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L'infection par le virus de l'hépatite B (VHB) reste un problème global majeur de santé publique. Des vaccins thérapeutiques efficaces et des traitements antiviraux ont actuellement disponibles, mais ils doivent être pris à vie et ne parviennent pas à éradiquer le virus du foie infecté. La recherche de nouvelles cibles thérapeutiques est en continuel développement. Certaines de ces nouvelles approches visent à réduire la sécrétion de pseudo-particules virales (SVPs; subviral particles) et/ou de virions, tous deux porteurs de l'antigène de surface du VHB (AgHBs), dont la perte spontanée ou induite par traitement a été associée à un meilleur pronostic clinique. Cependant, l'accumulation intracellulaire de protéines d’enveloppe mutées a été associée à un risque pro-oncogène accru. Il semble important que de futurs traitements réduisant la sécrétion d'AgHBs n’entraînent pas son accumulation intracellulaire. Il est donc essentiel d'approfondir les connaissances sur les mécanismes moléculaires qui confèrent à la petite protéine de surface S du VHB (SHBs) la capacité intrinsèque de s'auto-assembler en structures oligomères complexes constituant l'élément structurel majeur des SVPs et de l’enveloppe des virions.

      Des études suggèrent que la boucle cytosolique 1 (CYL-1) de SHBs aurait un rôle important dans la morphogenèse et la sécrétion des SVPs, qui constituent la majeure partie du pool d'AgHBs. L'étude proposée vise à caractériser l'implication des motifs moléculaires et structurels spécifiques de CYL-1 et leur fonction dans l'oligomérisation et le trafic intracellulaire des protéines S conduisant à la sécrétion extracellulaire des SVPs, en étudiant les mutations aux positions sW35R, sW36R/G, sS38F/W, sC48H/Y/W, sH60C/Y, sC65G/H/R/S, sC69H/R/W et sM75T, précédemment associées à une rétention intracellulaire de l'AgHBs. L'effet des mutations sur la sécrétion de l'AgHBs sera confirmé in vitro dans des cellules Huh7 et HepG2 transfectées avec des plasmides recombinants exprimant soit les SHBs seules, soit inclues dans la protéine de surface longue du VHB (LHBs), un composant mineur des SVPs. L'oligomérisation et la localisation subcellulaire des SHBs mutées et sauvages (WT) seront étudiées dans des cellules transfectées à l'aide des techniques de microscopie en immunofluorescence confocale, et d’imagerie FLIM (Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy), TEM (Transmission Electron microscopy) et FCS (Fluorescence correlation spectroscopy). Le niveau de stress du réticulum endoplasmique et l'efficacité de l'activation de la réponse UPR (Unfolded Protein Response) induite par l'accumulation de mutants CLY-1 seront étudiés in vitro. Nous émettons l’hypothèse que les mutants CYL-1 pourraient interférer avec les composants de la voie ERAD (ER-associated degradation) de l’UPR et la voie de l’autophagie afin d'échapper à la dégradation, et les mécanismes moléculaires potentiellement impliqués seront explorés. L'impact de mutants CYL-1 sur l'inflammation hépatique et le développement de la fibrose sera étudié in vivo dans un modèle murin, à l'aide du vecteur adénovirus-associé hépatotrope AAV2/8 et d'une lignée de souris transgéniques VHB. La nature et l'étendue de l'environnement pro-inflammatoire et des lésions hépatiques associés à la rétention de l'AgHBs dans les hépatocytes seront évaluées dans les tissus hépatiques animaux.

      L'analyse fonctionnelle des mutants CYL-1 altérant la production/sécrétion de l'AgHBs permettra d'approfondir les connaissances sur les motifs moléculaires et structurels de CYL-1 et leurs fonctions dans les premières étapes de l'oligomérisation et/ou dans le trafic intracellulaire des protéines S conduisant à la libération extracellulaire des pseudo-particules virales. La caractérisation des éléments critiques de CYL-1 pourrait faciliter le développement de nouvelles cibles thérapeutiques. L'accumulation intracellulaire de protéines virales étant un facteur pro-oncogène potentiel, il semble essentiel d'évaluer dans quelle mesure l'altération de la structure/fonction de CYL-1 peut contribuer à échapper au mécanisme de dégradation des protéines en interférant avec les mécanismes ERAD et de l’autophagie.

Plus de 25 millions de personnes dans le monde souffrent d'une infection chronique par le virus de l'hépatite D (VHD). Alors que l'évolution clinique de l'infection aiguë par le VHD ne se distingue guère de l'hépatite B aiguë, à l'exception d'un taux plus élevé d'hépatites fulminantes, l'infection chronique par le VHD aggrave les pathologies hépatiques causées par le VHB.

Le VHD forme une particule enveloppée constituée d'une enveloppe lipidique contenant des protéines de surface du VHB (HBsAg, comprenant les formes S-, M- et L-HBsAg) et enrobant une ribonucléoprotéine interne (RNP), composée d'un multimère de la protéine delta (HDAg) codée par le VHD et associée à une copie de l’ARN viral circulaire monocaténaire. Le VHD est un agent transmissible défectif utilisant les glycoprotéines (GP) d’enveloppe du VHB pour sa propagation, reflétant ainsi sa nature de virus satellite du VHB. En effet, les particules du VHD utilisent uniquement le mécanisme d’enveloppement fourni par les GPs du VHB, ce qui permet ensuite le ciblage et l'entrée des particules du VHD dans les hépatocytes humains via des mécanismes qui dépendent des facteurs d'entrée du VHB.

L'assemblage des particules de VHD est un processus mal défini. La première étape de l'assemblage du HDV repose sur la formation des complexes RNP composés du génome ARN du VHD et des protéines HDAg, sous les formes S- HDAg et L-HDAg, à l'intérieur du noyau. L-HDAg contient un signal d'export nucléaire (NES) déclenchant l'export de la RNP vers le cytoplasme, un déterminant d'assemblage comprenant un signal de farnésylation permettant d’ancrer la RNP à la membrane du RE, et un déterminant d'enveloppement composé d'un domaine C-terminal peu conservé, riche en proline, situé en amont du site de farnésylation et qui se lie à un motif conservé riche en tryptophane présent sur le côté cytosolique de S-HBsAg qui agit comme un domaine matriciel des particules VHD. Alors que S-HBsAg, qui induit la formation des particules sous-virales (SVP) du VHB, est nécessaire et suffisant pour permettre la sécrétion des RNP du VHD, ces particules doivent également recruter un peu de L-HBsAg pour être infectieuses.

Plus particulièrement, l‘export nucléaire de la RNP fait intervenir un mécanisme indépendant de CRM1 pour lequel quelques facteurs nucléaires ont été identifiés tels que les protéines NESI, TAP et Aly. Cependant, le mécanisme précis par lequel la RNP franchit le pore nucléaire ainsi qui son transport vers le lieu d’enveloppement des particules VHD restent encore mal définis, et notamment les facteurs d’hôte cytosoliques impliqués dans ce transport de la RNP.

Notre projet vise notamment à explorer l’environnement cytosolique dans lequel la RNP s’accumule, suite au franchissement du pore nucléaire, selon 2 axes. Premièrement, en utilisant des approches de microscopie de pointe et de biochimie combinées à l'inhibition de l’expression de gènes cellulaires, nous caractériserons un micro-environnement cytosolique composé de la RNP du VHD et de la nucléoprotéine Nup98, nos résultats préliminaires montrant en effet leur association dans des agrégats cytosoliques. Nous déterminerons notamment le rôle de ces agrégats et de Nup98 dans le cycle viral du VHD, nous caractériserons leur composition et leur formation, et enfin, nous déterminerons le mécanisme moléculaire par lequel la RNP rencontre Nup98. Notre deuxième objectif sera d’identifier l’ensemble des protéines cellulaires composant l’environnement de la RNP du VHD par des approches de "marquage de proximité" suivies d'une identification par spectrométrie de masse afin d’identifier et de caractériser le mode d'action des facteurs de l'hôte impliqués dans le transport cytosolique de la RNP du VHD.

Les résultats de ce projet devraient permettre de mieux comprendre une étape cruciale du cycle de vie d'un pathogène peu caractérisé et de conduire à l'identification/validation de nouvelles cibles thérapeutiques potentielles.

Le virus de l'hépatite B (VHB) est l'un des agents pathogènes humains les plus graves : environ 250 millions de personnes souffrent d'hépatite B chronique et environ 800 000 en meurent chaque année. Le VHB est un virus enveloppé avec une nucléocapside icosaédrique contenant de l'ADN partiellement double brin (rcDNA). Le composant élémentaire de la capside est un dimère de la protéine Core de 183 résidus (ou 185 selon le génotype): les 149 résidus N-terminaux (Cp149) constituent le domaine d'assemblage qui peut s'auto-assembler in vivo et in vitro en capsides icosaédriques avec principalement une triangulation T = 4 (120 dimères). Les 34 (ou 36) acides aminés restants, riches en arginine, constituent le domaine C-terminal (CTD) qui est essentiel pour l'encapsidation de l'ARN viral prégénomique (pgRNA) par Core. Le CTD peut être phosphorylé jusqu'à 7 fois in vivo, mais seuls trois sites de phosphorylation sont nécessaires à l'encapsidation. Un mutant recombinant de Core a été conçu pour imiter ce scénario en remplaçant les trois sérines clés par des glutamates (Cp183-EEE). Enfin, des molécules qui perturbent l'assemblage de la capside (CAMs pour capsid assembly modulators) en interférant avec les contacts entre les dimères de Core sont de puissants inhibiteurs in vitro de la réplication du VHB et de nouvelles options potentielles de médicaments anti-VHB. Des études in tubo sur la Cp149 ont révélé les modes d'action potentiels des CAMs. Les CAMs semblent agir soit en favorisant l'assemblage, conduisant à la formation de capsides vides (CAM-E), soit en les détournant de la voie d'assemblage, conduisant à des capsides malformées et aberrantes (CAM-A). Certains CAM ont également démontré des effets supplémentaires in vitro, y compris la perturbation de capsides déjà formées et la diminution de l'ADN viral nucléaire (cccDNA).

Nous proposons ici de capitaliser sur notre méthodologie biophysique et structurale originale, qui combine la physique des objets biologiques et la virologie structurale, pour clarifier le mode d'action d'une nouvelle série prometteuse de CAMs basée sur le composé à squelette glyoxamide GLP-26 (Amblard et al, 2020, 2023). Notre méthodologie combine la diffusion des rayons X aux petits angles (SAXS) sur des sources synchrotron et la cryo-microscopie électronique (cryo-EM), y compris des études résolues en temps. Nous l'avons validée avec la caractérisation de deux composés CAM-A et CAM-E prototypiques (Kra et al, 2023). Dans ce projet suite, nous étendrons la méthodologie d’une part à la photométrie de masse, une technique en molécule unique, d’autre part à la modélisation structurale des données SAXS grâce à des simulations Monte Carlo et l'apprentissage automatique. Cette méthodologie modifiée permettra de travailler dans des conditions moins artificielles que celles utilisées jusqu'à présent dans la biophysique de Core. Ainsi des concentrations particulièrement faibles de Core seront utilisées, dans lesquelles il est possible de différencier les comportements d'assemblage de Cp149 et de Cp183/Cp183-EEE, en particulier en présence de CAMs. L'accent sera mis sur deux séries distinctes de CAMs dérivés de GLP-26 : d’une part la forme active d’un dérivé actuellement en essais cliniques, ALG-00184 ; d’autre part des dérivés à double tête GLP-26 (D-CAMs), dont nous venons de montrer qu'ils ont des effets atypiques sur l'assemblage de la capside (Amblard et al., en révision), effets qui doivent être clarifiés.

De nombreuses études ont montré que le niveau de méthylation de certains marqueurs du génome de l’hôte était associé à la sévérité des lésions cervicales HPV-induites. Le projet MethAID vise à évaluer la faisabilité et la valeur prédictive de l’analyse de marqueurs de méthylation de l’ADN de l’hôte sur auto-prélèvements vaginaux (APV) dans le cadre du dépistage du cancer du col de l’utérus chez des patientes atteintes de maladies auto-immunes (MAI), souvent immunodéprimées du fait de leur pathologie ou de leurs traitements immunosuppresseurs.

Objectifs principaux et secondaires

L’objectif principal est de déterminer le caractère prédictif du niveau de méthylation de gènes spécifiques (FAM19A4, miR124-2) pour la sévérité des lésions cervicales précancéreuses.
Les objectifs secondaires incluent :

• l’automatisation de l’analyse des marqueurs de méthylation sur APV
• la caractérisation du niveau basal de méthylation dans cette population particulière
• la comparaison de la performance de ces marqueurs aux techniques conventionnelles (cytologie, typage HPV)
• l’évaluation de leur pertinence en dépistage primaire ou en outil de triage après test HPV

Contexte scientifique

Les femmes atteintes de MAI présentent un surrisque majeur de cancers HPV-induits. Ce risque est multiplié par 8,7 dans le lupus érythémateux systémique (LES) pour les lésions de haut grade et par 4 pour le cancer invasif. Des risques accrus sont également observés dans la polyarthrite rhumatoïde. Par ailleurs, l’adhésion au dépistage est souvent insuffisante dans cette population (≈ 50 % de patientes à jour).

Les APV représentent une alternative intéressante au frottis cervico-utérin (FCU) classique, en améliorant l’accessibilité et l’acceptabilité du dépistage. Toutefois, ils ne permettent pas d’analyse cytologique réflexe en cas de test HPV positif, générant un parcours plus complexe pour les patientes. L’ajout de marqueurs de méthylation automatisés sur APV constituerait donc une avancée majeure, permettant de limiter le recours itératif aux colposcopies tout en rassurant les patientes.

Hypothèses de travail

• Le niveau de méthylation mesuré sur APV est corrélé à la sévérité des lésions cervicales
• L’automatisation de ces tests est techniquement réalisable et indispensable à une intégration en dépistage de masse
• Les seuils de méthylation observés en population générale pourraient ne pas être applicables aux patientes atteintes de MAI, nécessitant une réévaluation spécifique

Méthodologie

L’étude MethAID est conçue comme une étude ancillaire de la cohorte APOSY (276 patientes, Hôpital Bichat-Claude Bernard), qui documente la prévalence et la persistance des infections HPV dans les MAI.

Au total, 381 prélèvements APV seront analysés :

• 276 à l’inclusion (dont 55 HPV-HR positifs),
• 50 en double analyse manuelle vs automatisée,
• 55 issus du suivi à 1 an pour évaluer la persistance virale et la dynamique des marqueurs de méthylation.

Les données de méthylation seront exprimées en log2(Ct ratio), comparées aux résultats virologiques et cytologiques, puis intégrées dans des modèles statistiques uni- et multivariés (tests de Wilcoxon, modèles de Cox).

Aspects éthiques

Le protocole respecte les dispositions approuvées par le CPP (NCT06302725, IRB Île-de-France XI), incluant la conservation des échantillons pour analyses ultérieures.

Retombées attendues

Le projet MethAID devrait :

• démontrer la faisabilité technique de l’automatisation de la méthylation sur APV
• fournir les premières données spécifiques aux patientes atteintes de MAI
• permettre de vérifier l’applicabilité des seuils de méthylation
• initier une stratégie innovante de dépistage personnalisé pour cette population à haut risque, réduisant les consultations inutiles et le stress lié aux résultats HPV positifs

L’insécurité alimentaire, définie comme l’accès incertain ou limité à une alimentation sûre, adéquate et acceptable, demeure l’un des défis majeurs de santé mondiale, touchant de manière disproportionnée l’Afrique subsaharienne, où elle est fortement associée à des effets délétères chez les personnes vivant avec le VIH, tels qu’une moindre observance du traitement antirétroviral (TAR), une progression accrue de la maladie, une détérioration de la santé mentale et des comportements à risque. Les adolescent·e·s, population particulièrement vulnérable, sont exposé·e·s à un risque accru en raison de leurs besoins nutritionnels plus élevés pendant la croissance, de la charge que le VIH impose au système immunitaire et des effets secondaires à long terme du TAR, qui interagissent avec des contraintes structurelles plus larges telles que la pauvreté, la stigmatisation et la précarité alimentaire au sein des ménages. En Côte d’Ivoire, plus de 20 000 adolescent·e·s et jeunes vivent avec le VIH (AVVIH), et l’intersection entre insécurité alimentaire, malnutrition, obésité, carences en micronutriments et maladies infectieuses crée un double fardeau encore peu prise en compte dans les programmes nationaux de santé et de nutrition, souvent centrés sur la santé maternelle et infantile tout en négligeant les besoins des adolescent·e·s. Bien que des projets antérieurs aient montré que les adolescent·e·s possèdent des connaissances importantes en matière de nutrition et de bonnes pratiques, des barrières socio-économiques, la faiblesse des interventions scolaires et le marketing omniprésent d’aliments transformés peu sains limitent leur capacité à adopter une alimentation plus saine, révélant un écart entre les connaissances et leur mise en pratique.

Le projet FINAH vise à explorer comment l’insécurité alimentaire affecte les AVVIH, dans le but ultime de co-développer des interventions culturellement appropriées qui répondent directement à leurs réalités vécues. Les objectifs spécifiques sont :

• Identifier les interventions nutritionnelles existantes, évaluer leur efficacité et explorer les opportunités ainsi que les barrières dans la prise en charge des besoins des AVVIH en Côte d’Ivoire.

• Explorer les points de vue des AVVIH, de leurs parents/tuteurs et des prestataires de soins de santé sur l’insécurité alimentaire, la malnutrition et leurs conséquences sur la santé des AVVIH en Côte d’Ivoire.

FINAH adopte une méthodologie participative communautaire qui implique les adolescents comme collaborateurs actifs. Des pairs éducateurs — sélectionnés parmi les cohortes d’AJVVIH déjà impliquées dans des projets connexes — seront formés pour participer à l’élaboration des outils de recherche, à l’appui au recrutement et à la contribution à l’interprétation et à la diffusion des données.

Des entretiens avec des informateurs clés seront ensuite menés auprès de représentants d’organisations nationales et internationales afin de cartographier les interventions existantes, d’évaluer leur efficacité et d’identifier les opportunités et les barrières dans la réponse aux besoins des AJVVIH. Parallèlement, des discussions de focus groupe (FGD) et des entretiens semi-structurés seront menés avec des adolescents et jeunes âgés de 15 à 24 ans, des parents/tuteurs et des prestataires de soins de santé pour explorer les mécanismes par lesquels l’insécurité alimentaire influence la santé, l’adhésion au TAR et les stratégies d’adaptation. Les données seront analysées à l’aide du logiciel NVivo, en combinant un codage déductif basé sur un cadre conceptuel préexistant et un codage inductif permettant de faire émerger de nouveaux thèmes, et par triangulation.

En combinant une approche participative et des méthodes qualitatives structurées, le projet FINAH, de 1 an, vise à produire des connaissances approfondies sur l’intersection entre l’insécurité alimentaire, la nutrition et le VIH chez les adolescents et jeunes, et à co-créer des interventions concrètes et adaptées au contexte, susceptibles d’améliorer à la fois la santé nutritionnelle en Côte d’Ivoire, tout en apportant des données probantes utiles aux politiques et pratiques à plus large échelle.