Projets et candidats lauréats

Les travaux antérieurs de notre équipe sur l’évolution de VIH en France ont montré que la pression de sélection exercée à l’échelle individuelle par la réponse neutralisante se répercutait à l’échelle de l’espèce virale (échelle populationnelle). Cette évolution est matérialisée par une augmentation de la résistance à la neutralisation du VIH-1 de sous-type B sur 20 ans d’épidémie, entre 1987 et 2010, et du VIH-1 de clade CRF02_AG entre 1997 et 2012. Cette évolution était également associée à une augmentation des propriétés infectieuses du virus en culture cellulaire. Cependant, l’évolution semble nettement moins marquée sur la seconde période d’étude. On peut se poser la question d’un plateau d’adaptation du VIH à la réponse neutralisante humorale de l’homme et, compte tenu du rôle des glycoprotéines d’enveloppe, on peut également s’interroger sur l’évolution des propriétés phénotypiques du virus comme son infectivité en culture cellulaire.

Plusieurs anticorps monoclonaux neutralisants à large spectre (broadly neutralizing antibodies ou bNAbs) sont désormais dans des essais cliniques avancés (phase 2 ou 3) pour une utilisation thérapeutique, en prophylaxie et dans des stratégies de cure fonctionnelle. Contrairement aux antirétroviraux actuellement disponibles, les outils de prédiction génotypique de leur activité in vitro ne sont pas suffisamment développés mais sont pourtant cruciaux pour guider le choix des bNAbs à utiliser dans les essais cliniques et pour la sélection des patients à inclure dans ces études afin d’en optimiser les chances de succès et en comprendre les résultats.

Les principales questions auxquelles nous souhaitons répondre dans ce projet sont :

1) L’évolution de la sensibilité du VIH-1 de sous-type B et CRF02_AG à la neutralisation s’est-elle poursuivie au cours des 10 dernières années ?

2) Quel impact de cette évolution sur la sensibilité aux bNAbs actuellement envisagés en clinique sur les souches circulant en France ces dernières années, échantillons représentatifs de la diversité virale ?

Pour cela nous produirons des virus pseudotypés porteurs des protéines d’enveloppes de variants T/F (transmitted/founder viruses) de sous-types B et CRF02_AG issues de prélèvements de patients identifiés au stade de la primo-infection collectés entre 2019 et 2022 (cohorte ANRS PRIMO). La sensibilité à la neutralisation de ces virus sera étudiée vis à vis de sérums neutralisants et d’un panel de bNAbs en cours d’essais cliniques. L’infectiosité en culture cellulaire sera également mesurée pour évaluer l’impact sur les propriétés fonctionnelles.

La sensibilité au même panel de bNAbs sera également mesurée pour des virus pseudotypés porteurs des protéines d’enveloppes de variants T/F représentatifs d’une très grande diversité (sous-types purs et CRFs) des virus récemment transmis en France (2019-2022). L’ensemble des données de neutralisation (B, CRF02_AG et autres génotypes) permettra d’identifier les bNAbs ou l’association de bNAbs qui devront être privilégiés ultérieurement pour des essais cliniques.

3) Peut-on prédire par un test génotypique l’activité neutralisante des bNAbs de manière pangénotypique ou au niveau du sous-type?

Les données de neutralisation (concentration inhibitrice 50) seront couplées aux données de séquençage (gène env complet) pour l’ensemble du panel de virus (>200 variants T/F) pour améliorer les outils de prédictions génotypiques existants et évaluer les performances sur les génotypes majoritaires (B notamment) et ceux moins étudiés dans les panels actuels (CRF02_AG et autres recombinants).

La méthodologie en place ainsi que les banques de virus disponibles dans notre laboratoire, l’importance relativement unique de la diversité du VIH-1 en France, et l’opportunité de disposer de matériel biologique collecté depuis dans la cohorte ANRS PRIMO (prélèvements précoces, collectés au stade de primo-infection ou séroconversion récente, donc contenant des virus T/F), nous permettront de répondre avec pertinence aux questions posées et ainsi de situer notre recherche en bonne position au plan international.

En plus des éléments cis-régulateurs localisés dans la longue répétition terminale 5’ (LTR 5’) du virus de l’immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1), notre laboratoire a identifié une importante région cis-régulatrice intragénique (IRR), présentant une activité enhancer sur le promoteur viral localisé dans le LTR5’. A l’origine identifiée comme étant associée à une région chromatinienne ouverte dans un contexte myéloïde uniquement, nos résultats récents ont montré que l’IRR était également critique pour médier la transcription et la réplication du VIH-1 dans des lymphocytes T infectés, démontrant l’importance d’étudier le rôle fonctionnel de l’IRR dans les deux contextes cellulaires d’infection par le VIH-1. De manière intéressante, nous avons identifié dans l’IRR trois sites de liaison pour le facteur de transcription myeloïde-spécifique PU.1. Le présent projet de recherche vise à comprendre plus avant les mécanismes moléculaires régulant la transcription et la latence du VIH-1 dans les deux cibles cellulaires majeures de l’infection, en étudiant le rôle joué par l’IRR sur l’activité promotrice du LTR5’. Dans la première partie du projet, nous étudierons le rôle du facteur de transcription myeloïde-specifique PU.1 dans la régulation transcriptionnelle et épigénétique du VIH-1 dans un modèle d’infection hautement physiologique, en réalisant des expériences d’infection de macrophages primaires dérivés de monocytes (MdMs) avec des particules virales contenant le génome viral du VIH-1 sauvage ou muté au niveau des sites intragéniques de liaison pour le facteur PU.1. Ensuite, afin de caractériser davantage le rôle fonctionnel de PU.1 dans la transcription et la réplication du VIH-1, nous inhiberons la liaison de PU.1 par une approche pharmacologique en utilisant un composé appelé diamidine hétérocyclique DB2115, connu pour inhiber sélectivement la liaison de PU.1 à ses sites cibles. Dans la seconde partie du projet, nous étudierons le rôle du facteur nucléaire T-spécifique se liant aux PU-boxes de l’IRR dans un contexte d’infection T-lymphocytaire. Nous étudierons le rôle de ce facteur dans la régulation transcriptionnelle et épigénétique du VIH-1 afin de démontrer les fonctions critiques jouées par l’IRR dans les deux contextes cellulaires majeurs d’infection par le VIH-1. Dans la dernière partie du projet, étant donné que la régulation transcriptionnelle du VIH-1 est un mécanisme multifactoriel complexe, comprenant de multiples niveaux de contrôle dont la structure tri-dimensionnelle (3D) de la chromatine, nous étudierons le rôle de protéines architecturales sur la régulation de la structure chromatinienne 3D des cellules infectées par le VIH-1. Plus précisément, dans l’IRR mais également le long du provirus VIH-1, nous avons identifié des sites de liaison pour CTCF et YY1, deux protéines architecturales impliquées dans la formation de boucles chromatiniennes. De plus, notre laboratoire a acquis une expertise importante dans la caractérisation des boucles chromatiniennes médiées par CTCF en étudiant d’autres rétrovirus dont le BLV et le HTLV-1. Afin d’étudier si le provirus du VIH-1 est capable de modifier l’organisation 3D de la chromatine dans les cellules infectées, nous étudierons le recrutement in vivo de CTCF et YY1 le long du provirus VIH-1 ainsi que leurs potentielles interactions 3D, par des expériences de 4C-seq. Par des expériences de CRISPR/Cas9, nous muterons ensuite les différents sites de liaison viraux pour CTCF et YY1 afin d’abolir la formation des boucles chromatiniennes et de caractériser le rôle fonctionnel de ces facteurs dans la latence virale et sur le transcriptome de la cellule infectée. Cette partie du projet de recherche contribuera à une meilleure compréhension des interactions 3D entre le provirus VIH-1 et son environnement génomique. En conclusion, notre projet de recherche permettra une connaissance plus approfondie des mécanismes moléculaires associés à la transcription et à la persistance du VIH-1 dans les deux réservoirs cellulaires majeurs du VIH-1 latent, ainsi que de nouvelles options thérapeutiques innovantes visant à contrôler l’infection virale.

Le virus de l’hépatite E (HEV) est responsable de plus de 20 millions d’infections et 70000 décès par an. Cette infection provoque des hépatites aiguës mais peut devenir chronique chez les patients immunodéprimés ou fulminante notamment chez les femmes enceintes. En raison de l’évolution vers la chronicité, sa transmission par transfusion sanguine, du nombre croissant de cas et des complications chez les patients souffrant d’une maladie hépatique préexistante, l’infection par le HEV est désormais considérée comme un problème émergent dans les pays industrialisés. L’immunité innée via la production d’interféron de type I (IFN-I) est essentielle pour le contrôle en phase aiguë et précoce des infections virales. Des données in vitro suggèrent que le HEV a probablement mis en place des mécanismes lui permettant d’inhiber la réponse antivirale de l’hôte. Cependant, notre connaissance est encore très partielle. Paradoxalement, les molécules induites par la réponse IFN-I sont détectées chez les patients infectés et les animaux expérimentalement infectés. Ceci implique donc l’existence des mécanismes alternatifs de détection des cellules infectées, pouvant contourner l’inhibition dans les cellules infectées. Dans le contexte d’autres infections virales, nous avons récemment découvert un mécanisme de reconnaissance des cellules infectées pas un type de cellules immunitaires spécialisées pour la production d’IFN-I, les cellules dendritiques plasmacytoïdes (pDCs). De manière intéressante, nos résultats préliminaires montrent que les pDCs détectent les cellules infectées par le HEV par contact cellulaire induisant la production d’une quantité massive d’IFN-I.

Ainsi, nous proposons un projet visant à définir la modulation de la réponse IFN-I par le HEV et en particulier par la protéine de capside ORF2. En effet, nous avons récemment démontré qu’au cours du cycle viral, le HEV produit distinctes formes de la protéine de capside ORF2, présentant des modifications co- et post-traductionnelles différentes. Ces formes ORF2 sont : i) la forme ORF2i (infectieuse) associée aux particules infectieuses et ii) les formes ORF2g (glycosylée) et ORF2c (clivée) qui ne sont pas associées à du matériel infectieux, mais produites massivement et sont les antigènes viraux majeurs présents dans le sérum des patients infectés par le HEV. Ces formes ORF2 ont des localisations subcellulaires distinctes : ORF2i est cytosolique ou nucléaire, alors que les formes ORF2g/c sont principalement réticulaires. De plus, nos résultats préliminaires suggèrent que la translocation nucléaire d’ORF2i inhibe l’expression de plusieurs gènes appartenant aux signalisations antivirales ou inflammatoires, en lien avec l’activateur transcriptionnel NF-kB. Ainsi, nous proposons que les différentes formes de l’ORF2 moduleraient distinctivement les réponses innées dans les cellules infectées ainsi que par les pDCs. Nous avons alors pour objectifs de définir :

-comment les différentes formes et localisations subcellulaires d’ORF2 influencent le profil d’expression des gènes dans les cellules infectées (Aim I).

-comment la réponse IFN-I par les pDC est activée et régulée par l’infection par le HEV (Aim II). Nous étudierons notamment comment les différentes formes d’ORF2 modulent les fonctions des pDC et quel est l’impact de la signalisation antivirale par les pDC sur la réplication du HEV et les réponses antivirales dans les cellules infectées.

La production, à partir d’un gène unique codant pour la capside virale, de multiples formes d’ORF2 ayant des localisations différentes est un aspect original et nouvellement découvert. Notre projet permettra d’identifier de nouveaux mécanismes de régulation de la réponse antivirale par le HEV. Dans une perspective plus large, notre projet permettra d’acquérir de nouvelles connaissances sur la biologie des pDC, notamment sur la modulation par des glycoprotéines virales. Les résultats obtenus serviront de cadre d’étude pour d’autres virus connus pour sécréter de larges quantités de glycoprotéines. Outre ces avancées en recherche fondamentale, nos travaux contribueront à définir de cibles pour le développement de traitements thérapeutiques.

Malgré l’avènement des traitements antirétroviraux combinés, l’incidence des lymphomes de Hodgkin n’a pas diminué chez les patients infectés par le VIH et est toujours 5 à 20 fois plus importante que dans la population générale. Les lymphomes de Hodgkin du patient infecté par le VIH sont associés dans 90% des cas au virus d’Epstein-Barr alors que l’association avec l’EBV est de moins de 40% dans les lymphomes de Hodgkin du patient non infecté par le VIH. L’hypothèse communément admise est que les lymphomes de Hodgkin associés au VIH sont des lymphomes EBV-induit. Le virus EBV interviendrait dans la lymphomagénèse par l’action synergique de différentes protéines virales interférant dans la survie et la prolifération cellulaire. La diminution du contrôle immunitaire spécifique anti-EBV pourrait être un facteur favorisant le développement des lymphomes de Hodgkin associés au VIH. Les études de l’immunité cellulaire spécifique de l’EBV ne montrent pas clairement un rôle d’une perte des réponses T dans la genèse des lymphomes de Hodgkin du sujet VIH+. De plus ces lymphomes tendent à survenir à un stade précoce de l’infection à VIH alors que le patient est encore relativement immunocompétent au regard de son taux de cellules CD4+. En comparaison avec l’immunité cellulaire, l’immunité humorale a peu été explorée dans la physiopathologie des maladies associées à l’EBV, en particulier le rôle des anticorps neutralisants anti-EBV dont le rôle fonctionnel est de bloquer l’infection des cellules cibles. Une étude récente a montré qu’un titre élevé en anticorps neutralisants anti-EBV était associé à un plus faible risque de développer un cancer du cavum associé à l’EBV. Le but de notre étude est de comparer le titre en anticorps neutralisants anti-EBV dans une population de patients infectés par le VIH avec un lymphome de Hodgkin (cohorte ANRS Co16 Lymphovir) et une population contrôle de patients infectés par le VIH sans lymphome de Hodgkin. Notre hypothèse est que le titre en anticorps neutralisants anti-EBV peut être un marqueur des lymphomes de Hodgkin associés au VIH. Ce projet allie à la fois l’expertise du Pr Poignard sur les anticorps neutralisants et celle du laboratoire de virologie de Grenoble sur le diagnostic des maladies associées à l’EBV. Comme perspectives à plus long terme, une meilleure compréhension de la nature des réponses anticorps neutralisantes et de leurs épitopes pourra aider au développement d’un vaccin efficace contre les maladies associées à l’EBV.