Projets et candidats lauréats

Il est désormais bien établi que la communication bidirectionnelle entre les systèmes immunitaire et nerveux joue un rôle clé dans l’initiation et le développement des réponses de l’hôte aux infections et autres signaux de danger. Nous avons récemment fait l’observation fortuite que des cellules b3-tubuline (TUBB3)+ (un marqueur pan-neuronal) sont présentes dans les poumons de souris infectées par M. tuberculosis à proximité des granulomes. Ce résultat suggère que l’infection par M. tuberculosis induit soit une axonogenèse à partir de terminaisons nerveuses existantes, soit une neurogenèse à partir de précurseurs neuronaux, un résultat récemment rapporté dans le contexte des tumeurs solides de la prostate. Nous avons pu montrer que ces cellules possèdent un noyau, suggérant une neurogenèse locale, et nous souhaitons dans le présent projet caractériser finement ces cellules par des approches scRNAseq, RT-qPCR, FISH et immuno-histochimie, valider ces résultats dans des échantillons de poumons et de ganglions lymphatiques de primates non humains infectés et de patients tuberculeux, et évaluer si l’ablation de ces cellules a un impact sur la réponse immunitaire anti-TB. Ces résultats pourraient ouvrir une voie de recherche entièrement nouvelle dans le domaine de la neuroimmunologie de la tuberculose, un domaine inexploré à ce jour.

La tuberculose (TB) demeure l’une des maladies infectieuses les plus meurtrières au monde, et l’émergence de souches de Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis) résistantes aux antibiotiques compromet l’efficacité des traitements actuels. De nouvelles stratégies thérapeutiques sont donc nécessaires. Au cours de l’infection, M. tuberculosis est soumise à un stress génotoxique généré par la réponse immunitaire de l’hôte et l’exposition aux antibiotiques. Pour survivre, la bactérie mobilise des mécanismes de réparation de l’ADN qui, tout en préservant l’intégrité du génome, favorisent l’émergence de résistances par leur activité mutagène. Pourtant, ces voies restent encore mal caractérisées et largement sous-exploitées comme cibles thérapeutiques. De plus, les processus moléculaires par lesquels le système immunitaire de l’hôte endommage l’ADN de M. tuberculosis sont toujours inconnus.

Le projet d’initiation TB-DNABREAK propose de tester si l’inhibition des voies de réparation de l’ADN de M. tuberculosis, combinée à l’induction du stress génotoxique induit par l’hôte, peut ouvrir la voie à une nouvelle approche thérapeutique innovante. Deux objectifs complémentaires seront menés : (i) développer une stratégie de criblage en cellule entière pour identifier de petites molécules inhibitrices de voies de réparation de l’ADN chez M. tuberculosis et (ii) exploiter une souche rapporteur de mycobactérie permettant de détecter les dommages à l’ADN subis par le pathogène au sein de l’hôte et de réaliser un criblage pilote de composés amplifiant les réponses génotoxiques immunitaires.

Le projet s’appuiera sur des approches de génétique moléculaire, des systèmes fluorescents innovants et du criblage à haut débit de petites molécules. La méthode de split-GFP bipartite sera utilisée pour détecter des interactions protéiques clés de la réparation de l’ADN et identifier des inhibiteurs, tandis qu’une souche rapporteur fluorescente de mycobactérie permettra de visualiser les lésions de l’ADN subies par la bactérie aussi bien in vitro que lors de l’infection et permettra un premier crible de petites molécules activatrices de la génotoxicité générée par l’hôte.

Durant une année, ce projet d’initiation fournira des outils et des preuves de concept importants : un outil de criblage de molécules inhibitrices de la réparation de l’ADN chez M. tuberculosis, une souche rapporteur mycobactérienne pour la détection des dommages génotoxiques subis lors de l’infection, et de premières molécules candidates ciblant les voies de réparation bactériennes ou la réponse génotoxique de l’hôte. Ces avancées établiront les bases d’approches thérapeutiques anti-tuberculeuses innovantes, pensées pour maximiser l’élimination du pathogène tout en limitant l’acquisition de résistances aux antibiotiques.

Le projet de recherche fondamentale DYNABUD se concentre sur le bourgeonnement du Virus de l’Immunodéficience Humaine de type 1 (VIH-1). Une étape clé de son cycle de réplication est le clivage de la membrane plasmique pour libérer les particules virales. Pour cela, le VIH-1 détourne la machinerie ESCRT-III de la cellule hôte pour assurer la scission membranaire, un mécanisme également essentiel dans d’autres processus cellulaires comme la cytokinèse.

Les protéines ESCRT-III ont la capacité de passer d'un état monomérique inactif à une forme ouverte, compétente pour la polymérisation et la liaison membranaire. In vitro, les protéines CHMP4B s'assemblent en filaments spiralés, tandis que les protéines CHMP2A et CHMP3 forment des copolymères hélicoïdaux sous forme de tubes. Néanmoins, la cinétique et l'architecture moléculaire des filaments de CHMP2A, CHMP3 et CHMP4B au niveau du col de bourgeonnement du VIH-1 in situ sont encore inconnues. Définir l'organisation spatiale de ces filaments, leur mode d'assemblage et de remodelage, ainsi que la contribution de chaque composant à la déformation et à la fission membranaire, constitue une question centrale.

Le projet aborde ces questions à travers trois objectifs principaux :

1. Analyser la dynamique temporelle de la polymérisation des filaments ESCRT-III aux sites de bourgeonnement du VIH-1.

1. 1. La stratégie d'édition génomique CRISPR-Cas9 a permis de marquer endogènement CHMP2A avec la protéine fluorescente mNeonGreen. Cette approche sera étendue à CHMP3 et CHMP4B en utilisant des fluorophores spectralement distincts.
   2. La microscopie de fluorescence à réflexion totale interne (TIRF) à haute vitesse sera employée pour la visualisation en temps réel du recrutement, de l'échange et de la disparition des protéines CHMP2A, CHMP3 et CHMP4B aux sites de bourgeonnement natifs du VIH-1 dans des cellules vivantes. Cela permettra une quantification précise de la cinétique de renouvellement des filaments.

1. Déterminer l'architecture nanométrique des filaments ESCRT-III aux sites de bourgeonnement natifs.

1. 1. Le projet s'appuiera sur la mise en œuvre réussie de la microscopie de super-résolution DNA-PAINT, qui a fourni les premières images à haute résolution de filaments CHMP2A aux sites de bourgeonnement du VIH-1 in vivo.
   2. La capacité de multiplexage de DNA-PAINT sera exploitée pour résoudre les transitions structurelles et l'organisation spatiale des filaments individuels de CHMP2A, CHMP3 et CHMP4B le long du col de bourgeonnement.
   3. Une sonde spécifique des lipides sera utilisée pour visualiser la membrane plasmique, permettant de définir l'organisation des ESCRT-III par rapport à la morphologie membranaire.
   4. Le 3D-PAINT sera également déployé pour visualiser l'architecture des filaments en trois dimensions.

1. Etude des mécanismes de l'activité antivirale de rétroCHMP3 pendant le bourgeonnement du VIH-1.

1. 1. La protéine rétroCHMP3 est une variante naturelle mutée et tronquée de CHMP3 qui inhibe sélectivement le bourgeonnement viral sans compromettre les processus cellulaires hôtes. Ses mécanismes précis d'interférence avec les filaments ESCRT-III restent indéfinis.
   2. Le projet caractérisera in vitro la capacité des protéines rétroCHMP3 à co-assembler avec CHMP2A en tubes hélicoïdaux et leur compétence pour le clivage membranaire.
   3. In vivo, la vidéo-microscopie TIRF et DNA-PAINT définira la distribution nanométrique et la dynamique de recrutement de rétroCHMP3 par rapport aux ESCRT-III endogènes. La structure des filaments de rétroCHMP3 sera déterminée pour fournir des informations structurelles sur son intégration au sein des assemblages ESCRT-III.

En intégrant le profilage cinétique avec l'architecture nanométrique, le projet révélera comment chacune des sous-unités ESCRT-III coopère pour la scission membranaire. L'étude de rétroCHMP3 permettra de démêler les mécanismes spécifiques par lesquels cet inhibiteur endogène bloque le bourgeonnement viral sans altérer les fonctions cellulaires essentielles. Ces résultats devraient faire progresser considérablement la compréhension des interactions virus-hôte.