Winning projects and candidates

La tuberculose (TB), causée par Mycobacterium tuberculosis (Mtb) reste l’une des principales causes de décès due à un agent infectieux dans le monde. Le traitement de la tuberculose nécessite plusieurs mois de chimiothérapie avec des schémas thérapeutiques complexes contenant plusieurs antibiotiques. Malheureusement, la durée et la toxicité des régimes antituberculeux disponibles affectent considérablement l’observance, conduisant à des échecs thérapeutiques, des rechutes et l’émergence de résistances. Ce nombre croissant de souches multirésistantes constitue un véritable défi clinique extrêmement préoccupant. Dans ce contexte, le développement de nouvelles interventions thérapeutiques est désespérément nécessaire pour réduire la durée du traitement et éviter la génération de sous-populations multirésistantes récalcitrantes.

Parmi les médicaments de première ligne disponibles, le pyrazinamide (PZA) joue un rôle clé dans le traitement de la tuberculose. En effet, l’introduction de cet antibiotique dans la chimiothérapie antituberculeuse standard a permis de raccourcir la durée du traitement de 9-12 mois à 6 mois. Le PZA est donc l’une des meilleures molécules à notre disposition. Deux mécanismes majeurs, communément acceptés au sein de notre communauté scientifique, ont été proposés pour décrire le mode d’action du PZA. Le premier nécessite un pH microenvironnemental acide pour être efficace en perturbant l’homéostasie du pH intrabactérien et le potentiel de membrane. Le second, ne nécessite aucune étape de protonation et cible l’aspartate carboxylase PanD, impliquée dans la biosynthèse de la co-enzyme A, ayant ainsi une efficacité quel que soit le pH microenvironemental. Ainsi, bien qu’il soit utilisé en clinique depuis près de 50 ans, le mode d’action moléculaire du PZA reste mal caractérisé avec des modèles potentiellement conflictuels.

Afin de répondre à ces questions, nous avons conçu une proposition de projet d’initiation intitulée ” Contribution moléculaire du pH et de l’aspartate décarboxylase PanD dans le mode d’action du pyrazinamide chez Mycobacterium tuberculosis (PanDMyc)” qui vise à développer de nouveaux outils biologiques, technologiques et analytiques pour décrypter les bases moléculaires responsales de l’activité du PZA.

Dans un premier temps, nous proposons de développer un programme de répression transcriptionnelle (CRISPRi) chez Mycobacterium tuberculosis. Ensuite, ce système permettra de réaliser des approches chimio-génétiques innovantes pour caractériser les hypothétiques cibles et voies biologiques impliquées dans la sensibilité au PZA. Nos travaux se focaliseront donc sur la cible putative PanD, impliquée dans la biosynthèse de la co-enzyme A et la contribution du pH microenvironnemental.

Avec ces investigations, nous visons à redéfinir le mode d’action du PZA, apportant ainsi de nouvelles connaissances sur les principes fondamentaux de la chimiothérapie et l’émergence d’une population résistante aux médicaments avec des implications cliniques importantes.

Nous croyons fermement que les conclusions qui découleront de ce contrat d’initiation fourniront une base solide pour la conception d’un projet multidisciplinaire très ambitieux qui a le potentiel de bénéficier non seulement aux chercheurs fondamentaux et aux cliniciens, mais également à la définition de nouvelles stratégies thérapeutiques, le raccourcissement de la durée du traitement et ultimement bénéficier aux patients grâce à un meilleur contrôle global des cas de TB.

Pour se répliquer, le VIH-1 doit encapsider spécifiquement deux copies de son ARN génomique (ARNg) à partir d’un excès d’ARN cellulaires et viraux épissés. Dans le cytoplasme, le précurseur Pr55Gag (Gag) du VIH-1 sélectionne l’ARNg en interagissant très spécifiquement avec le signal d’encapsidation dans la région 5’UTR de l’ARNg. Les complexes ainsi formés atteignent la membrane plasmique (MP) où l’assemblage a lieu.  A ces sites, le domaine N-terminal de Gag qui est myristoylé, permet l’encrage des Gag et des complexes Gag-ARNg, et environ 2500 Gag s’assemblent autour du dimère d’ARNg. Cela implique que le mode de liaison de Gag à l’ARNg doit devenir à ce stade non spécifique et ce changement (d’un mode d’interaction très spécifique au moment de la sélection, à un mode d’interaction non spécifique lors de l’assemblage) favoriserait efficacement l’assemblage viral.

A ce jour, peu d’informations quantitatives sont disponibles sur les facteurs moléculaires régulant le mode d’interaction entre Gag et l’ARNg lors de l’assemblage à la MP. Selon notre hypothèse, ces interactions seraient régulées par i) l’interaction de Gag avec la MP, ii) la multimérisation de Gag, ou par l’ensemble de ces deux facteurs. L’objectif de ce projet est de réaliser la première analyse quantitative in vitro et en cellule, de manière à comprendre comment ces deux facteurs moléculaires régulent le mode de liaison de Gag à l’ARNg et favorisent l’assemblage du VIH-1.

Dans ce but, nous avons produit des fragments d’ARN viraux (un fragment d’ARNg et deux ARN viraux mutés), ainsi que les protéines myristoylées Gag de type sauvage (Myr-Gag WT) et trois protéines Gag mutées dans le domaine de multimérisation de manière à déstabiliser les contacts protéine-protéine (Myr-Gag WM, Myr-Gag-PAE et Myr-Gag K affectant respectivement une interaction à deux, trois et six hélices dans les multimères immatures de Gag) dans des cellules eucaryotes. Les protéines Myr-Gag et les ARN ont été marqués par fluorescence, puis les protéines ont été associées aux bicouches lipidiques (SLB) mimant la composition interne de la MP. En introduisant une quantité croissante d’ARN, nous avons déterminé par microscopie confocale, les valeurs de Kd pour les interactions entre les protéines Myr-Gag (WT ou WM), les fragments d’ARN viral, et un ARN non viral, l’ARNt.  Contrairement à ce qui a été précédemment observé en solution avec des protéines Gag non myristoylées, nos résultats montrent que i) l’association de Myr-Gag WT aux SLB conduit à une interaction non spécifique entre Myr-Gag WT et les ARN viraux testés, ii) Myr-Gag WT associée aux SLB pourrait discriminer entre les ARN viraux et les ARN non viraux, et iii) l’interaction avec les SLB (plutôt que l’état de multimérisation de Myr-Gag) semble influencer le mode de liaison des protéines à l’ARN. Suite à ces résultats préliminaires encourageants, nous étendrons ces expériences aux autres mutants de multimérisation et à un plus vaste panel d’ARN (viraux et cellulaires). De même, nous déterminerons l’impact de l’insertion et de l’orientation du myristoyl dans la MP, ainsi que l’effet de la courbature de la MP dans la régulation de la spécificité des interactions Myr-Gag-ARN. Ces valeurs de Kd (déterminées pour les protéines liées au SLB), seront comparées à celles déterminées par des expériences similaires en solution, qui simulent la sélection cytoplasmique de l’ARNg. Cette analyse quantitative des interactions Gag-lipides, Gag-Gag et Gag-ARNg régulant l’assemblage du VIH-1 sera aussi transposée à des systèmes cellulaires. Ainsi, en combinant des approches de biochimie et biophysique de pointe, et des méthodes de microscopie adaptées à cette analyse, nous fournirons un cadre précis des facteurs impliqués dans la régulation des interactions Gag-ARNg lors de l’assemblage du VIH-1. Les résultats obtenus dans leur ensemble élargiront notre compréhension des interactions Gag-ARNg permettant l’assemblage rétroviral, ouvrant ainsi la voie au développement de stratégies antivirales novatrices et à l’amélioration des vecteurs rétroviraux pour la thérapie génique visant au traitement des pathologies liées au VIH-1 ou d’autres maladies.

Le traitement antirétroviral (TARV) a amélioré l’espérance et les conditions de vie des personnes vivants avec le VIH (PvVIH), et son accès s’est largement accru dans le monde ces dernières décennies. Toutefois, en dépit d’un contrôle viral efficace, le risque de développer des comorbidités non-SIDA reste souvent plus élevé chez les PvVIH. Le risque de développer des comorbidités augmente aussi naturellement avec l’âge. Même dans les pays à haut niveau de ressources (PHNR), le risque de maladie cardiovasculaire est plus élevé chez les PvVIH que dans la population générale. L’étude Reprieve a montré que la prise en charge des PvVIH ne doit pas seulement se focaliser sur le contrôle viral, mais devrait également prendre en compte la prise en charge du risque de comorbidités.

Contrairement aux PHNR, dans les pays à ressources limitées, le nombre de molécules disponibles restant très limité, les PvVIH sont exposés aux mêmes molécules pour de longues durées. Ceci induit probablement une prévalence plus élevée de toxicité médicamenteuse et de résistance au TARV et les place vraisemblablement à un risque accru de comorbidités. D’autres facteurs (environnementaux, co-infections, activation immune…) pourraient aussi impacter leur fréquence. Contrairement à l’Afrique, le type et la fréquence des comorbidités ne sont pas bien documentés en Asie, alors que selon les pays, les caractéristiques des populations peuvent être différents (IMC, régime alimentaire, etc).

Au Vietnam, en 2021, la prévalence du VIH était estimée à 0.3%, soit 240,000 PvVIH adultes. Plusieurs études rapportent un taux de succès virologique élevé et une mortalité faible au Vietnam. Le corolaire est que le nombre de PvVIH sous TARV pour de longues durées augmente.

L’objectif de ce projet est de décrire la prévalence d’un large panel de comorbidités (diabète, hypertension, maladies cardiovasculaires, déficience rénale, stéatose et fibrose hépatique, maladie mentale, cancer colorectal, cancer du col de l’utérus chez les femmes et cancer anal chez les HSH, ostéoporose) dans une vaste étude multicentrique (4 sites cliniques à Hanoi) sur 1251 PvVIH sous TARV depuis ≥5 ans, et d’identifier les facteurs associés. La prévalence des comorbidités sera comparée entre trois groupes de durée du TARV (5-9, 10-14 et ≥15 ans), et bien-sûr en fonction d’autres facteurs (type de molécule, âge, sexe..). Une stratification par groupe d’âge sera mise en place. La virémie sera également mesurée. Un objectif secondaire est de documenter le taux d’orientation vers les soins, chez ceux pour lesquels une comorbidité a été démasquée. Pour ce faire, une seconde visite sera conduite 6 mois après l’inclusion.

Nous documenterons aussi le niveau d’inflammation, évaluerons l’association entre inflammation et comorbidités et si le schéma d’inflammation diffère selon les comorbidités. Le phénotype des cellules immunes sera aussi étudié, limité à un sous-échantillon de patients avec et sans comorbidités, appariés sur sexe, âge et durée du TARV. Enfin, une collection de plasma et cellules mononucléaires périphériques sera constituée afin de procéder plus tard à des investigations mécanistiques plus avancées.

Une étude en sciences sociales est prévue ; 24-36 PvVIH et 8-12 personnels soignants seront invités à participer à des groupes de discussions et/ou entretiens individuels abordant les soins liés au VIH, la qualité de vie, la santé et le vieillissement.

Pour la plupart des participants, les comorbidités seront découvertes du fait de la réalisation systématiques des tests, offrant un bénéfice direct aux participants. En prenant en charge ces comorbidités, la santé et la qualité de vie des PvVIH seront améliorées. Les données issues de cette étude seront utiles aux autorités locales pour identifier les besoins pour faciliter l’intégration des soins des comorbidités dans le système actuel. L’étude de multi-comorbidités et des profils d’inflammation en fonction de l’âge, du sexe, de la durée de TARV, et du style de vie, ainsi que la préparation d’une biobanque issue de 1251 PvVIH, apportera de nouvelles informations scientifiques sur le lien avec les comorbidités.

Les cellules tueuses naturelles (NK) sont impliquées dans le contrôle de l’infection par le VIH-1. Les récentes découvertes sur la capacité des cellules NK à s’adapter et à se différencier en cellules mémoire à longue durée ont ajouté une complexité supplémentaire. Les cellules NK de type mémoire peuvent être générées par stimulation via des cytokines comme IL- 12/15/18. Dans l’ensemble, cela soulève la possibilité qu’il existe des capacités d’adaptation distinctes parmi les sous-populations de cellules NK en réponse aux infections virales et immunisations, un mécanisme qui pourrait être exploité pour promouvoir les réponses anti-VIH. Tout comme pour les cellules T, l’importance d’une meilleure compréhension des fonctions spécifiques aux tissus des cellules NK est de plus en plus importante. Nos études précédentes ont révélé un fort contrôle médié par les cellules NK de l’infection à SIVagm dans les tissus lymphoïdes secondaires (SLT) chez un hôte naturel, le singe vert africain (AGM). Nous avons montré que lors d’une infection chronique SIVagm, des cellules NK hautement différenciées au sein des SLT présentant un profil adaptatif associé à une activité cytotoxique accrue envers les cellules présentant de peptides derivés de SIV-ENV via le MHC-E. Un contrôle similaire était absent dans l’intestin de l’AGM infectée par SIVagm. Nous émettons l’hypothèse que les cellules NK adaptatives à forte capacité de suppression se différencient in situ au sein des SLT.

Ici, nous proposons de mieux comprendre comment les cellules NK acquièrent la capacité de contrôle du SIVagm dans les SLT. Nos objectifs spécifiques sont: 1) identifier le site anatomique de génération de cellules NK adaptatives lors de l’infection SIVagm; 2) comparer les données phénotypiques et moléculaires des cellules NK en primo-infection SIV dans les tissus entre infection SIVagm et SIVmac pour mieux comprendre le blocage de differentiation des cellules NK tissulaires lors d’une infection SIVmac; 3) déterminer les microenvironnements tissulaires inflammatoires respectifs et évaluer la relation potentielle avec les profils de cellules NK identifiés en focalisant sur les facteurs qui pourraient moduler le phenotype ou l’activité des cellules NK. Nous analyserons les tissus qui jouent un rôle majeur pour la réplication virale (SLT, muqueuse) et la différenciation potentielle des cellules NK (moelle osseuse, foie, SLT). Deux groupes d’AGM infectés par SIVagm seront sacrifiés aux jours 4 et 28 pi. Un groupe de macaques infectés par SIVmac sera sacrifié au jour 4pi. Des échantillons d’AGM et de macaques non infectés et chroniquement infectés sont déjà disponibles. Nous analyserons l’hétérogénéité, la différenciation et l’activité des cellules NK temporelles et spatiales sur un analyseur Symphony FACs (> 25 couleurs). En utilisant notre test ex vivo de l’activité des cellules NK restreintes au CMH-E, nous analyserons si l’activité des cellules NK adaptatives est présente uniquement dans les SLT ou également dans d’autres tissus lors d’une infection à SIVagm. Si nous détectons une différence quant à l’émergence de sous-populations cellulaires NK et/ou l’activité restreinte du CMH-E entre les tissus, nous déterminerons le profil transcriptomique à l’échelle du génome des sous-populations cellulaires NK identifiés en AGM par rapport aux macaques aux temps et tissus en question. Dans les mêmes tissus sélectionnés, nous effectuerons une analyse RNAseq sur des cellules totales pour définir les environnements inflammatoires respectifs en primo-infection. En combinant ces aspects, nous visons à obtenir un aperçu plus complet des cellules NK tissulaires et à mieux comprendre les processus biologiques favorisant ou bloquant la génération de cellules NK efficaces contre les cellules infectées par le VIH / SIV. À long terme, cela pourrait contribuer à fournir i) des biomarqueurs pour évaluer l’efficacité des cellules NK tissulaires chez les patients VIH, ii) de nouvelles cibles pour d’immuno-thérapies.