Projets et candidats lauréats

Le virus de l’hépatite E (VHE), un virus à ARN positif, est la principale cause d’hépatite virale aiguë. VHE est reconnu comme un problème de santé publique dans les régions en développement. Il existe peu de données sur le rôle de la réponse immunitaire de l’hôte dans la pathogenèse de l’infection par le VHE. Nouveaux résultats d’études cliniques et épidémiologiques, associés à des taux élevés d’hépatite et de taux de mortalité élevés, ainsi qu’aux effets de la morbidité et de la mortalité maternelles. La réponse immunitaire innée est cruciale pour le confinement précoce de virus et joue un rôle clef pour la mise en place de la réponse adaptative spécifique.

En début de la grossesse humaine, les leucocytes tissulaires maternels présents dans la decidua sont représentés par une population majoritaire de cellules dNK (70%) et des macrophages deciduaux (20%). Ces cellules immunitaires innées ont un rôle clef dans la mise en place de l’interface mère-fœtus et dans le développement du placenta et du fœtus ainsi que dans la mise en place de la tolérance fœtale. Elles assurent également un rôle antimicrobien canonique pour la protection du fœtus contre les infections venant de la mère. 

Le projet de recherche de notre équipe vise à comprendre l’infection virale par l’hépatite E et la plasticité fonctionnelle des cellules immunitaires innées de l’interface mère-fœtus. Nous caractérisons tout d’abord l’impact de l’infection par le VHE sur la fonction des cellules stromales (trophoblastes, macrophages, cellules mésenchymateuses) à l’interface mère-fœtus. Définirons ensuite les mécanismes intrinsèques de contrôle / exacerbation de l’infection VHE. Enfin, nous déterminerons la plasticité fonctionnelle des cellules NK au niveau cellulaire et moléculaire, et nous analyserons l’impact de l’infection sur le dialogue entre les cellules NK et les macrophages.

Pour mieux étudier la réponse immunitaire au VHE, nous avons donc mis au point un modèle cellulaire innovant capable d’exprimer les protéines ORF2 et ORF3 du génotype 1 ou 3 du VHE. Nos préliminaires résultats montrent que les cellules NK sont capables de détecter le signal de stress dû à l’expression des protéines virales, de s’activer et d’enclencher leur fonction effectrice cytotoxique via la formation d’une synapse immunologique. Dans notre modèle de grossesse, nous avons également établi et créé un nouveau système d’expression de lentivirus qui permet la transduction de cellules tissus primaires avec une grande efficacité. Ces outils précieux vont nous permettre de mieux appréhender les questions posées sur le dialogue NK-macrophages et passer outre la difficulté de faible taux d’infection par VHE ex vivo.

En conclusion, ce projet nous permettra de disséquer l’interaction entre les composants immunitaires de l’hôte au cours de l’infection par le VHE et apportera de nouvelles informations pouvant aider à la compréhension de la pathogenèse du VHE pendant la grossesse.

Les macrophages (Mϕ) jouent un rôle clé dans la physiopathologie de l’infection VIH. Ils contribuent à la dissémination et sont d’importants réservoirs du virus. Ce sont les cellules cibles du virus dans le système nerveux central (SNC), dont l’infection conduit à des troubles neurologiques chez près de 50 % des patients. Etonnament, les mécanismes qui sous-tendent l’entrée du virus dans les Mϕ ne sont pas parfaitement élucidés. La majorité des virus qui infectent les Mϕ sont de tropisme R5, mais beaucoup des virus R5 ne sont que peu ou pas capables d’infecter les Mϕ, à la différence des lymphocytes T CD4 (LTCD4). Cela a trait à l’expression de facteurs de restriction dans les Mϕ, mais aussi comme nous venons de l’illustrer (Colin, PLoS Pathog, 2018), à des blocages à l’entrée virale. Pour des raisons qu’il conviendra d’identifier, l’efficacité d’utilisation de CCR5 par les virus (inversement proportionnelle au nombre de molécules de CCR5 requises à l’entrée virale) est moindre dans les Mϕ que dans les LTCD4. Nos résultats suggèrent que cela est lié à la nature des conformations de CCR5 qui diffèrent entre les Mϕ et les LTCD4. De manière intéressante, l’efficacité d’infection des Mϕ est augmentée lorsque ces cellules interagissent puis fusionnent avec des LTCD4 infectés (Bracq, JVI, 2017 ; et nos données préliminaires). Cela suggère donc que les contraintes habituellement rencontrées par les virus R5 pour infecter les Mϕ, et donc probablement la faible efficacité de leurs interactions avec CCR5, sont contournées lors d’un transfert viral entre les LTCD4 et les Mϕ.

Nous pensons que l’interaction Env/CCR5 est l’étape clé dont dépend le tropisme Mϕ des virus R5, et pour illustrer cela, nous poursuivrons trois objectifs spécifiques. i/ Nous caractériserons ces formes de CCR5 sur les Mϕ, comparativement à celles présentes dans les LTCD4. Nous souhaitons montrer que le caractère plus ou moins marqué du tropisme Mϕ des virus R5 varie suivant qu’ils sont capables d’exploiter ces conformations particulières de CCR5 à la surface des Mϕ. La permissivité des Mϕ à VIH varie aussi considérablement d’un donneur à l’autre, suivant l’origine tissulaire ou la polarisation de ces cellules, et nous chercherons à savoir si cela a trait à des modifications des propriétés structurales du corécepteur. Nous rechercherons enfin si des différences existent dans la nature des formes de CCR5 qu’expriment les Mϕ d’individus sains et de patients selon qu’ils ont ou pas développé des troubles neurocognitifs. ii/ Nous étudierons l’hypothèse que les virus R5 M- et non M-tropiques se distinguent par la nature des voies de signalisation de CCR5 qu’ils mobilisent. En effet, nous venons de montrer que les Envs de différentes souches de virus ne se lient pas nécessairement aux mêmes conformations de CCR5 à la surface cellulaire et ce faisant, n’activent pas les mêmes voies de signalisation intracellulaires en aval du corécepteur. Or la littérature atteste que la signalisation de CCR5 régule de manière critique l’accomplissement du cycle viral dans les Mϕ. iii/ Nous voulons enfin montrer que l’accroissement de l’efficacité d’infection des Mϕ via des contacts avec des LTCD4 conduit à ce que la majorité des virus R5 infectent les Mϕ. Nous pensons en effet que des expériences basées sur l’utilisation de virus libres ont depuis longtemps sous estimé la proportion des virus susceptibles d’infecter les Mϕ. Nous évaluerons aussi l’hypothèse que la formation de complexes entre les LTCD4 et les Mϕ conduit à accroitre l’efficacité des interactions Env/CCR5. Réciproquement, nous développerons des approches de vidéomicroscopie pour montrer que ces interactions jouent un rôle clé pour stabiliser les contacts entre LTCD4 et Mϕ et ainsi permettre à ces deux cellules de fusionner.

Ce projet est le fruit d’une réflexion entre nos deux équipes spécialisées depuis longtemps dans les mécanismes de l’entrée virale (B. Lagane) et de l’infection des Mϕ (S. Benichou). Il entend éclaircir les mécanismes moléculaires de l’entrée de virus R5 dans les Mϕ et ainsi mieux appréhender le rôle de ces cellules dans divers aspects de la physiopathologie de l’infection VIH.

Les virus responsables du SIDA, HIV-1 et HIV-2, ont développé des protéines dîtes auxiliaires afin d’échapper aux défenses immunitaires de l’hôte. Ces protéines virales inactivent les facteurs de restriction qui inhibent la réplication virale. Ainsi, Vpx, qui appartient à la lignée lentivirale HIV-2/SIVsmm, augmente l’infection virale en induisant la dégradation du facteur cellulaire SAMHD1. La dégradation de SAMHD1 ne permet pas d’expliquer l’ensemble des phénotypes associés à Vpx, ce qui nous a conduit à rechercher de nouvelles protéines cellulaires ciblées par cette protéine virale Vpx. Suite à un crible protéomique, nous avons identifié le complexe HUSH en tant que nouvelle cible de Vpx, un complexe composé des protéines Tasor, MPP8 et periphilin, et qui est impliqué dans la répression épigénétique de transgènes. Nos résultats montrent une diminution de l’expression de HUSH dans les cellules primaires et dans les cellules infectées par un virus HIV-2 qui exprime Vpx. Vpx interagit avec HUSH et induit sa dégradation par le protéasome, via le recrutement d’une ubiquitine ligase assemblée par DCAF1. De ce fait, Vpx est capable de réactiver des virus latents dans un modèle de latence, contrairement à des mutants de Vpx incapables d’assurer la dégradation de HUSH. De plus, nous avons montré que la fonction d’antagonisme de HUSH est spécifique de protéines virales issues de certaines espèces de singe. L’ensemble de nos résultats révèle que HUSH est un facteur de restriction au même titre que SAMHD1, actif dans les cellules T primaires CD4+ et contrecarré par Vpx.

Notre hypothèse est donc que HUSH représente un facteur additionnel clé de la latence virale chez les individus infectés par les virus HIV. Le projet présenté vise à étudier le rôle de la restriction HUSH dans la pathogénèse chez le patient. Dans cette optique, trois axes sont proposés :

1- Identification d’un peptide ou molécule qui induirait la dégradation de HUSH.

Le but ultime de cet axe est de tester si l’inactivation de HUSH peut permettre de réactiver des virus latents présents dans les cellules de patients infectés. Malheureusement, l’outil « Vpx » ne permet pas d’aborder cette question car le simple fait de « transfecter » ou « transduire » des cellules les active et réveille les virus indépendamment de la présence de toute protéine virale. Ainsi, mimer l’activité de Vpx avec un peptide ou molécule pourrait constituer une alternative pour valider nos conclusions sur des échantillons cliniques.

2- Etude de protéines Vpx issues de patients HIV-2 à différents stades de la maladie afin d’établir une corrélation potentielle entre l’inactivation de HUSH et la pathogénèse.

Nous faisons l’hypothèse que l’évolution de la maladie chez des patients infectés par le virus HIV-2 pourrait dépendre (entre autres) de variations au niveau des séquences de Vpx qui auraient un impact sur la dégradation de HUSH.

3- Etude d’une corrélation potentielle entre l’activité de HUSH et la virémie chez les patients infectés par HIV-1 ou HIV-2.

Nous proposons d’étudier s’il existe une corrélation entre l’activité de HUSH, mesurée via l’expression des gènes cibles de HUSH (dont l’expression est favorisée si HUSH est inactivée) et les taux d’ARN viral plasmatique (rapportés aux charges d’ADN viral intégré).

Nous espérons que l’ensemble de nos résultats permettra de caractériser le rôle de la restriction HUSH chez les patients infectés.

L’infection par le virus de l’hépatite B (VHB) est l’un des principaux facteurs de risque d’hépatite chronique, de fibrose hépatique, de cirrhose et de cancer hépatocellulaire (CHC). L’inflammation joue un rôle important dans la clairance virale. Mais une inflammation excessive cause des lésions hépatiques et peut accélérer la progression de la fibrose et développement du CHC. L’HBC provoque le dysfonctionnement des réponses immunitaires innées et adaptatives impliquant les monocytes/macrophages, les cellules dendritiques (DC), les cellules tueuses naturelles (NK), les cellules B et les cellules T. Cependant, les mécanismes qui lient les altérations immunitaires induites par le VHB et les atteintes hépatiques liées au VHB restent mal compris. Dans le projet proposé, nous visons à étudier le microenvironnement immunitaire dans différents groupes bien définis de patients atteints d’HBC et appartenant à différents stades de fibrose en comparaison à des échantillons de foies provenant d’individus sains. Nous utiliserons une technique de pointe, l’imagerie multiplexée CODEX, pour analyser la distribution des sous-populations immunitaires in situ, leurs interactions dans le tissue, ainsi que leurs réponses antivirales associées. Enfin, dans une approche mécanistique, nous étudierons la réponse fonctionnelle des cellules T CD8+ spécifiques de l’antigène afin d’évaluer leurs fonctions cytotoxiques et leur capacité à produire des cytokines pro- et anti-fibrotiques. L’identification des mécanismes de réponse immunitaire pendant l’HBC et pendant la progression de la fibrose hépatique permettront de mieux comprendre le rôle respectif de chaque sous-population immunitaire et aidera au développement de marqueurs immunitaires des lésions hépatiques.

L’infection chronique par HBV (CHB) augmente fortement le risque d’hépatocarcinome. Or, les traitements actuels du CHB ne sont pas curatifs car ils ne permettent pas d’éliminer l’ADN viral nucléaire épisomique (ADNccc) qui est responsable du rebond viral à l’arrêt des traitements. L’ADNccc sert de matrice à la transcription des ARNs viraux dont l’ARN prégenomique qui est  encapsidé et rétrotranscrit en ADN dans le cytoplasme, créant ainsi un cycle de renouvellement du pool d’ADNccc. Dans le but de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques visant à éliminer le virus, il est important d’élucider les mécanismes contrôlant la transcription du cccDNA.

L’organisation spatiale tri-dimentionnelle (3D) du génome joue un rôle important dans la régulation de l’expression des gènes. On ignore cependant encore si les virus à ADN, dont l’HBV, entrent en contact avec des régions spécifiques du génome de l’hôte et tirent parti de l’architecture 3D du génome pour recruter ou mobiliser des facteurs nécessaires à leur propre réplication/transcription.

En utilisant des approches de «Chromosome Conformation Capture » (Hi-C) et de capture de l’ADN viral (CHi-C) à partir d’hépatocytes humains primaires (PHH) infectés par HBV, nous avons montré qu’HBV contacte préférentiellement la chromatine active au niveau des ilots CpG (CGIs). Les CGIs sont enrichis en facteurs Cfp1, un facteur qui est recruté sur l’ADNccc et qui est nécessaire à sa transcription. Enfin, nous avons également observé que les gènes associés aux CGIs contactés par HBV correspondent aux gènes dont l’expression est dérégulée dans les PHH infectés. Ces données suggèrent qu’HBV contacte préférentiellement des régions spécifiques de la chromatine active car elles offrent vraisemblablement un environnement favorable à sa propre transcription. De plus nos données suggèrent qu’HBV interfère avec l’expression des gènes cellulaires à travers des contacts ADN viral/ ADN Cellulaire (Moreau et al, Nature Comm., in press).

Le but de notre projet est de déterminer quels sont les mécanismes impliqués dans l’adressage de l’ADN de l’HBV à la chromatine active et d’en comprendre les conséquences fonctionnelles notamment au niveau de la transcription de l’ADNccc et de la dérégulation de l’expression des gènes cellulaires.

Dans ce but, par des approches de capture virale CHi-C, d’imagerie et d’immunoprécipitation de la chromatine et de séquençage (ChIP-seq) nous déterminerons le rôle des facteurs cellulaires Cfp1 et CTCF et de la protéine virale HBc dans le positionnement de l’ADN d’HBV aux CGIs. Nous  déterminerons également l’importance de ce positionnement aux CGIs dans la transcription de l’ADNccc. En parallèle, par des approches de capture HI-C (CHI-C) à partir de PHH infectés par l’HBV sauvage ou déficient pour l’expression d’HBc, nous rechercherons si HBV dérégule l’expression des gènes cellulaires en perturbant l’organisation 3D des CGIs, agissant ainsi comme un dérégulateur spatial de l’expression des gènes. Nous déterminerons si la dérégulation de l’expression des gènes corrèle alors avec des modifications épigénétiques comme la méthylation de l’ADN ou la déposition de marques répressives H3K27me3. 

L’objectif général du projet est d’identifier des cibles thérapeutiques permettant d’éradiquer le réservoir viral.