Projets et candidats lauréats

Les arbovirus (virus transmis par des arthropodes) infectent plus de 700 millions de personnes chaque année, avec un impact majeur sur la santé publique mondiale. Les moustiques du genre Aedes, notamment Aedes aegypti, sont les principaux vecteurs, capables de transmettre des virus appartenant aux quatre grands taxons d’arbovirus, dont les Flavivirus et Alphavirus.

Le virus Chikungunya (CHIKV), un alphavirus du groupe antigénique Semliki Forest, est l’un des plus répandus et est transmis entre autre par le moustique Aedes aegypti. Un autre membre de ce groupe, le virus O’nyong nyong (ONNV), est unique par sa transmission naturelle via les moustiques Anopheles, en particulier Anopheles gambiae, également vecteur du paludisme. ONNV a été isolé pour la première fois en 1959 en Ouganda, et a longtemps été confondu avec un sous-type de CHIKV en raison de leur forte similarité.

Ces deux virus constituent un modèle pertinent pour étudier la spécificité vectorielle, car leurs vecteurs respectifs appartiennent à des sous-familles ayant divergé il y a environ 170 millions d’années. Cette spécificité soulève des questions clés sur les déterminants moléculaires qui régissent l’adaptation des virus à leurs vecteurs.

Ce projet vise à identifier les mécanismes moléculaires responsables de cette spécificité, notamment les interactions entre les protéines virales et les facteurs hôtes chez les moustiques. L’objectif est de mieux comprendre l’adaptation des virus à de nouveaux vecteurs urbains et ainsi anticiper les risques d’émergences futures.

L’équipe « Mosquito Immune Responses » dispose d’une expertise avérée dans l’étude des interactions vecteur-pathogène, avec des élevages d’Aedes aegypti et Anopheles coluzzii (anciennement An. gambiae), des installations P2/P3, et une expérience en génétique des moustiques.

Les travaux antérieurs ont mis en évidence le rôle de la protéine virale nsP3 dans la spécificité vectorielle. Des virus chimériques montrent que l’échange de nsP3 entre CHIKV et ONNV permet à CHIKV d’infecter partiellement Anopheles. nsP3, essentielle à la réplication virale, interagit avec des protéines hôtes via son domaine hypervariable (HVD) et sa forte variabilité entre alphavirus suggère un rôle clé dans la spécificité vectorielle.

Ce projet de thèse se concentrera donc sur le rôle de nsP3 dans l’infection virale et la spécificité hôte via trois axes expérimentaux complémentaires.

Le virus de l’encéphalite japonaise est un flavivirus émergent transmis par les moustiques et endémique dans 24 pays de la région Asie-Pacifique. Les limites des capacités de diagnostic existantes constituent une menace majeure pour la mise en œuvre des programmes de vaccination et les perspectives de développement de nouvelles thérapies. La méthode de diagnostic standard recommandée, la détection des IgM anti-JEV par ELISA, est peu spécifique, nécessite des infrastructures de laboratoire et il n’existe qu’un seul fabricant commercial. Notre objectif est de développer un nouveau test Luminex pour détecter les IgM anti-JEV avec une spécificité améliorée par rapport au test existant, qui pourrait être déployé dans les laboratoires de référence en Asie. Nous vérifierons également les biomarqueurs diagnostiques des protéines de l’hôte de l’encéphalite japonaise, ce qui ouvrira la voie à des travaux futurs visant à mettre au point un test de diagnostic rapide utilisable dans les zones reculées dépourvues de capacités de diagnostic. Cette recherche offrira une excellente formation doctorale à un chercheur cambodgien dans le domaine des diagnostics standard, complexes et nouveaux.

Le SARS-CoV-2, les virus de la grippe A/B (Influenza) et les virus respiratoires syncytiaux (VRS) sont les principales causes d'hospitalisation pour infection respiratoire aiguë (IRA). La crise du COVID-19 a montré que les outils de surveillance sont essentiels pour suivre la virulence, la transmission et caractériser l'évolution virale des IRA.

Dans ce but, les Centres Nationaux de Référence (CNR) pour les virus respiratoires (Hospices Civils de Lyon et Institut Pasteur Paris) ont développé un projet collaboratif avec les deux principaux réseaux de laboratoires de biologie médicale en France métropolitaine : Cerballiance et Biogroup (Laboratoires RELAB, plus de 1500 laboratoires).

Depuis 2023, tous les échantillons soumis à un test PCR virologique en raison d’une suspicion d’IRA dans les laboratoires RELAB sont analysés avec un test PCR triplex (VRS, Influenza, SARS-CoV-2) et transmis aux CNR. À ce jour, près d’un million de résultats ont déjà été collectés et sont disponibles, correspondant aux saisons 2023-2024 et 2024-2025.

Les tests PCR en communauté sont relativement faciles à développer, évolutifs et rapidement déployables. Cependant, ils sont bruyants et biaisés par nature vis-à-vis de la population testée. Leur utilisation et leur interprétation efficaces nécessitent donc une modélisation mathématique et statistique rigoureuse, ce que notre approche vise à développer et évaluer.

Ceci fournira ainsi à la communauté épidémiologique et de modélisation un nouvel outil analytique applicable aux IRA actuelles, mais aussi potentiellement aux futures épidémies émergentes, pour étudier les facteurs virologiques qui influencent la dynamique et la transmission des agents pathogènes dans la communauté générale.

Le virus Zika (ZIKV), un arbovirus transmis par les moustiques, constitue un enjeu majeur de santé publique, en particulier à cause de sa transmission materno-fœtale pendant la grossesse et de son association avec de graves malformations congénitales chez les nouveau-nés. Les trophoblastes du placenta présentent des caractéristiques immunologiques uniques, notamment la production constitutive d'interférons de type III et l'expression exclusive d'un cluster de microARNs, appelé C19MC, situé sur le chromosome 19.

Ce projet vise à élucider le rôle de la voie de l’interférence à ARN (ARNi) et de la voie des microARNs (miARNs) dans la réponse antivirale des trophoblastes humains à l’infection par ZIKV. Une attention particulière sera portée sur les protéines clés Dicer et Drosha, ainsi que sur le cluster C19MC spécifique du placenta. L’expression de Dicer et Drosha sera inhibée par transfection de siRNA ou par inactivation via la technologie CRISPR-Cas9 dans des cellules de choriocarcinome (cellules JAR) ou des cellules souches trophoblastiques (TBS). La réplication du ZIKV sera analysée dans ces lignées cellulaires afin de déterminer la contribution fonctionnelle de ces composants de l'ARNi. Le rôle du cluster C19MC sera exploré à l'aide d'une lignée JAR dans laquelle le locus C19MC a été délété par la technologie CRISPR-Cas9. L'impact de la perte de C19MC sur la réplication du ZIKV sera étudié, pour déterminer le rôle de ces microARNs spécifiques du placenta dans la défense antivirale.

Pour déterminer la contribution de la voie ARNi, un séquençage des petits ARN sera réalisé sur l'ARN total et sur les ARN immunoprécipités via l'anticorps AGO2 afin de détecter des petits ARNs interférents dirigés contre l’ARN viral (vsiARNs). L’activité fonctionnelle de ces vsiARNs sera validée à l’aide d’un plasmide rapporteur fluorescent contenant des séquences virales. Parallèlement, les profils d’expression des miARNs seront analysés pour déterminer si l'infection par ZIKV modifie certains sous-ensembles spécifiques de miARNs.

De plus, un séquençage de l'ARN (RNA-seq) permettra d’identifier les gènes dérégulés lors de l'infection par ZIKV. L'analyse croisée des données de miARNs et d’ARNm permettra d’identifier des gènes cibles potentiels des miARNs régulés. L’étude des réseaux de gènes et des voies cellulaires dérégulés lors de l'infection permettra d’identifier de nouveaux gènes candidats. Leur importance fonctionnelle sera confirmée par des expériences d’extinction génique en utilisant des siRNA. Un autre objectif du projet sera d'identifier les protéines cellulaires associées à l'ARN de ZIKV en utilisant deux approches protéomiques complémentaires : l’immunoprécipitation avec l'anticorps spécifique des ARN double brin (J2) et la technique ChIRP-MS, qui consiste en une capture de l'ARN viral par des sondes antisens biotinylées suivie d'une identification des protéines par spectrométrie de masse. La présence de Dicer, Drosha et de protéines connues liant l'ARN double brin (ex : TRBP, PACT, PKR) sera vérifiée par western blot. Les protéines immunoprécipitées seront identifiées par spectrométrie de masse. Ces expériences permettront de confirmer des facteurs connus et révéler de nouvelles interactions susceptibles de participer à la réponse antivirale.

Ce projet permettra de clarifier le rôle de la machinerie ARNi et des microARNs du placenta dans la défense des trophoblastes contre le ZIKV et d’identifier de nouveaux facteurs cellulaires interagissant avec l’ARN viral, ouvrant ainsi la voie à de nouvelles stratégies antivirales.

Contexte: Les orthoflavivirus WNV et TBEV connaissent une expansion rapide en raison du changement climatique, représentant une menace majeure pour la santé publique. Bien qu'elles soient souvent asymptomatiques, ces infections peuvent entraîner des pathologies graves, voire fatales. La dernière épidémie de ZIKV a révélé que le tractus génital masculin (TGM) peut agir comme un réservoir viral, permettant une persistance à long terme et des voies de transmission non canoniques qui contribuent à la dynamique épidémique et aux complications congénitales. L’équipe d’accueil a démontré que le ZIKV se réplique dans le testicule humain ex vivo et a identifié les cellules germinales comme étant les principales cellules réservoirs dans le sperme des hommes infectés. Une question critique est de savoir si d'autres orthoflavivirus émergents partagent la capacité du ZIKV à se répliquer de manière persistante dans le testicule, lequel agit à la fois comme un site immunoprivilégié et un sanctuaire pharmacologique. Des données récentes suggèrent que WNV et TBEV pourraient également présenter un tropisme testiculaire. Identifier les réservoirs viraux dans le TGM est primordial pour anticiper des voies de transmission alternatives et garantir la sécurité du don de gamètes et de l'Assistance Médicale à la Procréation. À ce jour, il n'existe aucune stratégie thérapeutique capable d'éliminer les populations virales au sein de ces sanctuaires. Il est donc urgent de développer des modèles prédictifs de persistance virale ainsi que des antiviraux innovants capables d'éliminer ces réservoirs tout en préservant la santé reproductive.

Objectifs : Ce projet propose une stratégie expérimentale intégrée combinant deux modèles humains uniques:

• Culture organotypique ex vivo : ce modèle de culture à court terme (10 jours) a été précédemment validé pour sa pertinence à inférer le tropisme in vivo d'une large gamme de virus.
• Plateforme microfluidique « Testicule-sur-puce » : cette plateforme innovante sera optimisée pour maintenir le tissu jusqu'à 30 jours afin d'étudier la persistance virale à long terme dans un environnement physiologiquement pertinent.

À l'aide de ces modèles complémentaires, ce projet poursuit trois objectifs principaux :

1. Déterminer si le TBEV se réplique dans le testicule humain ex vivo, identifier ses cibles cellulaires et l'impact sur la viabilité et les fonctions des cellules testiculaires.
2. Valider le système de testicule-sur-puce comme plateforme prédictive d'infection persistante en comparant la dynamique de réplication à long terme du WNV et du ZIKV.
3. Évaluer l'efficacité antivirale de nouveaux composés, conçus pour franchir la barrière hémato-testiculaire.

Résultats préliminaires : Les données de l'équipe démontrent que le WNV se réplique efficacement dans le testicule humain ex vivo et le testicule de souris in vivo, ciblant les cellules germinales de manière similaire au ZIKV. Les premiers résultats du modèle de testicule-sur-puce montrent le maintien de la viabilité tissulaire sur 20 jours et une réplication soutenue du ZIKV, soulignant son potentiel pour des études de longue durée.

Méthodes : Ce projet combine des biosystèmes originaux à une gamme d’approches de virologie et de biologie cellulaire et moléculaire. La réplication virale sera quantifiée par RT-qPCR et essais d'infectiosité ; les cibles cellulaires et les réponses immunitaires innées seront caractérisées par imagerie haute résolution et transcriptomique. L'efficacité antivirale sera évaluée sur des modèles humains de complexité croissante.

Résultats attendus : En utilisant des méthodes de substitution (NAMs), nous déterminerons si le WNV et le TBEV ont la capacité de former des réservoirs testiculaires persistants et établirons une plateforme pertinente pour l'étude des sanctuaires viraux. En développant des modèles expérimentaux prédictifs et en validant une stratégie antivirale de preuve de concept, ce travail de thèse vise à renforcer la préparation face aux menaces émergentes. Enfin, ces résultats seront déterminants pour garantir la sécurité de la médecine de la reproduction et la protection de la santé fœtale.

Le virus de la fièvre hémorragique de Crimée-Congo (CCHFV) est un agent pathogène émergent provoquant une maladie hémorragique chez l’homme tout en étant asymptomatique chez les hôtes non humains tels que les bovins.

En raison de l’expansion des tiques vecteurs, CCHFV devient de plus en plus menaçant en Europe. La transmission humaine peut se produire par piqûre de tique mais également par contact avec des liquides infectés. À cet égard, l’infection par le CCHFV par contact avec des fluides animaux est difficile à prévenir car les animaux ne développent aucun symptôme et présente donc un risque élevé, en particulier pour les vétérinaires et les travailleurs des abattoirs. Dans ce contexte, le projet DETERMINE vise à mieux comprendre les déterminants de la transmission du bovin à l’homme en combinant recherche fondamentale et échantillonnage sur le terrain.

Dans un premier temps, différents tissus, fluides et tiques seront prélevés sur des bovins dans des abattoirs au Cameroun, où la prévalence de CCHFV chez les bovins est très élevée. Tous ces échantillons serviront à la détection du génome viral, visant à cartographier les facteurs influençant la circulation du virus mais aussi le risque pour les travailleurs des abattoirs et les matières les plus dangereuses. Nous déterminerons également la séquence du virus circulant dans le but de déterminer les résidus viraux qui pourraient favoriser la transmission à l’homme.

Deuxièmement, nous déterminerons et caractériserons les facteurs cellulaires moléculaires qui pourraient contribuer au contrôle de la transmission du bovin à l’homme, en mettant un accent particulier sur la réponse cellulaire via les gènes stimulés par l’interféron (ISG) et sur l’entrée avec les récepteurs cellulaires. Plus particulièrement, nous identifierons les ISG bovins avec des rôles pro- et antiviraux, étudierons leur mode d’action et, en comparant le rôle des ISG humains et bovins, déterminerons les déterminants moléculaires régulant la réponse à l’infection par CCHFV via les ISG. Concernant l’entrée cellulaire, nous comparerons la voie d’entrée des particules produites dans les tiques, les cellules bovines et humaines dans différentes cellules bovines ou humaines afin de déterminer l’interaction entre la transmission et les caractéristiques moléculaires des particules. Ayant déjà identifié des facteurs d’entrée dans les cellules humaines, nous déterminerons le récepteur dans les cellules bovines et enfin identifierons les déterminants moléculaires contrôlant l’utilisation des récepteurs humains versus bovins.

Nous pensons qu’en découvrant les déterminants fondamentaux, moléculaires et cellulaires, de l’infection inter-espèces par CCHFV, le projet DETERMINE aidera d’une part à anticiper l’émergence du CCHFV mais également à stimuler la recherche translationnelle et l’innovation telle que l’identification de cibles thérapeutiques, d’outils de diagnostic ou encore le développement de programmes de surveillance et des lignes directrices.

Les virus à génome non-segmenté de polarité négative appartiennent à l’ordre des Mononegavirales, dans lequel on retrouve de nombreux pathogènes humains tels que le virus de la rougeole et le virus respiratoire syncytial mais aussi des virus zoonotiques émergents comme le virus Ebola et le virus Nipah (NiV). Ce dernier est naturellement hébergé par des chauve-souris frugivores mais peut également infecter l’Homme chez qui il cause des encéphalites et des détresses respiratoires sévères menant à la mort dans environ 70 % des cas. Identifié pour la première fois lors d'une épidémie en Malaisie en 1998, depuis 2001, NiV est responsable d'épidémies régulières en Inde et au Bangladesh. Parce qu’il peut se transmettre d’homme à homme et qu’il n’y a pas de traitement approuvé, NiV est classé parmi les priorités de l’OMS.

Tous les mononegavirus transcrivent et répliquent leur génome en utilisant des mécanismes moléculaires viraux essentiels et conservés. Le complexe polymérase utilise comme matrice un génome viral entièrement enchâssé dans une gaine de nucléoprotéines appelée nucléocapside. Bien que des structures de nucléocapsides et de complexes polymérase isolés aient été obtenues, de nombreuses interrogations subsistent concernant l’interaction entre ces complexes et comment le complexe polymérase transcrit et réplique le génome. Comment le complexe polymérase accède-t-il à l’ARN génomique encapsidé ? Comment la nucléocapside influence-t-elle son activité ? Et comment les étapes de coiffage et de polyadénylation des ARNm viraux sont-elles régulées ?

L’objectif principal du projet est de résoudre la structure du complexe polymérase de NiV en train de synthétiser de l’ARN sur une nucléocapside, en utilisant la cryo-microscopie électronique (cryo-EM). Pour y parvenir, des complexes polymérase purifiés seront incubés avec de petites nucléocapsides assemblées in vitro dans des conditions nécessaires et suffisantres pour initier la synthèse d'ARN. Pour ce faire, trois étapes majeures sont prévues : (1) l’assemblage in vitro de nucléocapsides fonctionnelles à partir de protéines purifiées (première année du doctorat); (2) la mise au point d’un essai de transcription in vitro permettant de visualiser l’activité du complexe (deuxième année du doctorat); et (3) l’analyse structurale par cryo-EM et reconstruction 3D des complexes actifs (dernière année du doctorat).

Les résultats attendus incluent la première structure d’un complexe polymérase de mononegavirus actif sur une nucléocapside, révélant des mécanismes inédits de régulation de la transcription, ainsi que l’identification de nouvelles cibles antivirales. Les résultats de ce projet auront un impact majeur sur la compréhension de NiV en particulier et des mononegavirus en général, et le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques.

Les Phenuiviridae constituent une vaste famille de virus à ARN transmis par des arthropodes hématophages et maintenus dans des cycles de transmission complexes impliquant des vecteurs, des réservoirs animaux et l’être humain. Ils se situent ainsi à l’interface de la santé humaine, animale et environnementale. Les changements environnementaux et climatiques en cours favorisent l’expansion des vecteurs arthropodes, augmentant le risque d’émergence ou de réémergence de plusieurs phenuivirus dans de nouvelles régions géographiques. Comprendre les mécanismes qui déterminent le potentiel pathogène de ces arbovirus constitue donc un enjeu majeur pour la préparation face aux maladies infectieuses, dans une perspective One Health.

Plusieurs membres de cette famille représentent des menaces importantes pour la santé publique et la santé animale. Le virus Toscana (TOSV), transmis par les phlébotomes, est l’une des principales causes de méningite et de méningo-encéphalite virales dans le bassin méditerranéen. Le virus de la fièvre de la Vallée du Rift (RVFV), transmis par les moustiques, provoque des formes graves chez l’homme et le bétail et est régulièrement responsable d’épidémies importantes en Afrique, avec des conséquences sanitaires et économiques majeures. À l’inverse, le virus Uukuniemi (UUKV), transmis par les tiques, n’est pas associé à des maladies chez l’être humain. Ces virus constituent ainsi un cadre comparatif particulièrement pertinent pour étudier les déterminants moléculaires qui distinguent les arbovirus hautement pathogènes de virus apparentés présentant une faible, voire aucune, pathogénicité chez l’homme.

Malgré leur proximité génétique, ces phenuivirus présentent des profils pathogènes très différents chez les hôtes vertébrés, allant d’infections asymptomatiques à des maladies neurologiques ou hémorragiques sévères. Les mécanismes moléculaires à l’origine de ces différences restent encore largement méconnus. La protéine non structurale NSs est considérée comme un facteur majeur de virulence chez plusieurs phenuivirus et joue un rôle central dans l’inhibition des réponses antivirales de l’hôte. Toutefois, la diversité des fonctions de NSs selon les virus, ainsi que son rôle dans la dissémination virale et le tropisme tissulaire, restent encore peu explorés.

Ce projet de thèse vise à décrypter comment les protéines NSs de trois phenuivirus représentatifs, UUKV, TOSV et RVFV, modulent les réponses antivirales des cellules hôtes et influencent la réplication et la propagation virales. En combinant génétique inverse, virologie moléculaire, biologie cellulaire et approches d’imagerie avancées, le projet comparera des virus sauvages, des virus dépourvus de NSs et des virus chimères afin d’identifier les fonctions spécifiques ou conservées de cette protéine. Les principaux résultats seront ensuite validés dans des modèles cellulaires physiologiquement pertinents.

En exploitant la diversité naturelle des protéines NSs parmi des arbovirus présentant des potentiels pathogènes différents, cette approche comparative permettra d’apporter de nouveaux éclairages sur les déterminants moléculaires de la pathogénicité des arbovirus. À terme, ces travaux contribueront à une meilleure compréhension des mécanismes favorisant l’émergence de virus transmis par les vecteurs et pourraient permettre d’identifier des voies cellulaires à cibler pour le développement futur de stratégies antivirales.

Les virus émergents représentent une menace croissante pour la santé mondiale, notamment dans les régions où les interfaces homme-animal se développent. Les pteropine orthoreovirus (PRVs) sont des orthoreovirus transmis par les chauves-souris, principalement en Asie du Sud-Est, qui infectent couramment les humains et peuvent provoquer des infections respiratoires aiguës. Les PRV sont des virus à ARN double-brin appartenant à la famille des Reoviridae, et plusieurs souches ont été isolées chez des chauves-souris frugivores, des singes ou des humains. Une caractéristique clé des PRVs est leur nature fusogénique : leur infection est associée à de la fusion cellule-cellule, qui semble contribuer à la dissémination virale, à l'évasion du système immunitaire et à la pathogénicité. Contrairement aux virus enveloppés, les PRVs induisent la fusion cellulaire par l'intermédiaire d'une protéine de fusion non-structurale, appelée FAST (Fusion Associated Small Transmembrane). Ce fusogène est structurellement et évolutivement distinct de tout autre fusogène viral ou eucaryote connu. Les protéines FAST sont des facteurs de virulence importants pour les PRVs et récemment, des protéines similaires à FAST ont été détectées dans plusieurs rotavirus et coronavirus animaux, préoccupant concernant la possibilité d’émergence d'un coronavirus codant une protéine FAST.

Cependant, la réponse immunitaire contre les PRVs et les protéines FAST reste largement inconnue. Ce projet vise à étudier deux objectifs spécifiques : la régulation de la fusion FAST médié des PRV par les gènes stimulés par l'interféron (ISG), et par la réponse humorale.

Il abordera ces questions en combinant de l'imagerie quantitative à haute débit avec un crible de gènes stimulés par l'interféron, afin d'identifier de nouveaux facteurs hôtes impliqués dans la restriction de la fusion des PRVs et de FAST. De plus, la réponse anticorps chez les patients sera étudiée en utilisant le sérum de cohortes Cambodgiennes préalablement sélectionnées. Ainsi, ce projet apportera de nouvelles connaissances fondamentales et appliquées sur la restriction virale par les ISGs et la réponse humorale, ce qui pourrait mener à l'identification de nouvelles cibles antivirales et contribuer au développement de stratégies thérapeutiques contre les émergences virales futures.