Projets et candidats lauréats

Détournement des protéines à PDZ de l’hôte pendant l’infection par le virus de l’hépatite B

L’infection par le virus de l’hépatite B (VHB) constitue un problème majeur de santé publique mondial. Il y aurait actuellement plus de 350 millions de porteurs chroniques du VHB et plus de 1 million de morts par an. Il existe pourtant une prophylaxie efficace par la vaccination depuis plus de 20 ans. Malgré́ cela, l’hépatite B chronique est toujours une maladie incurable. L’infection est caractérisée par une hépatite aiguë, conduisant fréquemment à une chronicité sans symptômes, entraînant une possible progression lente vers la cirrhose et le carcinome hépatocellulaire (HCC) dont le VHB est la cause principale (> 70 %).

Le matériel génétique sous forme d’ADN du VHB est protégé par une capside protéique composée de la protéine de core (HBc). HBc, en dehors de son rôle dans la formation des capsides, est impliquée dans différentes étapes de la réplication virale comme la transcription inverse de l’ARN prégénomique en ADN ou le transport dans le noyau de l’ADN viral au moment de l’infection. HBc est également recrutée sur l’ADN viral nucléaire (ADNccc) et modifie sa structure. Il est suggéré́ qu’HBc régule également la transcription du VHB ainsi que la transcription de gènes cellulaires. Ainsi, HBc interagit potentiellement avec de multiples protéines de l’hôte lors du cycle viral.

HBc contient un motif de reconnaissance aux domaines PDZ (appelé PBM pour PDZ-binding motif) exposé à l’extrémité C-terminale de sa séquence. Ces motifs PBM interagissent avec une grande famille de domaines d’interaction protéine-protéine appelés PDZ (PSD-95/Dlg/ZO-1) qui interviennent dans de nombreuses voies de signalisation humaine. De nombreux virus utilisent des PBMs codés dans leurs protéines virales pour capturer les protéines contenant des PDZ et détourner leurs fonctions. Des PBMs viraux peuvent être des facteurs de virulence tel que ceux de la protéine d’enveloppe du SARS-CoV ou du virus de la Rage, mais interviennent aussi dans l’oncogénicité des papillomavirus à haut-risque. Les perturbations dues aux interactions entre les PBMs viraux et les protéines cellulaires contenant des domaines PDZ favorisent le cycle de vie du virus chez l’hôte et la dissémination vers de nouveaux hôtes. Ainsi, le ciblage de l’interface PBM viral-PDZ de l’hôte pourrait conduire à de nouvelles thérapies antivirales.

Les cibles d’HBc contenant des domaines PDZ dans la cellule infectée sont peu connues. Le PBM d’HBc du VHB a été rapporté comme interagissant avec seulement deux protéines à PDZ humaines : la phosphatase PTPN3 et la protéine GIPC1. Nous avons récemment identifié de nouveaux partenaires cellulaires potentiels de HBc par le biais d’interactions PDZ-PBM en criblant le PBM d’HBc contre notre bibliothèque complète de domaines PDZ humains.

Le projet est divisé en trois parties :

– La sélection de protéines à domaine PDZ pertinentes pour la réplication virale parmi les protéines interagissant avec le domaine PBM d’HBc et identifiées lors du criblage de la banque de PDZs humains. Celles-ci seront sélectionnées en mesurant l’effet de leur extinction par siRNA sur la réplication virale dans des cellules infectées.

– L’étude plus approfondie des protéines à PDZ sélectionnées en validant leur rôle dans différents modèles cellulaires et en identifiant l’étape du cycle viral affecté.

– La caractérisation des propriétés fonctionnelles et structurales d’HBc en interaction avec les protéines à PDZ, sélectionnées pour leur impact sur le cycle viral, en utilisant une approche couplée de biologie structurale intégrative et de biophysique.

L’identification de protéines cellulaires impliquées dans les activités d’HBc et la caractérisation structurale de leurs interactions ouvriront de nouvelles pistes de recherches sur la physiopathologie du VHB et pourraient conduire à l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques dans le traitement de l’hépatite B chronique.

La consommation et le commerce de faune sauvage sont tenus pour les principaux responsables de la pandémie actuelle de COVID-19. A ce jour, des virus SARS-CoV-2-like ont été isolés chez seulement deux mammifères asiatiques (chauve-souris et pangolin). Étant donné la diversité des virus SARS-CoV et leur capacité reconnue à franchir les barrières inter-espèces, il y a lieu de considérer que le spectre de diversité des virus SARS-CoV-2-like reste à décrire. Un tel gap de connaissance pourrait expliquer l’incapacité actuelle à identifier le processus infectieux qui a abouti à la pandémie actuelle, le scénario le plus privilégié étant celui de recombinaisons multiples entre des virus SARS-CoV-2-like provenant d’hôtes intermédiaires inconnus. Parce que le commerce de la faune sauvage est directement relié à la propagation des maladies émergentes, la surveillance des espèces sauvages constitue une sentinelle cruciale à l’anticipation des futures épidémies, notamment celles liées au SARS-CoV-2.

La consommation de viande de brousse est une culturelle implantée en Afrique tropicale, et est impliquée dans l’occurrence de plusieurs maladies émergentes. Les plus récents travaux étayent l’hypothèse selon laquelle la diversité des virus SARS-CoV-2-like reste quasi-inexplorée chez les mammifères, et nous avançons l’hypothèse qu’une lacune en matière de connaissances en Afrique tropicale reste à combler. D’autant plus que les mammifères positifs au SARS-CoV-2-like en Asie ont des représentants en Afrique (pangolin et rhinolophe).

Dans le contexte de la pandémie de COVID-19, l’étude des réservoirs et des pratiques liées au commerce de faune sauvage est une condition sine qua none pour une surveillance sanitaire efficace. AFRICoV aborde la question de l’infection par le SARS-CoV-2 à partir du prisme original des réservoirs, dans le cadre du commerce de viande de brousse en Afrique – qui depuis peu, est aussi relié à l’Asie via le trafic des pangolins. Notre objectif général est de mener une surveillance sanitaire et une évaluation des risques concernant la potentialité d’une prochaine pandémie liée au SARS-CoV-2 en Afrique tropicale ; un objectif particulièrement pertinent étant donné le manque de sensibilisation des populations aux questions de santé liées à la consommation de viande de brousse. AFRICoV se structure atour de quatre objectifs principaux: (i) l’évaluation de la prévalence des virus SARS-CoV-2-like chez les mammifères, (ii) la caractérisation de l’évolution du SARS-CoV-2, iii) l’anticipation de nouveaux réservoirs en Afrique tropicale, et (iv) la mise en œuvre de mesures efficaces pour protéger les pays africains contre de nouvelles maladies zoonotiques.

A travers une approche comparative impliquant trois pays (Côte d’Ivoire, Bénin et Cameroun), AFRICoV propose une approche multidisciplinaire reliant la caractérisation génomique des virus SARS-CoV-2-like, la surveillance sanitaire des réservoirs mammifères et l’étude des perceptions des parties prenantes du commerce de viande de brousse sur la pandémie de COVID-19. Les membres du projet AFRICoV ont acquis une expertise sur la surveillance du commerce de la viande de brousse, impliquant la caractérisation génétique / génomique des hôtes et de leurs agents pathogènes, ainsi que l’étude de la sensibilisation des communautés impliquées dans le commerce de viande de brousse aux questions de santé. Ces travaux, effectués en amont d’AFRICoV, offrent l’opportunité exceptionnelle d’accéder au réseau du marché de viande de brousse africain et d’évaluer les risques pour la santé publique qui y sont associés.

Les principaux délivrables issus d’AFRICoV consisteront en (i) une meilleure compréhension de l’évolution des virus SARS-CoV-2(-like), (ii) une estimation sans précédent de nouveaux réservoirs en Afrique tropicale, (iii) la validation d’un diagnostic RT-PCR pour le dépistage des virus chez les hôtes, (iv) une formation Sud-Sud sur le diagnostic moléculaire viral, (v) la production de supports éducatifs sur le lien entre consommation de viande de brousse et santé publique, et (vi) un atelier régional de restitution en Afrique de l’Ouest incluant les décideurs politiques.

En Egypte, la séroprévalence du virus de l’hépatite C (VHC) est parmi les plus élevées au monde, à 10% avec près de 4 millions de personnes virémiques en 2015. Les antiviraux directs, efficaces et bien tolérés, permettent d’envisager l’élimination du virus en Égypte. Après avoir obtenu une baisse considérable du prix des traitements, puis avoir favorisé la production locale de génériques permettant un traitement curatif à 75 US$, le gouvernement égyptien a débuté en 2018 un « Plan National de Traitement » pour dépister et traiter l’ensemble de la population adulte égyptienne. Cette campagne prendra fin en 2019. Or, même guéris de l’infection virale, les patients cirrhotiques gardent un risque important de développer un carcinome hépato-cellulaire (CHC), estimé entre 0,3% et 2,4% par an. En Égypte, le CHC est le cancer le plus fréquent, avec une incidence de 25,6/100 000 personnes par an en 2018. Malgré des recommandations de dépistage par une échographie abdominale et un dosage de l’alpha foeto-protéine tous les 4 mois, seulement 25% des CHC sont diagnostiqués aux stades 0 et A de la classification de la Barcelona Clinic Liver Cancer (BCLC) accessibles à un traitement curatif. Ainsi, la médiane de survie du CHC en Egypte n’est que de 10,9 mois. Face à ce constat, le gouvernement égyptien souhaite profiter des structures ad hoc mises en place pour le Plan National de Traitement pour améliorer le dépistage du CHC, permettant un diagnostic plus précoce du CHC et une meilleure survie.

L’objectif de notre projet est de réaliser une étude en efficacité et en coût-efficacité de la mise en place d’une stratégie de dépistage du CHC chez les patients cirrhotiques infectés par le virus de l’hépatite C et guéris dans le cadre du Plan National de Traitement. Cette étude s’appuiera sur l’utilisation d’un modèle mathématique individu-centré de type micro-simulation, qui modélisera l’histoire naturelle du CHC ainsi que sa prise en charge dans le contexte égyptien. La population modélisée représentera la population adulte égyptienne cirrhotique, traitée pour le VHC, avec la présence de co-morbidités telles que la coinfection par l’hépatite B, l’obésité et le diabète.

Les paramètres cliniques du modèle s’appuieront sur des données déjà existantes : les données démographiques seront issues de la cohorte Hepnile (ANRS 12332), une cohorte de patients égyptiens traités dans le cadre du Plan National de Traitement. Les données de l’histoire naturelle du CHC proviendront de la cohorte CirVir (ANRS CO12), qui a suivi de façon prospective depuis 2006 des patients atteints de cirrhose compensée d’origine virale en France. Les données d’épidémiologie clinique du CHC en Égypte seront tirées d’une cohorte rétrospective monocentrique de 5 000 CHC, portant sur la période 2007-2017. Enfin, les données de coûts seront recueillies lors d’une étude réalisée dans le cadre du projet. Les coûts étudiés couvriront : les coûts de la prise en charge habituelle, et les coûts de l’intervention qui se divisent en coûts initiaux, coûts fixes et coûts variables.

L’efficacité clinique sera mesurée par l’espérance de vie globale et le pourcentage de CHC diagnostiqués aux stades 0 et A de la classification BCLC. Les critères d’efficacité pour l’analyse médico-économique seront exprimés en années de vie sauvées, années de vies ajustées à la morbidité (DALYs), années de vie ajustées à la qualité (QALYs). Le coût-efficacité sera estimé par le ratio incrémental en coût-efficacité (ICER), qui est calculé par le rapport de la différence de coûts par la différence d’efficacité. Dans les pays à revenu intermédiaire, une intervention est considérée comme coût-efficace si l’ICER est compris entre une fois et 3 fois le PIB national/habitant (en Egypte : 2 412 US$/hab en 2017).

Le développement de notre modèle permettra ainsi de réaliser la première étude en coût-efficacité des stratégies de dépistage du CHC dans un pays à revenu intermédiaire, et dans un contexte d’épidémie généralisée. In fine, notre modèle et nos résultats pourront être transposés à d’autres pays avec des épidémiologie et économie similaires, comme la Mongolie, la Géorgie ou le Pakistan.

L’immunoprophylaxie passive à l’aide d’anticorps monoclonaux humains ayant des propriétés neutralisantes (bNAb) contre le VIH est une nouvelle stratégie potentielle pouvant contribuer à l’élimination de la transmission du VIH-1 par l’allaitement maternel. VRC07-523-LS est un de ces bNAbs qui cible le site d’attachement du VIH sur le récepteur CD4 de plus de 96% des virus, y compris de sous-type C. Après une injection sous cutanée unique, la durée de protection contre l’acquisition du VIH-1 est estimée 3 mois chez l’adulte et jusqu’à six mois chez le nourrisson.

L’essai Umbrella est un essai ouvert de phase 1/2 évaluant la tolérance et la pharmacocinétique de VRC07-523-LS chez des nourrissons exposés au VIH-1 à Pretoria en Afrique du Sud. Les objectifs principaux consistent à évaluer à six mois la tolérance et la pharmacocinétique d’une injection SC de VRC07-523-LS administrée dans les premières 72 h de vie chez des enfants exposés au VIH mais non infectés, en Afrique du Sud. Les objectifs secondaires consistent à évaluer à douze mois la tolérance et la pharmacocinétique d’une seconde injection SC de VRC07-523-LS administrée à 4 mois de vie chez les participants encore allaités et exposés au VIH à ce moment.

L’essai va entièrement se dérouler à l’Hôpital Académique Steve Biko (SBAH) à Pretoria. Il va inclure 108 nouveau-nés ainsi que leurs mères infectées par le VIH-1 ayant bénéficié de l’option B+ de la PTME telle que recommandée en Afrique du Sud. Soixante-douze d’entre eux seront randomisés et recevront une injection SC de 80mg de VRC07-523-LS dans les 72 premières heures de vie, associée à une seconde injection de 100mg à 4 mois s’ils sont encore allaité-exposés à ce moment. Trente-six nouveau-nés seront randomisés dans le bras comparatif « sans traitement » (c’est-à-dire recevant le standard de traitement incluant la prophylaxie antirétrovirale post natale). Tous les enfants seront suivis mensuellement pour un bilan clinique, une recherche d’évènements indésirables et la collecte d’un prélèvement de sang capillaire (DBS) jusqu’à l’âge de six mois si l’allaitement a été interrompu avant 4 mois et jusqu’à l’âge de 12 mois si l’allaitement a été prolongé au-delà. Le titre d’anticorps VRC07-523-LS sera mesuré chaque mois et des tests de neutralisation dans le sérum de ces enfants à 4, 6 et 12 mois. Les résultats attendus sont la mise en évidence d’un événement indésirable de grade 3 ou 4 possiblement lié au VRC07-523-LS chez moins de 20% des enfants exposés au produit et un titre d’anticorps VRC07-523-LS supérieur au niveau protecteur (50ng/ml) dans plus de 90% des échantillons. Cet essai de phase 1/2 devrait fournir des données cruciales pour permettre ou non la décision (« Go/No go ») de réaliser un essai de phase 3 visant à évaluer la tolérance et l’efficacité d’une immunoprophylaxie passive néonatale universelle à l’aide de VRC07-523-LS, à Ehlanzeni, un district en Afrique du Sud où la prévalence et l’incidence du VIH-1 est particulièrement élevée et la transmission de la mère à l’enfant imparfaitement contrôlée.

Hypothèses

La maladie COVID-19 est apparue fin 2019 à Wuhan en Chine, et s’est propagée dans le monde entier à partir de janvier 2020. Le 11 mars, l’épidémie a été déclarée pandémie par l’OMS. Depuis, près de 3 milliards de personnes à travers le monde ont été appelées à se confiner. En l’absence de vaccin, de moyens biomédicaux de prévention ou de traitement, des mesures barrières pour limiter la transmission sont recommandées, pouvant avoir des effets collatéraux importants sur le plan social, économique, psychologique ou sanitaire, particulièrement pour les populations les plus vulnérables et marginalisées comme les usagers de drogues injectables (UDI). Au Vietnam, les UDI sont la première population-clé touchée par le VIH et l’hépatite C. Depuis le 1er cas de COVID détecté fin janvier, le gouvernement a mis très vite en place des mesures restrictives, jusqu’au confinement total de la population depuis le 1er avril. Pour les UDI, cela pourrait entraîner des difficultés d’accès aux services et aux matériels de prévention et de réduction des risques, l’interruption des thérapies assistées par médicaments qui nécessitent un copaiement et des traitements antirétroviraux (ARV).

Objectifs

Nous proposons d’évaluer l’impact des mesures de lutte contre le COVID-19 sur les comportements à risque pour le VIH et le VHC et l’accès à la prévention et aux soins pour les UDI à Hai Phong au Vietnam. Plus précisément, l’étude évaluera les changements en termes de comportements à risque liés à la consommation de drogues, d’accès et d’adhérence aux thérapies assistées par médicaments et aux ARV pour ceux infectés par le VIH, et d’accès aux matériels de réduction des risques. Seront également évalués : l’accès aux drogues et les modes de consommation; les risques liés aux pratiques sexuelles; l’accès au soutien par les personnels de santé et les éducateurs pairs; la qualité de vie; la santé mentale, l’accès et l’adhérence aux traitements psychiatriques; la situations économique et sociale; la survenance d’événements incluant incarcération, suicide, overdose.

Design de l’étude

Une approche « avant-après » sera utilisée, complétée par un volet qualitatif. La mesure des indicateurs « avant » la mise en place des mesures restrictives sera tirée de la dernière visite de suivi des participants aux projets ANRS12353 DRIVE, ANRS12380 DRIVE-C ou ANRS12410 DRIVE-MIND en cours à Hai Phong. Les mêmes indicateurs seront mesurés « après » via une enquête transversale menée après la fin du confinement : pendant une visite de suivi spécifique organisée pour les participants au projet DRIVE; pendant la visite de fin d’étude pour les participants au projet DRIVE-C; pendant la visite de suivi du mois 18 pour les participants au projet DRIVE-MIND. Un questionnaire standardisé sera appliqué et des tests biologiques (sang, urine) seront effectués pour recueillir les données. L’étude qualitative sera composée de discussions avec un groupe témoin d’éducateurs pairs, suivies d’entretiens individuels approfondis avec des participants.

Population de l’étude

La population de l’étude inclut les participants aux études DRIVE, DRIVE-C et DRIVE-MIND pour lesquels des données ont été collectées au cours des 6 derniers mois (entre octobre 2019 à mars 2020):

– Les participants DRIVE ayant participé à l’enquête DRIVE n°4 (octobre 2019-janvier 2020) (N=760)

– Les participants DRIVE-C étant toujours en suivi (N=200)

– Les participants DRIVE-MIND ayant effectué leur visite de suivi à 12 mois (mars 2020) (N=160)

Faisabilité

Notre groupe de recherche travaille dans le domaine de la consommation de drogues, du VIH et du VHC depuis six ans à Hai Phong. Le succès de la mise en œuvre du programme DRIVE, grâce notamment à l’implication des autorités sanitaires et des organisations communautaires, donne des garanties rassurantes quant à la faisabilité du projet.

Résultats attendus

Décrire l’impact des mesures de lutte contre COVID-19 sur les UDI fournira des informations utiles pour ajuster les programmes et prendre les mesures appropriées afin d’éviter une augmentation des nouvelles infections par le VIH et le VHC et de la morbidité liée à la consommation de drogues au Vietnam.

Situation du sujet : Au stade chronique de l’infection virale B, des complications peuvent survenir comme la fibrose hépatique qui peut évoluer vers une cirrhose hépatique ou un carcinome hépato-cellulaire. Le mécanisme physiopathologique de la fibrose hépatique est complexe mais l’activation puis la prolifération des cellules hépatiques stellaires (CHS) joue un rôle primordial dans la fibrogenèse. L’implication du VHB et/ou de ses protéines virales spécifiques dans l’activation des CHS et la fibrose hépatique reste à préciser.

Objectifs : Le projet Fibcore a pour objectifs de mettre en place les outils moléculaires qui permettront d’étudier le rôle différencié ou combiné des protéines HBc et HBe dans l’induction de la fibrose hépatique via le développement d’un modèle de co-culture cellulaire utilisant les lignées HepaRG et LX2.

Méthodes :

Plusieurs étapes sont nécessaires pour mener à bien ce projet :

1. La construction de 3 particules lentivirales : l’une contenant le transgène complet (le PBC et les gènes précore-core), la 2ème contenant le transgène précore-core tronqué du PBC et la 3ème contenant uniquement le gène core
2. L’optimisation de la transduction des cellules HepaRG différenciées (dHepaRG) pour synthétiser les protéines d’intérêts
3. La production des protéines HBc et HBe après transduction des HepaRG par les particules lentivirales définies dans l’étape 1
4. La validation du modèle de co-culture cellulaire utilisant les lignées HepaRG et LX2.
5. La mesure de l’impact de la production simultanée ou différentielle des protéines HBc et HBe sur l’expression des gènes profibrotiques ou la synthèse des marqueurs pro-fibrotiques (collagène 1, a-SMA, PDGF, TGF-β1) pour déterminer le rôle pro- ou anti-fibrosant de ces deux protéines.

Echéancier : Les étapes 1 et 2 ont été validées en 2017 au cours des travaux de master 2 du Dr Lefeuvre et du doctorat d’université du Dr Pivert. Une partie de l’étape 3 a été validée au cours  des travaux de master 2 du Dr Przyrowski et l’optimisation de la synthèse de la protéine HBc est en cours. Les étapes 4 et 5 feront l’objet des travaux de thèse d’université du Dr Lefeuvre.

Résultats attendus : Nous espérons valider notre modèle d’étude de la fibrose hépatique par une production efficiente des protéines HBc et HBe suite à la transduction des dHepaRG et étudier le rôle pro- ou anti-fibrosant de ces mêmes protéines en appréciant le niveau d’expression des gènes profibrotiques suite à l’activation des CHS.

Les protéines transmembranaires induites par l’interféron (IFITM) sont une famille de facteurs de restriction dotés d’une activité antivirale à large spectre. Les IFITM ont été associés à deux effets antiviraux : la séquestration des virions entrants dans les endosomes (protection des cellules cibles) et plus récemment la production de particules virales moins infectieuses (effet négatif sur l’infectivité des virions néo-produits). Dans les deux cas, les IFITM agissent selon un mécanisme/s inconnus sur la capacité de fusion entre membranes virales et cellulaires.

Avec le soutien de l’ANRS, notre laboratoire a d’abord révélé l’existence de la deuxième propriété antivirale des IFITM dans le cas du VIH-1, puis a procédé à sa caractérisation selon des orientations que nous présentons et que nous proposons de poursuivre ici. En examinant les protéines IFITM issues de différentes espèces animales, les données que nous avons recueillies montrent une grande hétérogénéité quant à leur capacité à diminuer l’infectivité des particules du VIH, une capacité qui peut sous-tendre une régulation spécifique de l’espèce et qui peut représenter une nouvelle couche de régulation de leurs activités que nous proposons de caractériser davantage.

Dans un but plus mécanistique, des données de notre laboratoire nous ont aussi permis de déconnecter l’incorporation physique des IFITM dans les particules virales de leur effet antiviral, appuyant un modèle selon lequel les IFITM modifient de façon irréversible un composant cellulaire inconnu incorporé dans les particules virales et responsable du phénotype. Ceci nous a conduit à une analyse omiquedes virions-IFITM3. Ainsi, nous avons non seulement identifié un nouveau régulateur potentiel d’IFITM3, mais nous avons également identifié des protéines et des phospholipides spécifiquement enrichis dans des virions-IFITM3 pouvant potentiellement expliquer le défaut d’infectivité. Enfin, en collaboration avec le laboratoire du Dr Muriaux / Favard (IRIM, Montpellier), nous avons utilisé la microscopie à force atomique (AFM) / Nanoindentation sur des virus réplicatifs. Les résultats obtenus jusqu’à présent indiquent des modifications de l’élasticité des virus IFITM3. Ce résultat représente d’une part la première mesure mécanique des différences entre virions sauvages et IFITM3 et d’autre part conforte l’usage de cet outil précieux pour nos analyses futures.

Sur la base de ces résultats non publiés, notre projet vise à approfondir notre compréhension de l’action antivirale des IFITM contre le VIH et plus spécifiquement leur régulation spécifique de l’espèce, le rôle d’un cofacteur que nous avons identifié ainsi que leur mécanisme d’action.