Projets et candidats lauréats

Contexte et résultats acquis : Des études récentes ont montrées que les plaquettes humaines assurent des fonctions immunitaires en plus de leur rôle dans l’hémostase. En particulier, les plaquettes interagissent avec des pathogènes dont le VIH, bien que pour des raisons mal connues. Avec nos collaborateurs a ce projet nous avons déjà montré récemment que les plaquettes du sang de patients séropositifs contenaient des particules virales infectieuse malgré le traitement anti-retroviral (cART) suppressif. Nous avons aussi montré que les plaquettes contenant du VIH peuvent transférer l’infection aux macrophages in vitro, par un mécanisme qui pourrait alimenter le réservoir VIH qui existe au niveau des macrophages et que nous avons caractérisé chez les patients infectés sous cART suppressif. De plus, l’analyse des données cliniques a montré que les patients ayant du virus dans les plaquettes sont ceux qui ne répondent pas immunologiquement au traitement, correspondant donc à des non répondeurs immunologiques ou « Immunological non Responders » (InRs). La présence de VIH dans les plaquettes apparaît donc comme un marqueur prédictif d’InRs.

Les patients InRs représentent 20% des patients VIH+ sous cART. Chez ces patients InRs, la balance Treg/Th17 est dérégulée et nous avons montré que les Th17 forment des conjugués avec les plaquettes en fréquence plus importante que chez les répondeurs immunologiques (IRs). Les raison de l’échec immunologique du traitement chez les InRs reste incomprises et aucune stratégie thérapeutique permettant de fortifier leur réponse immunitaire ne leur est proposée.

Objectif : Nous proposons maintenant de déchiffrer les mécanismes par lesquels les plaquettes contentant du VIH interfèrent avec la réponse immunitaire des patients infectés et traités. Notre hypothèse est l’échec immunologique chez ces patients résulte d’une interaction directe des plaquettes contenant le VIH avec les macrophages tissulaires et les lymphocytes TCD4+ sanguin, bien que cette interaction ne soit pas la même dans les deux cas. Ainsi, cette interaction maintiendrait une infection persistante au niveau des macrophages et une polarisation des lymphocytes TCD4+ sanguine vers un phénotype Th17. Ceci induirait un état inflammatoire et pourrait rendre compte de l’échec immunologique chez les patients infecté mais sous traitement anti-rétroviral suppressif.

Stratégie : Pour valider cette hypothèse, nous évaluerons si :

i) L’interaction des plaquettes contenant du VIH avec les macrophages permet, par transfert du virus, l’infection des macrophages accompagnée d’une réplication à bas bruit du virus et à un profile inflammatoire

ii) L’interaction des plaquettes de patients InRs (qui ont du virus dans leurs palquettes) avec les lymphocytes TCD4+ induisent une polarisation des TCD4+ vers un phénotype Th17 impliqué dans les processus d’inflammation chronique.

iii) L’interaction plaquette-leucocytes s’accompagne d’un transfert de mRNA/microRNA des plaquettes aux leucocytes et si ce mécanisme contribue de manière déterminante à l’immunomodulation des cellules immunes cibles.

iv) L’infection de macrophages résulterait de l’interaction avec les plaquettes contenant du VIH de patients InRs et l’immunomodulation des lymphocytes TCD4+ peut être bloquée par des agents antiplaquettaires utilisés en clinique in vitro mais aussi in vivo chez les patients.

Perspectives : Ce projet s’inscrit dans la continuation direct des études que nous avons réalisées sur le rôle des plaquettes comme vecteur éphémère de virus infectieux et de leur pertinence dans l’infection par le VIH. L’étude proposée ici, réalisable en un an, devrait permettre d’établir une relation de causalité entre la présence de VIH dans les plaquettes et la mauvaise réponse immunologique des patients InRs, ainsi que de caractériser un agent thérapeutique permettant de contrer ce défaut immunitaire, jetant des bases solides pour établir une stratégie thérapeutique pour ces patients InRs qui n’ont pas d’issue thérapeutique actuellement.

L’intégration et la transcription constituent deux étapes essentielles de la réplication du VIH-1. Ces deux étapes participent à l’orientation de l’infection virale vers une réplication active productive de virions, ou vers une phase de latence, associée à l’intégration de copies virales silencieuses dans le génome cellulaire. Certaines d’entre elles peuvent être réactivées lors de l’interruption des traitements antiviraux et conduire à une nouvelle phase de réplication virale chez les patients. La détermination des paramètres et mécanismes de la latence du VIH constitue donc un enjeu majeur dans l’élaboration de nouvelles stratégies antivirales.

            Ce projet cible deux paramètres cellulaires encore peu étudiés régulant ces deux étapes de la réplication virale : l’organisation tridimensionnelle de la chromatine et les ADN Topoisomérases TOP1 et TOP2.

            Le premier paramètre sera étudié par des approches dérivées du « Chromosome Conformation Capture » (3C), qui permettent de cartographier les contacts entre fragments d’ADN dans un noyau. Dans notre étude, nous utiliserons les approches de « Circular Chromosome Conformation Capture » (4C) et de Multi-Contact 4C (MC-4C), pour caractériser les contacts entre les génomes viraux et cellulaires, au cours de différentes phases de la latence virale. Les approches seront tout d’abord mises au point dans des cellules J-Lat qui constituent un modèle cellulaire simple mimant la latence virale. Elles seront ensuite appliquées à des cellules primaires TCD4+ infectées par un vecteur VIH permettant d’obtenir des populations cellulaires reproduisant différents états d’infection, productive ou latente. Les cellules infectées de manière latente peuvent également être triées pour leur capacité ou incapacité à être réactivées. Dans ces différentes populations cellulaires, les fragments du génome cellulaire contactés par le génome viral seront étudiés pour la présence de marqueurs génétiques ou épigénétiques et pour l’activité transcriptionnelle de gènes présents sur ces fragments. Cette étude permettra de déterminer s’il existe une signature commune de l’environnement tridimensionnel du génome viral, dans les états réprimés et activés de son expression. Cet environnement pourrait alors constituer un nouveau marqueur d’acquisition ou de sortie de la latence virale.

            Les ADN Topoisomérases TOP1 et TOP2 régulent l’intégration et la transcription du VIH ainsi que l’organisation tridimensionnelle de la chromatine. Notre objectif est de déterminer si ces régulations sont couplées entre elles et contribuent à un nouveau mode de régulation de la latence virale. Par silencing de l’expression de ces enzymes, nous déterminerons leur contribution dans les différentes phases de la latence virale obtenues après infection de cellules primaires T CD4+. Les approches de HiC, 4C et MC-4C nous permettront ensuite de déterminer les conséquences de ce silencing sur l’organisation tridimensionnelle de la chromatine dans ces cellules et sur les contacts entre les génomes viraux et cellulaire. Une analyse de la présence des enzymes TOP1 et TOP2b ainsi que de marqueurs génétiques, épigénétiques et transcriptomiques sur les fragments contactés par le génome viral nous permettra de déterminer si la régulation de l’expression virale par ces enzymes est restreinte au provirus intégré ou si elle s’étend à son environnement tridimensionnel chromatinien.

            Les ADN Topoisomérases et la structure de la chromatine sont impliquées dans de nombreux processus nucléaires. Notre étude a pour but de caractériser leurs rôles communs ou séparés dans la réplication virale, et plus spécifiquement au cours des étapes de latence. Nous espérons que cette étude mettra en évidence des mécanismes nouveaux pouvant servir de cibles dans des stratégies antivirales.

Les infections sexuellement transmissibles (IST) se produisent majoritairement au niveau des muqueuses du tractus reproducteur féminin (TRF), et sont principalement véhiculées par le sperme. De nombreux facteurs de l’environnement du TRF détermine la susceptibilité aux IST, de manière directe ou indirecte, par exemple en modulant l’inflammation. Ainsi, le liquide séminal (LS), la fraction acellulaire du sperme, déclenche une réponse inflammatoire dans le TRF qui faciliterait la transmission du VIH-1, en induisant l’expression de cytokines pro-inflammatoires et le recrutement de neutrophiles, puis de cellules cibles du VIH-1. De même, l’infection par Chlamydia trachomatis (CT), l’IST prédominante chez les jeunes femmes, est responsable d’une inflammation qui entraine une susceptibilité accrue à l’infection VIH-1. Cependant, le rôle de l’inflammation au niveau du TRF reste à préciser dans le cadre de co-infections. En particulier, les phénotypes et les fonctions des neutrophiles au niveau des muqueuses sont jusqu’à présent très peu étudiés, notamment dans l’infection VIH-1 et encore moins au cours des co-infections CT/VIH-1 dans un contexte physiologique d’exposition du TRF à du liquide séminal. Etant donné la mise en évidence récente de nouvelles fonctions des neutrophiles, il est important de comprendre leur rôle dans ce cadre.

L’objectif de ce projet est d’étudier l’impact du LS et de CT sur l’inflammation au niveau des muqueuses du TRF, en analysant les populations de neutrophiles et les profils de cytokines au niveau du TRF, et les conséquences de ces modifications sur la susceptibilité à la co-infection par le VIH-1 et les réponses immunitaires associées. Nous postulons que, dans un contexte physiologique en présence de LS, CT joue un rôle dans la co-infection VIH-1 en modifiant le phénotype et les fonctions des neutrophiles ainsi que l’état inflammatoire de la muqueuse cervico-vaginale.

Deux approches complémentaires seront développées : un modèle in vitro (Année 1) et un modèle in vivo (Années 2 et 3). Ces modèles sont déjà en place dans l’équipe. In vitro, des cellules épithéliales endocervicales seront infectées ou non par CT et exposées ou non à du LS. Les surnageants (SN) des différentes conditions seront récupérés et caractérisés (profil cytokinique et peptides anti-microbiens) puis testés pour leur impact sur l’infection VIH-1. Des PBMC ou des cellules isolées du TRF seront préincubées avec ces SN puis exposées au VIH-1. L’infection VIH-1 sera suivie au cours du temps et comparée dans les différentes conditions. En parallèle, nous étudierons l’impact des SN sur le phénotype et les fonctions (survie, phagocytose, production de ROS et de cytokines) de neutrophiles humains isolés du sang périphérique. Pour les expériences in vivo, des femelles macaques cynomolgus recevront 1 puis 4 doses de LS en intravaginal, puis, toujours en présence de LS, elles seront exposées (n=6, groupe 2) ou non (n=6, groupe 1) à une forte dose de CT. Ensuite, toutes les femelles seront exposées à une forte dose de SIV. A chaque étape, nous analyserons différents marqueurs de l’inflammation au cours du temps : populations de neutrophiles et profils de cytokines. Nous suivrons les infections CT et SIV ainsi que les réponses immunitaires innées et spécifiques anti-CT et anti-SIV en systémique et dans les différents compartiments muqueux du TRF dans les 2 groupes. Les résultats seront comparés entre les différentes conditions expérimentales.

L’ensemble de ces expériences permettra de déterminer les modifications de différents acteurs de l’inflammation au cours de la co-infection CT/VIH-1 dans un contexte prenant en compte la composante LS. Nous pourrons déterminer s’il y a des corrélations entre les profils de cytokines, le phénotype et la fonction des neutrophiles, l’établissement des co-infections CT/VIH-1 et les réponses immunitaires spécifiques associées.

L’ensemble de ces résultats ouvrira des pistes pour le développement de thérapies préventives contre l’acquisition des IST, notamment sur les stratégies pour y parvenir et sur les acteurs principaux à cibler : molécules anti-inflammatoires, thérapie visant les neutrophiles…

Mycobacterium tuberculosis (Mtb) est la mycobactérie responsable de la tuberculose humaine qui demeure une des causes principales de mortalité avec 1,5 million de décès en 2020. Un quart de la population mondiale est infecté par Mtb et possède 5 à 10% de chance de développer une forme active de la maladie. De plus, l’émergence de souches de Mtb (multi)résistantes aux antibiotiques représente un problème majeur de santé publique. Dans ce contexte, il devient urgent d’améliorer notre compréhension des mécanismes nécessaires à la virulence de Mtb afin d’identifier les mécanismes pouvant être la cible de nouveaux agents antituberculeux.

Dans le cadre de ce projet, nous voulons décrypter le réseau d’interactions protéine-protéine (IPP) au sein d’un mécanisme essentiel à la pathogenèse mycobactérienne : le catabolisme du cholestérol. En effet, le cholestérol de l’hôte infecté représente une source de carbone et d’énergie essentielle à la croissance de Mtb et au développement de l’infection tuberculeuse. De plus, plusieurs études récentes ont permis de montrer que le métabolisme du cholestérol constitue une cible pharmacologique de choix pour le développement de nouveaux agents antituberculeux. Pour mener à bien ce projet, nous utiliserons une approche de biotinylation dépendante de la proximité (BioID). Cette approche permet de caractériser la formation de complexes protéiques directement dans l’organisme d’intérêt, ce qui permet de conserver l’organisation des structures subcellulaires, la présence des cofacteurs enzymatiques ou encore les modifications post-traductionnelles. Nous avons récemment mis en évidence que cette approche pouvait être utilisée chez Mycobacterium smegmatis, une souche de mycobactérie à croissance rapide et non pathogène, qui constitue un modèle de choix pour l’étude de la physiologie mycobactérienne. Nos résultats préliminaires ont mis en évidence l’interaction entre HsaC et HsaD, deux enzymes qui se succèdent dans le catabolisme du cholestérol, ce qui renforce la validité de notre approche en BioID. De plus, nous avons aussi réussi à montrer une interaction du catabolisme du cholestérol avec une autre voie métabolique : la dégradation des acides aminés branchés. C’est la première fois qu’une interconnexion est démontrée entre ces deux voies métaboliques. Enfin, nous avons pu isoler des IPP entre les protéines HsaC/HsaD et des protéines mycobactériennes de fonction inconnue.

Ce projet a pour but de poursuivre la caractérisation du catabolisme du cholestérol chez les mycobactéries. Par une approche reverse en BioID, nous déterminerons l’interactome des protéines impliquées dans la dégradation des acides aminés branchés afin de confirmer l’interconnexion de cette voie métabolique avec le catabolisme du cholestérol. Nous étendrons notre étude à d’autres enzymes (CYP125, CYP142 et FadD) impliquées dans le catabolisme du cholestérol. En parallèle, nous testerons en BioID une protéine de fonction inconnue qui a montré une interaction à la fois avec HsaC et HsaD. Un axe de développement de ce projet consistera à évaluer l’approche en BioID directement chez les mycobactéries pathogènes à croissance lente, telles que Mtb. Pour cela, nous établirons l’interactome des protéines HsaC/HsaD chez Mtb que nous comparerons à celui déjà établi chez M. smegmatis. Si nous parvenons à valider l’approche en BioID chez Mtb, cela représenterait un outil précieux pour la caractérisation des IPP afin d’améliorer notre compréhension des mécanismes de virulence développés par les mycobactéries pathogènes.

Les retombées attendues dans la cadre de ce projet sont multiples. La validation de l’approche en BioID constituera un outil innovant pour identifier de nouvelles cibles thérapeutiques, pour démontrer l’existence de complexes multi-protéiques interconnectés et pour faciliter l’annotation des protéines de fonction inconnue. Ce projet permettra aussi de faire émerger une nouvelle expertise au laboratoire dans la caractérisation fine des IPP, facilitant de futures collaborations et constituant ainsi une base solide pour répondre à de futurs appels d’offres.

Objectif : Estimer la prévalence et l’incidence des lésions dysplasiques anales (bas grade et haut grade) selon le statut VIH chez les hommes ayant des rapports sexuels avec d’autres hommes (HSH) à Lomé, Togo.

Objectifs secondaires principaux : Selon le statut VIH (i) Décrire les évènements d’aggravation des lésions cytologiques anales ; (ii) Estimer la prévalence d’infections à Human Papillomavirus (HPV) à l’enrôlement au niveau de la région anale et de la sphère orale (iii) Estimer la proportion d’infections à HPV persistantes à 1 an et à 2 ans chez le même individu au niveau du canal anal et de la sphère orale ; (iv) Estimer la prévalence et l’incidence des infections sexuellement transmissibles (IST) associées (N gonorrhoeae, C trachomatis, M genitalium, T vaginalis et HSV-2) ; (v) Décrire les profils de résistance aux antibiotiques des IST bactériennes.

Situation du sujet : L’infection par HPV est l’IST la plus fréquente dans le monde. Certains HPV à haut risque oncogène (HPVhr) sont responsables de cancers (col de l’utérus, canal anal et ORL). Entre 85 et 90% des cancers du canal anal sont attribuables à des HPVhr et l’Afrique sub-saharienne est une des zones de plus forte prévalence. L’infection par le VIH est un facteur de risque d’acquisition de l’HPV. De plus, chez les personnes vivant avec le VIH, les infections HPVhr multiples sont plus fréquentes et persistent plus longtemps, augmentant le risque d’évolution vers le cancer. Par rapport à la population générale, l’incidence du cancer anal est environ 17 et 70 fois plus élevée chez les HSH VIH- et les HSH VIH+, respectivement.

Problématique : Ainsi les HSH constituent une population à risque élevé d’infections et de lésions précancéreuses à HPV, en particulier en Afrique où les prévalences d’infections VIH, et HPV sont élevées. Cependant, très peu de données sont disponibles sur la prévalence des lésions dysplasiques anales dans cette population et aucune politique de dépistage systématique des lésions anales n’est actuellement proposée en Afrique.

Méthodes : Nous proposons de mettre en place une cohorte de HSH VIH+ (n=100) et VIH- (n=100) avec un suivi de 2 ans. Les participants seront recrutés dans plusieurs associations d’HSH à Lomé, Togo. Un examen médical (examen proctologique et des organes génitaux externes) sera réalisé à l’inclusion (M0) puis à 12 (M12) et 24 mois (M24), associé à un questionnaire standardisé (caractéristiques sociodémographiques et facteurs de risque de l’infection HPV). Des prélèvements seront réalisés :

– Sang veineux : dépistage de l’infection à VIH, des hépatites B et C, et de la syphilis ;

– Frottis du canal anal : (i) analyses cytologiques ; (ii) détection/typage des HPV et de HSV-2 ; (iii) détection des IST : N gonorrhoeae, C trachomatis, M genitalium, T vaginalis par biologie moléculaire ;

– Prélèvement de la sphère orale : détection/typage des HPV ;

– Prélèvements d’urines, de gorge et urétral : recherche des IST bactériennes (N gonorrhoeae, C trachomatis, M genitalium) afin d’isoler les souches bactériennes pour pouvoir les typer et déterminer leur profil de résistance aux antibiotiques.

Echéancier :

– Janvier-Juin 2019 : Mise en place de la cohorte et 1ères inclusions

– Juillet 2019-Septembre 2021 : Visites M0, M12 et M24 et analyses biologiques des visites M0 et M12

– Septembre-2021 : Analyses biologiques de la visite M24

– Janvier-Avril 2022 : Analyses des résultats et rédaction des publications

Résultats attendus :

– Disposer de 1ères données sur la prévalence et l’incidence des lésions anales précancéreuses dans des populations à risque telles que les HSH en Afrique pour soutenir la proposition de mise en place de stratégies vaccinales ;

– Documenter les types d’HPV rencontrés et leur persistance ;

– Décrire les données sur la prévalence de différentes IST et sur la résistance aux antibiotiques ;

– Sur un plan opérationnel, de disposer d’une 1ère expérience de dépistage des lésions anales chez les HSH en Afrique de l’Ouest, pour une prise en charge optimale de ces lésions anales et de permettra de proposer des stratégies de dépistage des lésions anales chez les HSH dans le contexte africain.