaires. L’analyse bioinformatique de la co-évolution des résidus des protéines de surface du VHB combinée à différentes approches computationnelles telles que proposée dans ce nouveau projet permettra d’identifier un ou plusieurs groupes de résidus potentiellement impliqués dans le processus de fusion et de formuler des hypothèses pour comprendre l’activation du mécanisme de fusion membranaire. Ces hypothèses seront testées par différentes expériences mettant en jeu des protéines de surface mutées ainsi que par des modulations d’expression ou des inhibitions des facteurs cellulaires d’entrée impliqués.

Nous utiliserons comme systèmes expérimentaux principaux un test de fusion cellule-cellule ainsi que le virus de l’hépatite D (VHD) dont les particules comportent les protéines de surface du VHB. La qualité de production des particules sera examinée en analysant le contenu des protéines de surface et l’ARN du VHD. En utilisant ces systèmes expérimentaux, nous examinerons notamment si l’induction du processus de fusion lors de l’entrée cellulaire est le résultat de leur interaction avec certains membres de la famille des protéines disulfure isomérases (PDI). La participation de membres de la famille PDI dans l’entrée du VHB sera évaluée avec des inhibiteurs, anticorps et shRNA spécifiques de ces protéines afin de pouvoir identifier le facteur impliqué dans l’entrée du VHB et l’étape à laquelle se déroule cette interaction présomptive. Les analyses et les prédictions bioinformatiques nous aideront à modéliser les interactions au sein des protéines de surface du VHB ainsi qu’avec la PDI identifiée et les changements de conformation qu’elles subissent lors du processus de fusion. L’analyse des résidus impliqués sera réalisée par des substitutions conservatives ou non-conservatives et l’analyse ex vivo des propriétés des particules VHD ainsi modifiées dans des tests biochimiques, d’infectivité, d’interactions avec les co-facteurs d’entrée, dont la PDI, et de fusion membranaire in vitro.

ProSiCure Advance vise à étudier les candidats biomarqueurs sanguins précédemment identifiés comme prédictifs du risque de cancer du foie chez les patients guéris du VHC pour leur expression de base dans le sang de 1465 patients souffrant d'une maladie du foie associée à une hépatite virale chronique (cohorte ANRS CO12 CirVir).

L'hépatite virale chronique est la principale cause de maladie hépatique avancée et de cancer dans le monde. L'inflammation persistante déclenche des mécanismes de cicatrisation excessifs et un remodelage perturbé de la matrice extracellulaire, ce qui entraîne une fibrose et une cirrhose du foie. La cirrhose est la quatrième cause la plus fréquente de décès chez les adultes en Europe centrale et le carcinome hépatocellulaire (CHC) est en train de devenir la deuxième cause de décès par cancer dans le monde, avec une croissance très rapide.

Même si l'infection virale chronique peut être contrôlée (hépatite B) ou guérie (hépatite C), le risque de développer un cancer du foie reste élevé, en particulier chez les patients atteints d'une maladie hépatique avancée. Il n'existe actuellement aucun biomarqueur non invasif fiable permettant d'identifier les patients à risque et de les stratifier en vue d'une surveillance plus étroite du cancer. Nous avons précédemment démontré que l'hépatite virale chronique déclenche l'empreinte épigénétique de l'expression d'un gène pro-oncogène qui est associé au risque de cancer. Fait important, nous avons démontré que cette empreinte virale persiste après la guérison du VHC, soulignant le potentiel de l'empreinte induite par les blessures en tant que nouveaux biomarqueurs prédictifs du risque de cancer chez les patients atteints d'hépatite virale.

Le projet prédécesseur ProSiCure, financé par l'ANRS, visait à identifier des biomarqueurs sanguins minimalement invasifs prédictifs du risque de CHC dans une cohorte d'entraînement de 34 patients après guérison du VHC. En utilisant la protéomique sérique, nous avons identifié un panel de 161 biomarqueurs candidats associés au risque de cancer dans cette cohorte de découverte, mais avec un chevauchement mineur avec des signatures de biomarqueurs précédemment décrites (tissu hépatique ou sang). Il est intéressant de noter que 22 d'entre eux faisaient partie de l'empreinte épigénétique de l'infection par le VHC précédemment identifiée par notre équipe. Les principales catégories biologiques impliquent l'activation des cellules stellaires, la réorganisation de la matrice extracellulaire, l'inflammation et les lésions. Un classement impartial selon la performance technique, la validation des immuno-essais et la précision des prédictions du modèle (analyse ROC) a permis à ProSiCure de proposer 5 candidats de premier plan pour un développement ultérieur.

L'application actuelle (ProSiCure Advance) vise à étudier l'abondance de ces 5 biomarqueurs candidats dans le sérum de 1465 patients de la cohorte ANRS CO12 CirVir à l'aide de tests ELISA commerciaux. Les données seront comparées aux données cliniques, y compris la chronologie du développement du CHC, l'infection virale sous-jacente, le stade de la maladie. ProSiCure Advance mettra en évidence la meilleure combinaison de biomarqueurs candidats selon l'analyse bioinformatique et fournira ainsi un ensemble d'outils nouveaux et urgents pour identifier les patients atteints d'une hépatite virale chronique, contrôlée ou guérie, qui présentent un risque élevé de développer un CHC.

Le virus de l’hépatite E (HEV) est la cause la plus fréquente d’hépatites virales aiguës dans le monde. Le HEV est un virus à ARN simple brin de polarité positive, nu dans les selles des patients mais qui quitte la cellule infectée sous forme d’une particule associée aux lipides, dite quasi-enveloppée (eHEV). Les génotypes 1 et 2 (HEV1, HEV2) sont strictement humains et responsables d’hépatites fulminantes chez la femme enceinte. Les génotypes 3 et 4 (HEV3, HEV4) sont zoonotiques et causent des hépatites chroniques chez la personne immunodéprimée. Nous avons montré que la protéine de l’autophagie LC3B colocalise avec la protéine de capside ORF2 dans les cellules de la lignée hépatocytaire humaine HepG2/C3A/F2 et que la forme cytoplasmique de LC3B, LC3B-I, interagit avec ORF2 (thèse de Claire Allioux, ANRS 2020-2). LC3B-I est impliquée dans des phénomènes de bourgeonnement vésiculaire à partir du réticulum endoplasmique, contribuant ainsi au contrôle de sa qualité.

Afin de mieux comprendre le trafic intracellulaire d’ORF2 dans les compartiments cellulaires contenant LC3B, nous proposons d’utiliser la microscopie confocale en temps réel pour le suivre la protéine ORF2, l’ARN viral et la protéine LC3B dans des cellules HepG2/C3A/F2 polarisées. (1) Nous construirons des souches de HEV fluorescentes à partir des plasmides contenant le génome complet d’une souche de HEV3 ou de HEV1. Un tag ARN (aptamère) sera introduit dans la région hypervariable du gène orf1 codant la protéine non structurale. Un tag tétracystéine sera introduit dans la partie C-terminale du gène orf2. (2) Afin de vérifier la fonctionnalité de ces souches, nous déterminerons la concentration et la taille des particules virales obtenues par nanoparticle tracking analysis (NTA, appareil NanoSight). Nous quantifierons l’ARN viral produit en culture par RT-PCR quantitative et nous déterminerons l’infectiosité des particules virales par une méthode de culture en dilution limite permettant de calculer la TCID50 (tissue culture infectious dose 50). (3) En parallèle, une lignée stable des cellules HepG2/C3A/F2 exprimant la protéine LC3B taguée avec une protéine fluorescente sera construite.  (4) Cette lignée sera ensuite infectée avec les souches de HEV fluorescentes produites. Le trafic des marqueurs fluorescents dans les cellules vivantes sera suivi en microscopie confocale rapide (microscope confocal Spinning Disk, disponible sur la plateforme d’imagerie de l’unité). Les images obtenues seront analysées avec les logiciels de traitement d’images QuPath (2D) ou Imaris (3D). (5) Pour valider ces marquages, les cellules seront ensuite fixées et marquées avec des anticorps ciblant les protéines ORF2 et LC3B et analysées en microscopie confocale classique.

Cette étude pourra déboucher sur un projet plus large étendu à l’analyse du trafic viral dans des cellules exprimant d’autres protéines cellulaires fluorescentes. Ceci permettra de mieux comprendre la façon dont le HEV remodèle un ou plusieurs compartiments au bénéfice de sa réplication, de son assemblage et de son bourgeonnement. La comparaison des résultats obtenus pour le HEV1 et le HEV3 permettra de mettre en évidence à terme de nouveaux déterminants de la physiopathologie différente de ces deux génotypes.