Projets et candidats lauréats

Les couches supérieures de la peau et des muqueuses représentent une barrière physique et immunologique essentielle permettant notamment de contrecarrer de nombreuses menaces environnementales. Ainsi, une infection virale via les muqueuses ou la peau déclenche une réponse immunitaire innée de l’hôte se traduisant par l’établissement d’un environnement inflammatoire. De par leur localisation tissulaire, les cellules de Langerhans (LC) et cellules dendritiques mucosales font partie des premières cellules du système immunitaire en contact avec le VIH-1 lors des évènements précoces de l’infection virale et ces cellules expriment naturellement divers facteurs intrinsèques antiviraux. Néanmoins, les LC semblent contribuer à la transmission de l’infection par le VIH-1 notamment lors de contacts cellulaires avec des lymphocytes T CD4+ via des synapses virologiques (SV). Nous avons récemment mis en lumière une fonction intracellulaire insoupçonnée de l’alarmine humaine S100A9 permettant notamment de limiter la réplication du VIH-1 dans les cellules de Langerhans (LC) en inhibant l’étape de transcription inverse. La famille des alarmines qui regroupe un grand nombre de protéines telles que S100A8, S100A9, HMGB1, IL-1α ou IL-33 constitue un groupe de médiateurs pro-inflammatoires considérés comme des DAMP (motifs moléculaires associés aux dégâts) généralement sécrétés par les cellules soumises à un stress ou un agent pathogène. La dichotomie fonctionnelle de ces alarmines au niveau cellulaire (immunité intrinsèque antivirale et homéostasie cellulaire) versus extracellulaire (pro-inflammatoire et proviral) suggère d’intrigantes conséquences dans le cadre d’immuno-pathologies infectieuses. Etant donné que les LC expriment des niveaux élevés de S100A9 dont une partie peut certainement s’avérer être sécrétée dans des conditions inflammatoires infectieuses, l’antagonisme possible entre sa fonction antivirale intracellulaire et son rôle pro-inflammatoire extracellulaire mérite une meilleure caractérisation notamment dans un contexte d’infection des LC et de transmission d’infection vers des lymphocytes T CD4+. Ce projet vise donc à mieux appréhender les multiples fonctions des alarmines, telle que S100A9, lors des évènements précoces de l’infection par le VIH-1 et analyser leur impact sur la transmission cellule-cellule de l’infection VIH-1 et les conséquences immunopathologiques inflammatoires.

Les inhibiteurs de l’intégrase sont un pilier de l’arsenal des antirétroviraux utilisés en clinique. Les anti-intégrases inhibent très efficacement l’intégration du VIH-1. Cette étape d’intégration est présentée comme essentielle dans le cycle de réplication virale puisqu’elle assure la stabilité du génome viral ainsi que la production de particules virales infectieuses. Contrairement aux inhibiteurs de première génération (raltégravir et elvitégravir) pour lesquels 3 voies principales de résistance ont été bien caractérisées,

quelques mutations sont décrites pour le dolutégravir mais qui ne permettent pas de conclure de façon claire sur le moyen d’échappement utilisé par le virus pour contrecarrer l’action de cet inhibiteur. D’autre part, il n’a pas été mis en évidence jusqu’à présent de mutation de résistance dans le gène de l’intégrase chez les patients naïfs de traitement antirétroviral en échec sous dolutégravir.

De très nombreuses études, notamment cliniques, ont mises en évidence certaines mutations au niveau de l’intégrase conférant des degrés de résistance plus ou moins importants au dolutégravir (mutations R263K, G118R, N155H….). Certaines de ces mutations nécessitant d’être associées (G140/Q148) et d’autres en débat.

Récemment, nous avons mis en évidence un nouveau mécanisme de résistance aux inhibiteurs d’intégrase et notamment le dolutégravir. Ce mécanisme met en jeu certaines mutations qui ne sont pas situées au niveau de l’intégrase. Ce projet est actuellement financé par l’ANRS et se termine prochainement.

Par conséquent, le mécanisme d’échappement du virus au Dolutégravir reste donc un sujet de recherche important en vue de l’amélioration de la prise en charge des patients.

Notre équipe travaille en collaboration depuis de nombreuses années avec les cliniciens de l’Hôpital de la Pitié-Salpétrière et de l’Hôpital Bichat sur la thématique de résistance aux anti-intégrase.

Nos collègues de l’Hôpital Bichat ont identifié des mutations insertionelles au niveau du gène de l’intégrase chez des patients échappant au Dolutégravir. Ces mutations d’ insertion, identifiées chez des patients infectées par le VIH-2 (une étude récente sur ce sujet vient d’être publiée) mais aussi plus récemment par le VIH-1 (objet de ce projet), donnent lieu par exemple à une répétition d’un petit motif de 5 acides aminés au niveau de la jonction coeur catalytique/C-terminal de l’intégrase ou bien à une insertion d’un acide aminé dans la partie C-Terminale de l’intégrase.

Le projet de recherche que nous proposons vise à caractériser l’impact de ces mutations au niveau de l’activité de l’intégrase du VIH-1 mais aussi au niveau de la résistance à ces inhibiteurs.

Ce projet, basé sur des résultats originaux de description d’impacts de mutation au niveau de l’intégrase, conduira (i) à une meilleure compréhension des fonctions de l’ intégrase dans le cycle de réplication (ii) à expliquer les échappements des patients traités par les inhibiteurs de l’intégrase.

L’existence de réservoirs viraux est un obstacle à l’éradication de l’infection par VIH (virus de l’immunodéficience humaine). Les cellules T CD4 et les macrophages sont le principal réservoir cellulaire, tandis que les tissus lymphoïdes sont les réservoirs tissulaires. Le tissu adipeux représente un site remarquable pour la réplication et la persistance virale parce que sa fraction stromale contient des cellules activées du système immunitaire inné et adaptatif qui augmentent en nombre durant l’infection, l’obésité et l’inflammation chronique. Il s’avère que de nombreux pathogènes (parasites, bactéries, virus) peuvent établir des réservoirs dans le tissu adipeux. Une dysfonction de ce tissu est communément observée chez les individus infectés par le VIH. Ces derniers présentent des pathologies allant de la dyslipidémie à la lipodystrophie et la redistribution des masses graisseuses. Le tissu adipeux est par ailleurs sensible aux traitements antiviraux.

Les adipocytes et les cellules résidentes du tissu adipeux interagissent avec les lymphocytes T CD4+ et les macrophages, ce qui a d’importantes implications pour la pathogénicité du VIH. Cette interaction complexe est importante durant l’infection puisque les adipocytes sont une source majeure de métabolites et de signaux de survie pour les cellules immunitaires.

Puisque les adipocytes sont des cellules endocrines qui interagissent extensivement et régulent l’immunité, cela justifie de préciser l’effet de l’infection virale sur physiopathologie du tissu adipeux (obésité), mais aussi le rôle du tissu adipeux sur la réplication du VIH et sur sa persistance, en fonction de sa nature et de sa localisation.

Ce projet rassemblera l’expertise complémentaire de deux équipes de recherche qui ont pour thématique respective la régulation du destin cellulaire au cours de la différenciation cellulaire (l’adipogenèse et l’hématopoïèse par exemple), l’identification et l’étude du réservoir VIH dans le tissu adipeux humain, et simien et l’utilisation du modèle simien dans l’infection par le VIH.

Notre stratégie minimise l’utilisation de modèles animaux qui permettent notamment l’obtention facile et répétée de matériel biologique (sang), ou difficilement accessible chez l’homme (tissu graisseux brun). Des échantillons de tissu graisseux blanc ou brun seront prélevés sur des macaques sains pour l’isolement de progéniteurs adipeux et l’établissement des co-cultures in vitro.

Pour étudier de manière relevante la physiologie de l’interaction entre les cellules immunitaires et les adipocytes, nous développerons une co-culture paracrine 3D. Des conditions de culture obésogéniques seront aussi reproduites. Ce modèle sera composé d’adiposphères obtenues à partir de préadipocytes primaires simien ou issus de lignées humaines établies de tissu adipeux blanc ou brun, ainsi que cellules primaires issues de tissu adipeux blanc, associées à des inserts de cellules immunitaires normales. Une analyse phénotypique et transcriptomique du devenir des populations adipeuses et immunitaires sera réalisée. Elle sera complétée par un dosage de cytokines inflammatoires, adipokines et métabolites potentiellement impliqués dans l’inflammation et l’infection par VIH. Des molécules affectants le métabolisme et le transport du lactate, métabolite sécrété par les adipocytes et modulant les fonctions du tissu adipeux et des cellules immunitaires, seront analysées dans ces modèles cellulaires 3D.

La compréhension des mécanismes responsables de la latence du VIH-1 représente actuellement un enjeu majeur. Parmi ces mécanismes, la latence provirale ciblant la transcription contrôlée par le LTR5′ est considérée comme un état viral silencieux. Hors, il est maintenant démontré qu’en plus d’une transcription sens, le VIH-1 possède une transcription antisens. Différentes populations d’ARN antisens (non-épissés et épissés) ont été décrites in vitro, en particulier dans des lymphocytes T infectés de façon latente. Ceci modifie de façon profonde la vision de la latence provirale. En effet, le virus n’est pas « dormant » puisque des produits antisens sont détectés. En outre, des données de différentes équipes montrent que les transcrits antisens pourraient être directement acteurs de la latence en influençant l’activité du LTR5′ ou sa réactivation. Nous faisons l’hypothèse que les transcrits antisens pourraient jouer un rôle important dans la latence in vivo, en particulier chez les sujets infectés contrôlant la réplication virale.

Notablement, l’expression des transcrits antisens a été montrée chez des patients sous thérapie antivirale, mais pour le moment uniquement chez 5 sujets. Il parait donc nécessaire de lancer une étude à large échelle pour confirmer  l’expression des transcrits antisens in vivo, en lien avec les différentes situations cliniques. Dans ce cadre, notre objectif global est de mettre en place les outils et méthodes nécessaires à l’étude de la transcription antisens du VIH-1 dans des lymphocytes T de patients. Nous nous appuierons sur nos travaux portant sur le HTLV-1, qui nous ont déjà conduits à développer un protocole de RTqPCR spécifique des ARN antisens. Nous allons travailler sur deux objectifs spécifiques:

1) Mise au point d’un protocole de RTqPCR applicable aux échantillons cliniques

Pour les différentes mises au point, nous allons travailler sur des ARN extraits de lymphocytes T CD4+ Jurkat non infectés ou infectés avec la souche pNL4.3.

Pour les transcrits épissés, nous utiliserons des amorces spécifiques de la jonction d’épissage, assurant une détection spécifique. Pour les transcrits non épissés, nous utiliserons le protocole « RT tag » mis en place pour le HTLV-1, basé sur une amorce de transcription inverse composée d’une séquence neutre (tag) fusionnée à une séquence complémentaire du brin antisens. La PCR est ensuite réalisée en utilisant la séquence tag et une séquence virale comme amorces.

L’application aux patients nécessite de prendre en compte la diversité virale. En nous basant sur les séquences du groupe M disponibles (HIV Sequence Compendium), nous rechercherons dans chaque région d’amplification la zone la plus conservée et introduirons des bases dégénérées pour permette la détection d’un maximum de variants. Nous testerons ensuite les meilleures conditions en termes de concentration de primers, température et durée d’amplification et de méthode de PCR et de normalisation (gènes de ménage, transcrits sens, charge provirale).

2) Caractérisation de l’expression des transcrits antisens dans des lymphocytes T CD4+ 

Nous quantifierons le niveau d’expression des lymphocytes T dans des Jurkat J1.1 (provirus complet) avant (latence) ou après (productive) réactivation par le TNF.

Nous étudierons également l’expression des différents transcrits dans des cellules Jurkat infectées par la souche pNL4.3 après blocage ou induction de la transcription sens. Nous répéterons ces expériences dans des lymphocytes T CD4+ primaires infectés in vitro soit par la souche pNL4.3 soit par un isolat primaire (91US054 clade B). Nous nous intéresserons aussi à l’étape de réactivation de provirus latents en nous basant sur l’article de Martins et al (PMID:30918072) ayant analysé la réactivation virale dans des lymphocytes T CD4+ primaires mémoires générés et infectés in vitro.

Ce premier travail nous fournira les conditions pour comparer l’expression des transcrits antisens dans différentes cohortes de patients infectés par le VIH-1. Ceci se fera en collaboration avec le groupe de Véronique Avettand-Fènoël, spécialiste du suivi des patients, qui a rejoint notre équipe en 2019.

Ces dernières années d’immenses progrès ont été réalisés dans notre compréhension de l’assemblage intracellulaire et du bourgeonnement du VIH-1 grâce aux avancées de la microscopie. Cependant, l’étape cruciale de libération des virions reste peu étudiée car elle ne peut être caractérisée par la seule microscopie. En conséquence, les données disponibles dans la littérature sur la libération des virions restent très approximatives car réalisées avec des populations de cellules dont les cinétiques de réplication du VIH-1 sont très hétérogènes. Notre objectif est d’apporter à la virologie conventionnelle la puissance des stratégies de nano/micro-fluidique (« viro-fluidique ») pour étudier la dynamique du relargage du VIH-1 à l’échelle de la cellule unique. Ce projet technologiquement ambitieux est porté par un consortium interdisciplinaire, composé de 4 équipes aux compétences reconnues et complémentaires en microfluidique, nanotechnologies, rétrovirologie et microscopie de molécules uniques.

Nous développerons un système microfluidique original qui permettra de mesurer en temps réel la libération des virus par des cellules individuelles. Cette puce microfluidique va devoir opérer plusieurs fonctions:

– Piégeage : Le circuit microfluidique thermostaté à 37°c va comporter une cale pour piéger une cellule unique dans un flux continu de milieu de culture, sans l’endommager. Le piège cellulaire doit immobiliser la cellule dans un écoulement mais permettre le relargage des virions. Plusieurs géométries ont d’ores et déjà été validées pour différents types cellulaires.

– Unicité : le circuit doit garantir par son design qu’une seule cellule soit piégée et perfusée, alors que l’ensemencement est opéré à partir d’une solution diluée de cellules. Un système à plusieurs entrées/sorties contrôlé par des valves pneumatiques sera utilisé pour garantir que le milieu collecté ne provienne que de la perfusion d’une cellule unique.

– Détection : En aval du piège, le circuit recevra des systèmes de quantification des virions fluorescents utilisant soit un comptage optique par caméra rapide soit par spectroscopie de corrélation de fluorescence (détection ponctuelle dans un faisceau laser). Pour les virions non-fluorescents nous utiliserons une technique de comptage par nanopore unique de type « track etched » intégré dans le système microfluidique.

            La puce sera installée sur le statif d’un microscope inversé à fluorescence pendant toute la durée de l’expérience. Cette dernière sera stoppée à la mort cellulaire observée par coloration au DAPI présent dans le milieu de perfusion. Nous étudierons les cellules modèles HeLa exprimant un VIH-1-GFP non-infectieux (∆env) et déterminerons pour la première fois la fréquence, la cinétique, la durée de la libération des virions et la quantité de virions produits par cellule. Cette étude permettra d’appréhender l’hétérogénéité de production entre cellules issues d’une même population. Puis, nous étendrons cette étude à plusieurs types cellulaires afin de faire état du degré de variation d’un type cellulaire à l’autre. Cette étude de la vitesse de libération des virus en fonction du temps de viabilité cellulaire nous permettra de mieux comprendre les stratégies adaptatives de production du VIH-1 à son hôte. Par ailleurs, nous ferons varier plusieurs paramètres physiques comme la vitesse du flux microfluidique, la tension membranaire, ou encore biochimiques en induisant l’activation des cellules (TNFalpha, LPS) afin d’appréhender la mécanistique de la libération des virions. A ce jour, toutes ces données ne sont pas connues car inaccessibles par l’utilisation d’approches conventionnelles.

            Les applications de la viro-fluidique sont nombreuses. Elle pourra être utilisée pour étudier ou découvrir des facteurs cellulaires ou viraux impliqués dans la libération des virus. Elle pourra également faciliter l’étude des mécanismes de réactivation de la production virale dans les cas de latence. De manière plus générale, les outils de viro-fluidique développés ici, aussi bien pour la capture cellulaire que pour la quantification des virus en flux, seront transposables à d’autres pathogènes.

Les cellules myéloïdes, en particulier les cellules dendritiques (cDCs), jouent un rôle clé dans la mise en place des réponses immunitaires contre les virus. Il a été montré que l’infection par le SIV et le VIH-1 induisent des dysfonctions des cDCs, lors de la phase aigüe de l’infection aboutissant à une réponse immunitaire adaptative inefficace. Des études ex-vivo à partir d’échantillons de patients montrent que la modulation de l’interaction entre le récepteur inhibiteur LILRB2 et le CMH-I joue un rôle majeur dans les dysfonctions des cDCs induites par le VIH-1 et corrèle avec la vitesse de progression de la maladie. Les dysfonctions des cDCs induites par l’interaction de LILRB2 avec le CMH-I sont caractérisées par une atténuation de leur capacité de maturation (expression réduite des molécules de co-stimulations) et une inhibition de leur capacité de présentations antigéniques aux lymphocytes T. Il a été proposé que ces mécanismes de dérégulation des cDCs induits par une interaction exacerbée de LILRB2 avec le CMH-I se mettaient en place très tôt lors de l’infection par le VIH-1. A cet égard, des travaux de notre équipe montrent une expression exacerbée de LILRB2 et de ses ligands du CMH-I sur les cDCs du sang et des ganglions périphériques lors des phases précoces de l’infection de macaques cynomolgus par le SIV. En outre, nos données ex-vivo montrent que l’axe LILRB2 / CMH-I est également augmenté sur les cDCs de patients en primo-infection du VIH-1. Sur la base de ces études nous proposons que l’interaction exacerbée entre LILRB2 et le CMH-I induite par le SIV/VIH au cours de la primo-infection engendrerait une dérégulation précoce des réponses immunitaires conduisant à la persistance du virus et à la mise en place des mécanismes physiopathologiques de la maladie. Afin de valider cette hypothèse, nous avons généré des anticorps monoclonaux dirigés contre le récepteur LILRB2. Grace à plusieurs tests de criblages nous avons pu identifier un anticorps monoclonal capable de bloquer l’interaction de LILRB2 avec le CMH-I chez le macaque cynomolgus et l’homme. Des expériences in vitro indiquent également que cet anticorps favorise l’activation des cellules dendritiques dans ces deux espèces.

L’objectif principal de ce projet vise à modifier (humanisation/primatisation) puis à utiliser cet anticorps afin de déterminer l’impact de l’axe LILRB2/CMH-I, in vivo, sur la charge virale et les réponses immunitaires lors de l’infection par le SIV de macaques cynomolgus.

Nous espérons que le traitement avec l’anticorps anti-LILRB2 favorise le développement des réponses immunitaires dirigées contre le SIV plus efficaces et aboutisse ainsi à une amélioration du contrôle de la charge virale, dans l’espoir t’atteindre une rémission.

Les objectifs secondaires du programme, qui seront atteint sur financement complémentaire en dehors de la présente demande, visent à comparer les fonctions de LILRB2 sur des neutrophiles et/ou des monocytes de patients à différents stades de l’infection par le VIH-1 : (primo-infection ; infectés sous traitement cART ; HIV contrôleurs) et moduler leur fonction en présence de l’anticorps.

Au final, les résultats de ce programme pourraient valider l’axe LILRB2 / CMH-I comme nouvelle cible pour le développement de stratégies d’immuno-intervention chez l’homme visant à améliorer les réponses immunitaires contre le VIH-1, sur la base d’une connaissance approfondie des mécanismes de dysfonction observés chez l’homme d’une part et sur des observations précliniques d’autre part. Ces données apporteront également une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires qui induisent la dérégulation des réponses immunitaires lors de l’infection par le VIH-1/SIV.