Winning projects and candidates

Introduction
Entre 257 à 291 millions de personnes dans le monde sont chroniquement infectées par le virus de l’hépatite B (HBV), entraînant plus de 820 000 décès par an. Les décès sont principalement le résultat d’une inflammation du foie entraînant une fibrose hépatique, une cirrhose et un carcinome hépatocellulaire. Les traitements actuels sont limités aux inhibiteurs de polymérase (analogues de nuclos(t)ides) et à l’interféron alpha pégylé (PEG-IFN-a), qui contrôlent l’infection mais la guérison est rare. Par conséquent, de nouvelles stratégies thérapeutiques contre le HBV son nécessaires. L’antigène de capside core du HBV est une cible antivirale pertinente en raison de ses nombreuses
fonctions dans le cycle viral. Notamment, les modulateurs d’assemblage de capside (CAM) se lient directement à core et inhibent l’assemblage des particules virales. Les CAM sont divisés en deux familles : la classe A et la classe E. Les composés de classe A (CAM-A) induisent la formation de structures aberrantes et l’agrégation de core, tandis que les composés de classe E (CAM-E) induisent la formation de capsides vides mais morphologiquement intactes. Nous avons observé que le traitement avec le CAM-A RG7907 induit l’élimination des hépatocytes exprimant core en induisant l’agrégation de core dans le noyau, l’apoptose des hépatocytes et la prolifération cellulaire dans un modèle murin AAV-HBV et dans différents modèles cellulaires. De plus, nous avons observé la modulation de la réponse immunitaire innée suite au traitement CAM-A. Nos observations préliminaires suggèrent un nouveau mode d’action des molécules de type CAM-A. Cependant, les mécanismes détaillés à l’origine de l’apoptose et de l’activation de la réponse immunitaire innée sont inconnus. Nous avons émis l’hypothèse que l’agrégation de core après le traitement par CAM-A module l’expression des protéines entraînant l’apoptose et induit la réponse immunitaire innée dans les cellules répliquant le VHB.

Méthodes
Nous tirerons parti des cellules HepG2 exprimant core permettant l’accumulation suffisante d’agrégats core lors du traitement CAM-A pour identifier les moteurs de l’apoptose. De plus, nous souhaitons confirmer l’apoptose et l’activation de l’immunité innée dans des cellules HepaRG différenciées infectées par le HBV lors du traitement à long terme par un CAM-A. Nous visons enfin à étendre nos observations à un panel de CAM appartenant à la fois aux chimiofamilles HAP et non-HAP, afin d’élucider si l’apoptose est liée à la structure CAM ou à l’agrégation de core en soi.

Objectifs
L’objectif de ce projet sera d’élucider ce mode d’action dans des modèles d’infection authentiques et d’identifier les moteurs de cette mort cellulaire dépendante de l’agrégation centrale après un traitement CAM-A. Concrètement, nos objectifs sont :
1) APOPTOSE. Validation de protéines candidates dérégulées en tant que moteurs de l’apoptose médiée par l’agrégation de core dans les cellules exprimant core et dans des modèles d’infection par HBV.

2) IMMUNITÉ INNÉE. Décrypter l’activation de l’immunité innée et le rôle des protéines candidates lors de l’agrégation de core en présence du génome du HBV.

3) PREUVE DE CONCEPT IN VIVO. Nous souhaitons valider ces résultats dans des souris chimériques infectées par le VHB.

Conclusions
Les résultats de notre programme feront progresser la compréhension de l’infection par le HBV en identifiant un nouveau mécanisme d’action antivirale pour les molécules CAM-A qui pourraient aider à adapter la durée du traitement, conduisant potentiellement à l’élimination des cellules infectées après in fine. Les résultats de ce programme ouvriront la voie à une approche multimodale pour éradiquer cette menace majeure pour la santé mondiale.

Lors de nos recherches en Amérique latine, nous avons décrit l’incidence anormalement élevée de cas de carcinome hépatocellulaire (CHC) chez de jeunes patients non-cirrhotiques originaires de l’altiplano péruvien. Cette survenue précoce de CHC est concomitante (a) de l’hyper-prévalence d’un sous-génotype du virus de l’hépatite B (VHB) endémique des Amériques et (b) de l’ascendance amérindienne des patients CHC péruviens. Nous avons émis l’hypothèse qu’une coévolution antagoniste virus-hôte entre les communautés humaines andines et ce clade du VHB pourrait être à l’origine de la survenue précoce du CHC.

Nos objectifs consistent à mesurer l’impact de l’infection VHB comme force évolutive s’exerçant sur le génome humain (1) en génotypant les VHB associés à la survenue précoce du CHC, (2) en caractérisant les variations nucléotidiques des gènes sous pression sélective du VHB chez les patients CHC péruviens, (3) en précisant l’ascendance génétique de ces patients et (4) en modélisant les dynamiques adaptatives vis-à-vis de l’infection VHB des individus d’ascendance amérindienne à risque de CHC. Cet aspect de notre projet sera réalisé par la caractérisation des séquences génétiques qui codent pour les protéines humaines interagissant avec le virus. L’originalité de notre recherche est renforcée par l’analyse comparative d’ADN anciens extraits de momies précolombiennes découvertes au Pérou. Cette mise en abîme permettra de mesurer le plus finement possible l’évolvabilité du VHB et des patients CHC et d’établir différents scénarios coévolutifs virus-hôte.

Notre schéma expérimental comprend l’analyse d’ADN totaux extraits (i) de patients CHC péruviens (n = 100) et (ii) de momies précolombiennes (n = 100) en utilisant la méthode d’enrichissement ciblé par capture d’hybrides pour le séquençage haut débit. Le taux et la robustesse de l’adaptation seront inférés à l’aide de méthodes statistiques éprouvées et d’outils phylogénétiques moléculaires disponibles.

L’impact principal de notre recherche se situe au niveau de la caractérisation d’une population à risque de CHC précoce lié à l’infection par le VHB, afin de contribuer à l’élaboration d’une politique de santé ciblée au bénéfice de cette population. Cette population clé d’ascendance amérindienne regroupent les communautés humaines des Andes parmi les plus isolées et vulnérables d’Amérique latine. De plus, notre recherche permettra de définir l’ontologie virale d’une forme variante de CHC développée spécifiquement par des patients d’ascendance autochtone, un phénomène anthropologique jamais vraiment caractérisé avec un tel niveau de précision auparavant. Enfin, notre recherche aura un impact décisif sur notre compréhension des origines ancestrales et de l’évolution des hépatites virales B dans le Nouveau Monde.

Les études sur la transmission du VIH-1 par voie sexuelle suggèrent que les virus T/F (Transmitted/Founder) à l’origine de l’infection possèdent des propriétés biologiques spécifiques leur permettant d’être transmis. Cependant, des incertitudes persistent sur les éléments phénotypiques particuliers associés à leur sélection.  Au niveau du tractus génital, les macrophages (MP) et les lymphocytes T CD4+ (LTCD4) font partie des premières cellules immunitaires cibles des virus T/F. L’infection de ces cellules cibles peut se faire par les virus libres circulants mais la transmission des virions entre cellules infectées et cellules cibles semble plus efficace pour la dissémination du VIH-1. Malgré l’importance des macrophages dans l’infection VIH, les mécanismes conduisant à leur infection et à leur capacité à transmettre des virions infectieux restent méconnus. Dans le contexte de transmission du VIH-1 par voie sexuelle et en tenant compte du rôle prépondérant des MP au niveau des sites de transmission, la comparaison des virus T/F issus d’un transfert intercellulaire pourrait contribuer à la compréhension du processus de transmission des virus à l’origine d’une nouvelle infection.

Afin de mieux caractériser le rôle des MP dans l’établissement de l’infection initiale, nous proposons de comparer les propriétés infectieuses de virus T/F issus de différents transferts cellulaires impliquant les MP et les LTCD4.

Pour cela, nous utiliserons deux populations d’étude. La première population d’étude correspond à un panel de 10 clones moléculaires infectieux de virus T/F de sous-type B obtenus auprès du NIH (NIH Aids Reagent Program). Ce panel de virus T/F bien caractérisé nous permettra de rechercher si le passage de ces virus dans des macrophages par transfert intercellulaire modifie leurs propriétés infectieuses. La seconde population d’étude est issue de 5 patients infectés par des variants très proches d’un virus de sous-type B et faisant partie d’un cluster de transmission que nous avons étudié précédemment. Des virus réplicatifs exprimant les enveloppes représentatives de la population virale infectant les 5 patients (6 variants T/F et 7 variants chroniques) seront générés. Cette population nous permettra de rechercher si les virus T/F présentent un avantage sélectif à transiter par les MP par rapport aux virus chroniques.

L’analyse des propriétés infectieuses des virus T/F après transit lymphocytaire ou macrophagique constitue une réelle opportunité d’apporter des éléments phénotypiques nouveaux sur les virus impliqués dans la transmission de l’infection et de comprendre le rôle des MP dans la dissémination du VIH-1, avec en perspective le développement de mesures préventives adaptées.

L'infection chronique par le virus de l'hépatite D (VHD) est la forme la plus grave d'hépatite virale chronique, entraînant une progression rapide vers la cirrhose et augmentant considérablement le risque de carcinoma hépatocellulaire (CHC). Le VHD est un virus défectif qui dépend principalement du virus de l'hépatite B (VHB) pour se répliquer, la co-infection aggravant considérablement les conséquences cliniques du VHB. Comme le VHD dépend presque entièrement du mécanisme cellulaire de l'hôte, les stratégies ciblant l'hôte et bloquant l'entrée représentent les approches thérapeutiques les plus prometteuses. Les virions du VHD contiennent un complexe ribonucléoprotéique (RNP) composé du génome ARN viral et des deux antigens du VHD. Dans le noyau cellulaire, la RNP recrute des protéines de l'hôte et sert de matrice pour la synthèse de l'ARN, un processus qui dépend fortement de l'ARN polymérase II (POL II). La transcription médiée par POL II nécessite de nombreux facteurs, notamment le facteur de transcription général TFIIH, qui s’avère également être un composant central de la voie de réparation de l'ADN par excision-resynthèse de nucléotides (NER). Il est à noter que d'autres facteurs NER, tels que le groupe de complémentation C du xeroderma pigmentosum (XPC), sont également intimement impliqués dans la transcription. Cependant, les liens fonctionnels existant entre la NER et la réplication du VHD sont pour l’heure largement méconnus.

Nos résultats préliminaires suggèrent l’existence de tels liens. Le partenaire 1, expert en pathogenèse de l'hépatite virale, a dressé le profil multiomique de l'infection par le VHD chez la souris et a découvert que les facteurs NER, y compris le XPC, sont dérégulés pendant l'infection et associés au complexe RNP du VHD. De plus, les études sur la perturbation du VHD suggèrent un rôle proviral de certains facteurs NER, dont XPC. En tant qu'expert de premier plan dans le domaine de la transcription POL II et de la réparation de l'ADN, le partenaire 2 a démontré que les facteurs NER tels que XPC participent directement à la transcription médiée par POL II, et ceci indépendamment de tout stress génotoxique. Ces résultats constituent la base de l'hypothèse centrale de ce projet commun intitulé NER-D: les facteurs NER pourraient contribuer à la réplication et à la transcription du VHD et façonner les réponses transcriptionnelles de l'hôte lors d'une infection par le VHB/VHD.

Le projet NER-D va adopter une approche interdisciplinaire, en combinant la virologie du HDV et la biologie de la régulation transcriptionnelle avec la réparation de l'ADN, la transcriptomique et les analyses ChIP. Il est organisé en quatre lots de travaux réalisés en synergie visant à définir les activités provirales des facteurs NER et leurs interactions avec le RNP du VHD, et de étudier comment les facteurs NER influencent la réparation de l'ADN et le transcriptome de l'hôte pendant l'infection.

Le projet NER-D permettra de révéler comment les facteurs NER régulent la transcription virale et les programmes transcriptomiques liés aux maladies hépatiques. De plus, NER-D repoussera les limites qui restreignent actuellement la compréhension de la régulation transcriptionnelle et de la réparation pendant la maladie hépatique. Ces connaissances établiront un nouveau paradigme dans les interactions hôte-virus à la jonction entre l'hépatite virale et les mécanismes de réparation de l'ADN. Les voies non canoniques en aval liées aux facteurs clés identifies pourraient in fine fournir des cibles exploitables pour de nouveaux concepts antiviraux ou pour une intervention thérapeutique visant à ralentir ou à prévenir les maladies hépatiques d'origine virale.