Projets et candidats lauréats

Le virus de l'hépatite B (VHB) est l'un des agents pathogènes humains les plus graves : environ 250 millions de personnes souffrent d'hépatite B chronique et environ 800 000 en meurent chaque année. Le VHB est un virus enveloppé avec une nucléocapside icosaédrique contenant de l'ADN partiellement double brin (rcDNA). Le composant élémentaire de la capside est un dimère de la protéine Core de 183 résidus (ou 185 selon le génotype): les 149 résidus N-terminaux (Cp149) constituent le domaine d'assemblage qui peut s'auto-assembler in vivo et in vitro en capsides icosaédriques avec principalement une triangulation T = 4 (120 dimères). Les 34 (ou 36) acides aminés restants, riches en arginine, constituent le domaine C-terminal (CTD) qui est essentiel pour l'encapsidation de l'ARN viral prégénomique (pgRNA) par Core. Le CTD peut être phosphorylé jusqu'à 7 fois in vivo, mais seuls trois sites de phosphorylation sont nécessaires à l'encapsidation. Un mutant recombinant de Core a été conçu pour imiter ce scénario en remplaçant les trois sérines clés par des glutamates (Cp183-EEE). Enfin, des molécules qui perturbent l'assemblage de la capside (CAMs pour capsid assembly modulators) en interférant avec les contacts entre les dimères de Core sont de puissants inhibiteurs in vitro de la réplication du VHB et de nouvelles options potentielles de médicaments anti-VHB. Des études in tubo sur la Cp149 ont révélé les modes d'action potentiels des CAMs. Les CAMs semblent agir soit en favorisant l'assemblage, conduisant à la formation de capsides vides (CAM-E), soit en les détournant de la voie d'assemblage, conduisant à des capsides malformées et aberrantes (CAM-A). Certains CAM ont également démontré des effets supplémentaires in vitro, y compris la perturbation de capsides déjà formées et la diminution de l'ADN viral nucléaire (cccDNA).

Nous proposons ici de capitaliser sur notre méthodologie biophysique et structurale originale, qui combine la physique des objets biologiques et la virologie structurale, pour clarifier le mode d'action d'une nouvelle série prometteuse de CAMs basée sur le composé à squelette glyoxamide GLP-26 (Amblard et al, 2020, 2023). Notre méthodologie combine la diffusion des rayons X aux petits angles (SAXS) sur des sources synchrotron et la cryo-microscopie électronique (cryo-EM), y compris des études résolues en temps. Nous l'avons validée avec la caractérisation de deux composés CAM-A et CAM-E prototypiques (Kra et al, 2023). Dans ce projet suite, nous étendrons la méthodologie d’une part à la photométrie de masse, une technique en molécule unique, d’autre part à la modélisation structurale des données SAXS grâce à des simulations Monte Carlo et l'apprentissage automatique. Cette méthodologie modifiée permettra de travailler dans des conditions moins artificielles que celles utilisées jusqu'à présent dans la biophysique de Core. Ainsi des concentrations particulièrement faibles de Core seront utilisées, dans lesquelles il est possible de différencier les comportements d'assemblage de Cp149 et de Cp183/Cp183-EEE, en particulier en présence de CAMs. L'accent sera mis sur deux séries distinctes de CAMs dérivés de GLP-26 : d’une part la forme active d’un dérivé actuellement en essais cliniques, ALG-00184 ; d’autre part des dérivés à double tête GLP-26 (D-CAMs), dont nous venons de montrer qu'ils ont des effets atypiques sur l'assemblage de la capside (Amblard et al., en révision), effets qui doivent être clarifiés.

De nombreuses études ont montré que le niveau de méthylation de certains marqueurs du génome de l’hôte était associé à la sévérité des lésions cervicales HPV-induites. Le projet MethAID vise à évaluer la faisabilité et la valeur prédictive de l’analyse de marqueurs de méthylation de l’ADN de l’hôte sur auto-prélèvements vaginaux (APV) dans le cadre du dépistage du cancer du col de l’utérus chez des patientes atteintes de maladies auto-immunes (MAI), souvent immunodéprimées du fait de leur pathologie ou de leurs traitements immunosuppresseurs.

Objectifs principaux et secondaires

L’objectif principal est de déterminer le caractère prédictif du niveau de méthylation de gènes spécifiques (FAM19A4, miR124-2) pour la sévérité des lésions cervicales précancéreuses.
Les objectifs secondaires incluent :

• l’automatisation de l’analyse des marqueurs de méthylation sur APV
• la caractérisation du niveau basal de méthylation dans cette population particulière
• la comparaison de la performance de ces marqueurs aux techniques conventionnelles (cytologie, typage HPV)
• l’évaluation de leur pertinence en dépistage primaire ou en outil de triage après test HPV

Contexte scientifique

Les femmes atteintes de MAI présentent un surrisque majeur de cancers HPV-induits. Ce risque est multiplié par 8,7 dans le lupus érythémateux systémique (LES) pour les lésions de haut grade et par 4 pour le cancer invasif. Des risques accrus sont également observés dans la polyarthrite rhumatoïde. Par ailleurs, l’adhésion au dépistage est souvent insuffisante dans cette population (≈ 50 % de patientes à jour).

Les APV représentent une alternative intéressante au frottis cervico-utérin (FCU) classique, en améliorant l’accessibilité et l’acceptabilité du dépistage. Toutefois, ils ne permettent pas d’analyse cytologique réflexe en cas de test HPV positif, générant un parcours plus complexe pour les patientes. L’ajout de marqueurs de méthylation automatisés sur APV constituerait donc une avancée majeure, permettant de limiter le recours itératif aux colposcopies tout en rassurant les patientes.

Hypothèses de travail

• Le niveau de méthylation mesuré sur APV est corrélé à la sévérité des lésions cervicales
• L’automatisation de ces tests est techniquement réalisable et indispensable à une intégration en dépistage de masse
• Les seuils de méthylation observés en population générale pourraient ne pas être applicables aux patientes atteintes de MAI, nécessitant une réévaluation spécifique

Méthodologie

L’étude MethAID est conçue comme une étude ancillaire de la cohorte APOSY (276 patientes, Hôpital Bichat-Claude Bernard), qui documente la prévalence et la persistance des infections HPV dans les MAI.

Au total, 381 prélèvements APV seront analysés :

• 276 à l’inclusion (dont 55 HPV-HR positifs),
• 50 en double analyse manuelle vs automatisée,
• 55 issus du suivi à 1 an pour évaluer la persistance virale et la dynamique des marqueurs de méthylation.

Les données de méthylation seront exprimées en log2(Ct ratio), comparées aux résultats virologiques et cytologiques, puis intégrées dans des modèles statistiques uni- et multivariés (tests de Wilcoxon, modèles de Cox).

Aspects éthiques

Le protocole respecte les dispositions approuvées par le CPP (NCT06302725, IRB Île-de-France XI), incluant la conservation des échantillons pour analyses ultérieures.

Retombées attendues

Le projet MethAID devrait :

• démontrer la faisabilité technique de l’automatisation de la méthylation sur APV
• fournir les premières données spécifiques aux patientes atteintes de MAI
• permettre de vérifier l’applicabilité des seuils de méthylation
• initier une stratégie innovante de dépistage personnalisé pour cette population à haut risque, réduisant les consultations inutiles et le stress lié aux résultats HPV positifs

L’insécurité alimentaire, définie comme l’accès incertain ou limité à une alimentation sûre, adéquate et acceptable, demeure l’un des défis majeurs de santé mondiale, touchant de manière disproportionnée l’Afrique subsaharienne, où elle est fortement associée à des effets délétères chez les personnes vivant avec le VIH, tels qu’une moindre observance du traitement antirétroviral (TAR), une progression accrue de la maladie, une détérioration de la santé mentale et des comportements à risque. Les adolescent·e·s, population particulièrement vulnérable, sont exposé·e·s à un risque accru en raison de leurs besoins nutritionnels plus élevés pendant la croissance, de la charge que le VIH impose au système immunitaire et des effets secondaires à long terme du TAR, qui interagissent avec des contraintes structurelles plus larges telles que la pauvreté, la stigmatisation et la précarité alimentaire au sein des ménages. En Côte d’Ivoire, plus de 20 000 adolescent·e·s et jeunes vivent avec le VIH (AVVIH), et l’intersection entre insécurité alimentaire, malnutrition, obésité, carences en micronutriments et maladies infectieuses crée un double fardeau encore peu prise en compte dans les programmes nationaux de santé et de nutrition, souvent centrés sur la santé maternelle et infantile tout en négligeant les besoins des adolescent·e·s. Bien que des projets antérieurs aient montré que les adolescent·e·s possèdent des connaissances importantes en matière de nutrition et de bonnes pratiques, des barrières socio-économiques, la faiblesse des interventions scolaires et le marketing omniprésent d’aliments transformés peu sains limitent leur capacité à adopter une alimentation plus saine, révélant un écart entre les connaissances et leur mise en pratique.

Le projet FINAH vise à explorer comment l’insécurité alimentaire affecte les AVVIH, dans le but ultime de co-développer des interventions culturellement appropriées qui répondent directement à leurs réalités vécues. Les objectifs spécifiques sont :

• Identifier les interventions nutritionnelles existantes, évaluer leur efficacité et explorer les opportunités ainsi que les barrières dans la prise en charge des besoins des AVVIH en Côte d’Ivoire.

• Explorer les points de vue des AVVIH, de leurs parents/tuteurs et des prestataires de soins de santé sur l’insécurité alimentaire, la malnutrition et leurs conséquences sur la santé des AVVIH en Côte d’Ivoire.

FINAH adopte une méthodologie participative communautaire qui implique les adolescents comme collaborateurs actifs. Des pairs éducateurs — sélectionnés parmi les cohortes d’AJVVIH déjà impliquées dans des projets connexes — seront formés pour participer à l’élaboration des outils de recherche, à l’appui au recrutement et à la contribution à l’interprétation et à la diffusion des données.

Des entretiens avec des informateurs clés seront ensuite menés auprès de représentants d’organisations nationales et internationales afin de cartographier les interventions existantes, d’évaluer leur efficacité et d’identifier les opportunités et les barrières dans la réponse aux besoins des AJVVIH. Parallèlement, des discussions de focus groupe (FGD) et des entretiens semi-structurés seront menés avec des adolescents et jeunes âgés de 15 à 24 ans, des parents/tuteurs et des prestataires de soins de santé pour explorer les mécanismes par lesquels l’insécurité alimentaire influence la santé, l’adhésion au TAR et les stratégies d’adaptation. Les données seront analysées à l’aide du logiciel NVivo, en combinant un codage déductif basé sur un cadre conceptuel préexistant et un codage inductif permettant de faire émerger de nouveaux thèmes, et par triangulation.

En combinant une approche participative et des méthodes qualitatives structurées, le projet FINAH, de 1 an, vise à produire des connaissances approfondies sur l’intersection entre l’insécurité alimentaire, la nutrition et le VIH chez les adolescents et jeunes, et à co-créer des interventions concrètes et adaptées au contexte, susceptibles d’améliorer à la fois la santé nutritionnelle en Côte d’Ivoire, tout en apportant des données probantes utiles aux politiques et pratiques à plus large échelle.

Les personnes vivant avec le VIH (PVVIH, efficacement traitées depuis longtemps, finissent par développer de l’inflammation chronique et un vieillissement prématuré de leur système immunitaire (SI). Avec le Dr. Hocqueloux, nous avons mis en évidence une dérégulation des ARNm de l’autophagie dans leurs cellules immunitaires (Serrano, AIDS 2008). La littérature rapporte que l’autophagie dans les T4 est touchée, mais aucune information n’est disponible pour les autres cellules. Et cliniquement parlant, comment combattre cet effet ? Chez les PvVIH fumant du cannabis, l’activation des lymphocytes T et des monocytes, l’inflammation et le réservoir sont plus faibles que chez celles ne fumant pas. Ceci est confortée par une de nos études préliminaires chez 19 PvVIH ayant pris du cannabidiol (CBD) comme complément alimentaire : chez les PvVIH sous CBD, la quantité d’ARNm de plusieurs cytokines dans les T4 et les monocytes, est inférieur à celui des PvVIH n’en prenant pas.

Ainsi basée sur l’état des connaissances, notre hypothèse de travail est que relancer l’autophagie chez les PvVIH via une prise de phytocannabinoïdes (pCB), peut permettre de diminuer l’inflammation et d’agir sur le vieillissement du SI. Le projet global dans lequel s’inscrit cette demande est liée à la première étude clinique dans le monde, randomisée et en double aveugle, testant l’effet des pCB sur l’autophagie (objectif principal) et l’inflammation : 40 PvVIH ont pris, en complément de leur traitement, une huile contenant du CBD spectre complet, qualité médicament, pendant 3 mois, tandis que 40 autres ont reçu de l'huile seule (placebo) pendant également 3 mois. Les volontaires inclus ont en moyenne 54 ans, contrôlent leur virus depuis plus de 15 ans et 1/3 sont des femmes. Cette étude est maintenant clôturée, et tous les échantillons biologiques à évaluer pour ce projet ANRS sont actuellement stockés au congélateur.

Le CBD a été bien toléré, il permet aux PvVIH un gain dans leurs activités physiques et aucun effet indésirable grave lié au traitement n’a été rapporté. Les paramètres immuno-virologiques classiques (taux de T4, ratio T4/T8, taille du réservoir, CV) sont restés stables, tous comme ceux permettant d’évaluer les fonctions du foie, des reins et du cœur. Nous montrons même un effet bénéfique sur la fréquence cardiaque, uniquement chez les hommes à la naissance. Nous avons pu vérifier par une étude transcriptomique et un dosage multiplex de cytokines sériques, sur un panel de 16 personnes sous CBD et 16 sous placebo, qu’une différence pour les paramètres inflammatoires (ARN et protéines plasmatiques) existait également entre les hommes et les femmes, chez les donneurs séronégatifs, et qu’elle était amplifiée chez les PvVIH. Nos premières analyses montrent que le CBD peut faire bouger ces taux d’ARN et de protéines, chez les PvVIH, plus chez les hommes que les femmes et des signatures d’expression sont en cours de définition (manuscrit en cours de préparation).

Comme pour l’inflammation, les ARNm des acteurs de l’autophagie ne sont pas présents en même quantité chez les hommes et les femmes, avec ou sans infection VIH. Sans ce financement d’un an supplémentaire, nous ne pourrons pas tester les effets du CBD sur l’expression de 6 protéines de l’autophagie et sur la fonction autophagique elle-même, les 2 se faisant par Western-Blot. Durant l’année demandée, nous souhaitons prolonger le contrat d’une technicienne de laboratoire en CDD, avec nous depuis 20 mois car elle a été formée aux 2 types de Western-blots nécessaires pour ce projet (protéines et fonction) par notre précédente ATER, la personne qui les a standardisés. Nous pourrons acheter des consommables.

En conclusion, les pCB constituent une approche thérapeutique nouvelle : relancer l’autophagie chez les PvVIH via un CBD spectre complet pourrait permettre de diminuer l’inflammation et le vieillissement cellulaire des personnes, ce qui leur permettra de mieux vieillir avec le virus.

Le virus de l’hépatite E (HEV) est la cause la plus fréquente d’hépatites virales aiguës dans le monde. Le HEV est un virus à ARN simple brin de polarité positive, nu dans les selles des patients mais qui quitte la cellule infectée sous forme d’une particule associée aux lipides, dite quasi-enveloppée (eHEV). Les génotypes 1 et 2 (HEV1, HEV2) sont strictement humains et responsables d’hépatites fulminantes chez la femme enceinte. Les génotypes 3 et 4 (HEV3, HEV4) sont zoonotiques et causent des hépatites chroniques chez la personne immunodéprimée. Nous avons montré que la protéine de l’autophagie LC3B colocalise avec la protéine de capside ORF2 dans les cellules de la lignée hépatocytaire humaine HepG2/C3A/F2 et que la forme cytoplasmique de LC3B, LC3B-I, interagit avec ORF2 (thèse de Claire Allioux, ANRS 2020-2). LC3B-I est impliquée dans des phénomènes de bourgeonnement vésiculaire à partir du réticulum endoplasmique, contribuant ainsi au contrôle de sa qualité.

Afin de mieux comprendre le trafic intracellulaire d’ORF2 dans les compartiments cellulaires contenant LC3B, nous proposons d’utiliser la microscopie confocale en temps réel pour le suivre la protéine ORF2, l’ARN viral et la protéine LC3B dans des cellules HepG2/C3A/F2 polarisées. (1) Nous construirons des souches de HEV fluorescentes à partir des plasmides contenant le génome complet d’une souche de HEV3 ou de HEV1. Un tag ARN (aptamère) sera introduit dans la région hypervariable du gène orf1 codant la protéine non structurale. Un tag tétracystéine sera introduit dans la partie C-terminale du gène orf2. (2) Afin de vérifier la fonctionnalité de ces souches, nous déterminerons la concentration et la taille des particules virales obtenues par nanoparticle tracking analysis (NTA, appareil NanoSight). Nous quantifierons l’ARN viral produit en culture par RT-PCR quantitative et nous déterminerons l’infectiosité des particules virales par une méthode de culture en dilution limite permettant de calculer la TCID50 (tissue culture infectious dose 50). (3) En parallèle, une lignée stable des cellules HepG2/C3A/F2 exprimant la protéine LC3B taguée avec une protéine fluorescente sera construite.  (4) Cette lignée sera ensuite infectée avec les souches de HEV fluorescentes produites. Le trafic des marqueurs fluorescents dans les cellules vivantes sera suivi en microscopie confocale rapide (microscope confocal Spinning Disk, disponible sur la plateforme d’imagerie de l’unité). Les images obtenues seront analysées avec les logiciels de traitement d’images QuPath (2D) ou Imaris (3D). (5) Pour valider ces marquages, les cellules seront ensuite fixées et marquées avec des anticorps ciblant les protéines ORF2 et LC3B et analysées en microscopie confocale classique.

Cette étude pourra déboucher sur un projet plus large étendu à l’analyse du trafic viral dans des cellules exprimant d’autres protéines cellulaires fluorescentes. Ceci permettra de mieux comprendre la façon dont le HEV remodèle un ou plusieurs compartiments au bénéfice de sa réplication, de son assemblage et de son bourgeonnement. La comparaison des résultats obtenus pour le HEV1 et le HEV3 permettra de mettre en évidence à terme de nouveaux déterminants de la physiopathologie différente de ces deux génotypes.