Projets et candidats lauréats

La mutation responsable de la dystrophie musculaire rare LGMD1F (limb girdle muscular dystrophy 1F) est une délétion d’un seul nucléotide dans le codon stop de la transportine 3 (TNPO3). Cette mutation conduit à une extension de la protéine en C-ter sur 15 acides aminés, produisant une protéine de fonction inconnue (TNPO3_mut) qui est co-exprimée avec la protéine TNPO3 sauvage (TNPO3_wt). TNPO3 a été impliquée dans le transport nucléaire de protéines riches en sérine / arginine, telles que les facteurs d’épissage alternatif, ainsi que dans l’infection par le VIH-1 en agissant sur la capside virale. Nos données préliminaires montrent que cette mutation génétique rare confère une protection contre le VIH-1 in vitro, faisant de cette mutation la deuxième anomalie génétique décrite jusqu’à présent qui confère une forte résistance à l’infection par le VIH-1. L’objectif du projet est d’approfondir notre compréhension de l’impact de TNPO3 sur le VIH-1 en se basant sur les patients LGMD1F. Premièrement, nous visons à comprendre le fonctionnement de cette forme mutante de TNPO3 et à évaluer son impact sur les fonctions cellulaires: examiner si TNPO3_mut a un effet dominant négatif sur TNPO3, la distribution cellulaire de TNPO3 et des facteurs d’épissage, la structure du cytosquelette et les modifications post-traductionnelles des microtubules dans les cellules de patient et en lignées cellulaires modèles de la maladie. Deuxièmement, en utilisant la mutation LGMD1F comme modèle, nous étudierons les mécanismes d’interférence sur l’infection par le VIH: identifier l’étape du cycle viral bloquée par TNPO3, examiner l’effet de la mutation sur le transport de la capside et l’induction de l’IFN, caractériser la localisation des provirus intégrés dans la topographie nucléaire et le paysage d’intégration dans les cellules TNPO3_mut. Si les objectifs du projet sont atteints, nous pourrons mieux comprendre les mécanismes impliqués dans l’inhibition de l’infection VIH par la TNPO3 défectueuse chez les patients LGMD1F. D’un point de vue technique et translationnel, notre projet développera des techniques innovantes (BRET, CRISPR / Cas9 FISH de provirus intégrés) qui pourraient ouvrir de nouvelles possibilités de recherche.

Détection et caractérisation moléculaire des papillomavirus humains du genre alpha (α-HPV) dans les cancers cutanés chez les personnes vivant avec le VIH

Contexte et état de la question

Les papillomavirus humains (HPV) sont classés selon cinq genres (α, β, γ, μ et ν). Les HPV oncogènes du genre α (α-HPV) sont responsable d’un grand nombre de carcinomes épidermoïdes muqueux des régions ano-génitales et ORL. Dans la classification internationale les α-HPV oncogènes ont un tropisme muqueux, pourtant plusieurs études ont mis en évidence la présence d'α-HPV dans des carcinomes épidermoïdes cutanés (CEC) extra-génitaux, avec des prévalences variables. Cependant la simple détection d’α-HPV ne signe pas l’implication directe du virus et il y a là une absence de données sur le potentiel rôle des α-HPV dans la carcinogénèse cutanée.

Chez les personnes vivant avec le VIH (PVVIH), les CEC sont plus fréquents et plus agressifs. Ils ont par ailleurs une présentation clinique qui diffère de celle observée en population générale avec notamment une survenue fréquente sur peau foncée et/ou au niveau de zones non photo-exposées. Il semble donc que d'autres facteurs que l'exposition aux ultraviolets soient impliqués chez ces patients. Etant donné la présence d’α-HPV dans ces tumeurs et la persistance plus longue des infections à HPV chez les PVVIH, même chez les patients bien contrôlés sur le plan immuno-virologique, la question de l’implication des α-HPV dans la carcinogenèse cutanée se pose clairement dans cette population.

Objectif principal :

Décrire l’implication des α-HPV dans les carcinomes épidermoïdes cutanés des PVVIH.

Objectifs secondaires :

• Estimer la prévalence des infections aux différents genres de papillomavirus humains (α-HPV, β-HPV et γ-HPV) dans les CEC des PVVIH ;
• Décrire les caractéristiques cliniques et histologiques des tumeurs α-HPV positives ;
• Comparer les profils cliniques et histologiques des tumeurs α-HPV positives à ceux des tumeurs α-HPV négatives

Population concernée :

• Patients adultes de plus de 18 ans ;
• Patients infectés par le VIH ;
• Patients ayant eu une biopsie ou exérèse de CEC extra-génital invasif ou in situ (maladie de Bowen) ;
• Matériel tumoral fixé en paraffine (FFPE) disponible pour analyses virologiques et anatomopathologiques.

Effectif prévisionnel :

50 patients avec matériel tumoral suffisant.

Méthodes :

• Analyse rétrospective sur prélèvements en paraffine (FFPE) de CEC issus de PVVIH suivis à l'hôpital Bichat-Claude Bernard traités pour un CEC entre janvier 2018 et janvier 2025.
• Les prélèvements FFPE archivés dans le service d’anatomo-cytopathologie seront analysés dans le service de virologie pour détection des α-HPV avec la trousse commerciale Allplex™ HPV28 (Seegene) et pour détection des HPV des genres β et γ par séquençage NGS. La détection de transcrits viraux des α-HPV sera réalisée dans le service d’anatomo-cytopathologie par technologie RNAscope®. Les analyses immuno-histochimiques seront réalisées sur l'ensemble des prélèvements avec mesure de l'expression des protéines cellulaires p16, p53 et Ki-67.
• Les analyses statistiques seront réalisées avec le logiciel R.

Echéancier :

• Désarchivage des blocs FFPE d’intérêt, préparation des copeaux et des lames : 2 mois.
• Analyse des prélèvements dans les laboratoires de virologie et d’anatomo-cytopathologie de l’hôpital Bichat-Claude Bernard : 4 mois.
• Analyse globale des résultats et rédaction du rapport d'étude : 6 mois.
• Durée totale de 12 mois.

Résultats attendus :

Ce travail apportera de premières données concernant le potentiel rôle oncogénique des α-HPV dans les CEC des PVVIH. Ces résultats pourraient permettre d’adapter les stratégies thérapeutiques selon la présence d'α-HPV comme par exemple un recours plus fréquent à la radiothérapie et à l'utilisation de vaccins thérapeutiques dirigés contre HPV actuellement en cours de développement pour les indications muqueuses. Par ailleurs, l’implication de ces HPV dans les CEC pourrait renforcer l’indication vaccinale prophylactique dans cette population adulte à risque élevé de cancer HPV.

Le virus de l’hépatite B (Hepatitis B Virus, HBV) est l’un des plus sérieux pathogènes humains : >250 millions d’individus souffrent d’hépatite B chronique et >800.000 en meurent chaque année. HBV est un virus enveloppé avec une nucléocapside icosaédrique renfermant un ADN partiellement double brin (RC-DNA). Le constituant élémentaire de la capside est un dimère d’une protéine (Core) de 183 résidus (ou 185 selon les génotypes) : les 149 résidus N terminaux (Cp149) comprennent le domaine d’assemblage qui peut s’auto-assembler in vivo et in vitro en capsides icosaédriques avec principalement une triangulation T = 4 (120 dimères). Les 34 (ou 36) acides aminés restants, riches en arginine, constituent le domaine C terminal (C Terminal Domain, CTD) qui est essentiel pour l’encapsidation de l’ARN viral prégénomique (pgRNA) par Core. In vivo, CTD existe sous plusieurs états de phosphorylations pouvant aller jusqu’à 7 par molécule (Cp183-7P) mais 3 sites sont essentiels lors de l’encapsidation, une situation que mime une Core recombinante où les 3 sérines concernées sont mutées en glutamates (Cp183-EEE). Enfin, des molécules interférant avec des contacts entre dimères de Core (CpAM pour capsid assembly modulators) perturbent l’assemblage en capsides et sont des inhibiteurs puissants de la réplication de HBV in vitro, et des candidats au développement de nouveaux médicaments anti-HBV. Les CpAM semblent agir soit en promouvant l’assemblage, conduisant à la formation de capsides vides (CpAM de classe I), soit en le déviant du chemin d’assemblage, conduisant à des capsides mal formées (CpAM de classe II). Ces mécanismes d’action putatifs des CpAMs ont été dégagés à partir d’études in tubo sur Cp149. Cependant, si de nombreuses questions structurales ont été résolues sur HBV, les chemins d’assemblage et les intermédiaires hors équilibre qui conditionnent la formation des capsides et l’action des CpAMs demeurent inconnus, principalement à cause du manque de techniques efficaces capables de sonder des processus se déroulant entre la milliseconde et plusieurs heures sur des échelles spatiales nanométriques.

Nous proposons de comparer la dynamique structurale d’assemblage de capsides de HBV formées de Cp149, Cp183, Cp183-EEE et Cp183-7P avec et sans des CpAM de classes I et II et du pgRNA. Notre étude combinera diffusion des rayons X aux petits angles résolue en temps (time-resolved small-angle X-ray scattering, TR-SAXS) sur sources synchrotron, diffusion de neutrons (SANS) et cryo-microscopie électronique (cryo-EM).  Nous avons établi sur plusieurs modèles de capsides virales que cette combinaison de méthodes, grâce à l’excellente résolution spatio-temporelle du TR-SAXS, permettait d’identifier des chemins cinétiques et des intermédiaires d’assemblage hors équilibre jusqu’alors insoupçonnés. Nous pourrons ainsi établir directement comment s’assemble la capside de HBV, et comment les CpAMs interfèrent avec l’assemblage, sur quatre modèles pertinents : celui sur lequel les caractérisations structurales ont été faites jusqu’ici (Cp149), et trois (mimes d’)états de phosphorylation de Core capables d’interagir avec le pgRNA : la protéine sauvage (Cp183), un état mimant la phosphorylation d’assemblage (Cp183-EEE) et un mime de l’état hyperphosphorylé majoritaire dans les cellules infectées (Cp183-7P).

Contexte: Le virus Zika (ZIKV) est un arbovirus tératogène avec un fort potentiel d’émergence. ZIKV persiste dans le tractus génital masculin des mois après la clairance systémique, permettant ainsi sa transmission sexuelle prolongée. Outre sa contribution à la propagation de la maladie, la persistance de virus infectieux dans le sperme constitue une menace pour les femmes enceintes et leurs fœtus, l'exposition au sperme infecté augmentant le risque d'infection congénitale. Il est donc crucial de comprendre les raisons de l’excrétion séminale prolongée du ZIKV.

Résultats obtenus: Grâce à nos modèles uniques combinés à des analyses in vivo, nous avons démontré que ZIKV infecte le testicule humain et se réplique de manière persistante dans les cellules germinales testiculaires (TGC), qui constituent le principal réservoir du virus dans le sperme des hommes infectés (Matusali et al, JCI 2018; Mahé et al, Lancet Infect Dis 2020). Nous avons révélé que les TGC humaines ne déclenchent pas de réponse antivirale lors de l’infection par le ZIKV ou après stimulation par le PolyI:C, et qu'une sous-population de TGC n'exprime pas le récepteur de l'interféron de type I (IFN) (Kuassivi et al, Front Immunol 2022), soulignant les caractéristiques immunitaires innées particulières de ces cellules réservoir.

Objectifs: L'objectif de ce projet est d'approfondir notre compréhension des mécanismes précoces qui permettent au ZIKV de persister dans les TGC. Nos objectifs spécifiques sont d'élucider les facteurs cellulaires (WP1) et viraux (WP2) qui permettent au ZIKV de se répliquer dans les TGC sans déclencher de réponse antivirale de l'hôte ni de mort cellulaire pendant la phase aiguë, favorisant ainsi une réplication virale prolongée.

Notre projet repose sur l'utilisation de TGC humaines primaires et de techniques que nous maîtrisons parfaitement.

Dans le WP1, nous allons:

1. Décrypter les mécanismes de la faible réponse antivirale des TGC au ZIKV. Nos données préliminaires montrent que les TGC expriment de faibles niveaux de MAVS, une protéine essentielle pour activer la réponse antivirale innée lors de l’infection par ZIKV. A l’inverse, les TGC expriment des niveaux élevés de protéines d'autophagie connues pour interagir avec MAVS et la réplication du ZIKV. Nous déterminerons le rôle de l'autophagie sur les réponses innées et la réplication du ZIKV dans les TGC.
2. Déterminer la capacité des populations de TGC infectées par ZIKV à répondre à l'activité antivirale des IFN-I/III. Nos données préliminaires montrent une réponse limitée des TGC à l'IFN-I exogène et l’absence d'expression de son récepteur dans une population de TGC. Nous étudierons l'expression et la signalisation des récepteurs des IFN-I/III dans les TGC, et nous déterminerons l'effet du traitement par IFN-I et III sur la réplication du ZIKV pour révéler d'éventuelles cellules réservoirs résistantes aux IFN.

Dans le WP2, nous utiliserons des chimères ZIKV/DENV pour identifier les protéines virales responsables du tropisme de ZIKV pour les TGC et de sa réplication non-cytopathique. Nos données préliminaires montrent en effet que le virus de la Dengue (DENV) n'infecte pas les TGC, ce qui en fait un contrôle idéal. Ces résultats établiront les bases d'une compréhension approfondie des interactions moléculaires entre le ZIKV et ses cellules réservoirs, et fourniront un modèle prédictif pour évaluer le potentiel d'autres virus émergents à persister dans les TGC.

Résultats attendus: À la fin de ce projet de trois ans, nous espérons dévoiler de nouveaux mécanismes régissant les réponses antivirales et la survie des cellules germinales testiculaires infectées par ZIKV. Au-delà de ZIKV, les découvertes et les modèles générés offriront une base solide pour anticiper la capacité d'autres virus émergents à établir des infections similaires et ainsi persister dans le sperme. Dans l'ensemble, ce projet approfondira notre compréhension des mécanismes précoces de la persistance virale dans un réservoir cellulaire clé. Ces avancées pourraient ouvrir la voie à de nouvelles stratégies de prévention de la transmission sexuelle prolongée du ZIKV et d'autres virus émergents.

Les maladies hépatiques virales chroniques représentent un problème de santé publique majeure.  L'infection chronique par le virus de l'hépatite C (VHC) est un facteur de risque majeur pour le développement de la fibrose, de la cirrhose et du carcinome hépatocellulaire (CHC), la quatrième cause de mortalité liée au cancer dans le monde. Jusqu'à 85-95% des cancers du foie se développent dans le cadre d'une maladie fibrotique. Cependant, il n'existe toujours pas de thérapie approuvée pour la fibrose et les options thérapeutiques actuelles pour le CHC sont encore très insatisfaisantes. De plus, il n'existe pas de stratégie thérapeutique pour prévenir le développement du CHC chez les patients à risque ou la récidive du CHC après une intervention.

Il est estimé que 57 millions de personnes vivent avec une infection chronique par le VHC dans le monde et que 300 000 décès liés au VHC surviennent chaque année. La disponibilité d'antiviraux à action directe (AAD) a révolutionné les thérapies anti-VHC. Néanmoins, la suppression ou le contrôle viral n'élimine pas le risque de CHC chez les patients présentant une fibrose avancée. L’infection par le VHC est associée à des schémas transcriptionnels pro-oncogènes, à des modifications épigénétiques et à une perturbation des réponses immunitaires qui peuvent persister même après une cure d'AAD. Par conséquent, cibler les mécanismes oncogéniques associés au virus peut être une stratégie intéressante pour prévenir le CHC.

La chimioprévention du CHC est apparue comme une nouvelle stratégie prometteuse. Cependant, aucune thérapie de ce type n'a été mise en place à ce jour en raison de la difficulté à valider expérimentalement les cibles candidates. En 2008, une signature pronostique hépatique (PLS) de 186 gènes a été identifiée chez des patients fibrotiques infectés par le VHC comme une signature prédisant la progression de la maladie et le risque de CHC. Récemment, nous avons établi un système cellulaire unique qui reproduit la PLS (cPLS). Il est basé sur l’utilisation de cellules hépatocytaires infectées par le VHC qui reproduisent les dérégulations transcriptomiques observées chez les patients évoluant vers un CHC. Nos études précédentes ont montré que l'inversion de la cPLS de mauvais pronostic en cPLS de bon pronostic par des molécules candidates se traduit par un effet sur la progression de la fibrose et sur l'hépatocarcinogenèse in vivo. Le modèle cPLS offre donc des possibilités uniques de découvrir des composés pour la chimioprévention du CHC induit par le VHC.

Notre principal objectif était d'utiliser ce système cPLS pour la découverte de médicaments chimiopréventifs. Pour atteindre cet objectif, nous avons effectué un criblage de 52 composés approuvés par la FDA et sélectionnés bio-informatiquement dans le système cPLS. Parmi les 52 composés, nous avons identifié 11 composés candidats qui révertent la cPLS indépendamment de la charge virale. De manière intéressante, plusieurs composés agissent sur la signalisation calcique, un processus crucial régulant le métabolisme hépatique, la prolifération cellulaire et l'inflammation. Pour mieux comprendre le potentiel de la signalisation calcique pour la chimioprévention du CHC, nous allons maintenant étudier le mécanisme d'action moléculaire des principaux composés identifiés en utilisant des systèmes cellulaires et des modèles ex vivo dérivés de patients. Notre programme est basé sur (i) la confirmation que les composés sélectionnés agissent sur la cPLS de mauvais pronostic induite par le VHC en modulant la signalisation calcique (ii) la confirmation de l'engagement de la cible et de la spécificité des composés en utilisant des études de perte et de gain de fonction et (iii) la validation de nos résultats dans des modèles ex vivo cliniquement pertinents dérivés de patients.

Ce programme permettra d’obtenir un ensemble de données solides pour une étude plus approfondie dans des modèles précliniques murins de fibrose et de CHC. L'identification de composés candidats pour la chimioprévention du CHC déjà approuvés par la FDA ouvrira la voie au développement de futures stratégies thérapeutiques et accélérera la traduction clinique.