Projets et candidats lauréats

Les protéines transmembranaires induites par l’interféron (IFITM) sont une famille de facteurs de restriction dotés d’une activité antivirale à large spectre. Les IFITM ont été associés à deux effets antiviraux : la séquestration des virions entrants dans les endosomes (protection des cellules cibles) et plus récemment la production de particules virales moins infectieuses (effet négatif sur l’infectivité des virions néo-produits). Dans les deux cas, les IFITM agissent selon un mécanisme/s inconnus sur la capacité de fusion entre membranes virales et cellulaires.

Avec le soutien de l’ANRS, notre laboratoire a d’abord révélé l’existence de la deuxième propriété antivirale des IFITM dans le cas du VIH-1, puis a procédé à sa caractérisation selon des orientations que nous présentons et que nous proposons de poursuivre ici. En examinant les protéines IFITM issues de différentes espèces animales, les données que nous avons recueillies montrent une grande hétérogénéité quant à leur capacité à diminuer l’infectivité des particules du VIH, une capacité qui peut sous-tendre une régulation spécifique de l’espèce et qui peut représenter une nouvelle couche de régulation de leurs activités que nous proposons de caractériser davantage.

Dans un but plus mécanistique, des données de notre laboratoire nous ont aussi permis de déconnecter l’incorporation physique des IFITM dans les particules virales de leur effet antiviral, appuyant un modèle selon lequel les IFITM modifient de façon irréversible un composant cellulaire inconnu incorporé dans les particules virales et responsable du phénotype. Ceci nous a conduit à une analyse omiquedes virions-IFITM3. Ainsi, nous avons non seulement identifié un nouveau régulateur potentiel d’IFITM3, mais nous avons également identifié des protéines et des phospholipides spécifiquement enrichis dans des virions-IFITM3 pouvant potentiellement expliquer le défaut d’infectivité. Enfin, en collaboration avec le laboratoire du Dr Muriaux / Favard (IRIM, Montpellier), nous avons utilisé la microscopie à force atomique (AFM) / Nanoindentation sur des virus réplicatifs. Les résultats obtenus jusqu’à présent indiquent des modifications de l’élasticité des virus IFITM3. Ce résultat représente d’une part la première mesure mécanique des différences entre virions sauvages et IFITM3 et d’autre part conforte l’usage de cet outil précieux pour nos analyses futures.

Sur la base de ces résultats non publiés, notre projet vise à approfondir notre compréhension de l’action antivirale des IFITM contre le VIH et plus spécifiquement leur régulation spécifique de l’espèce, le rôle d’un cofacteur que nous avons identifié ainsi que leur mécanisme d’action.

Ces dernières années d’immenses progrès ont été réalisés dans notre compréhension de l’assemblage intracellulaire et du bourgeonnement du VIH-1 grâce aux avancées de la microscopie. Cependant, l’étape cruciale de libération des virions reste peu étudiée car elle ne peut être caractérisée par la seule microscopie. En conséquence, les données disponibles dans la littérature sur la libération des virions restent très approximatives car réalisées avec des populations de cellules dont les cinétiques de réplication du VIH-1 sont très hétérogènes. Notre objectif est d’apporter à la virologie conventionnelle la puissance des stratégies de nano/micro-fluidique (« viro-fluidique ») pour étudier la dynamique du relargage du VIH-1 à l’échelle de la cellule unique. Ce projet technologiquement ambitieux est porté par un consortium interdisciplinaire, composé de 4 équipes aux compétences reconnues et complémentaires en microfluidique, nanotechnologies, rétrovirologie et microscopie de molécules uniques.

Nous développerons un système microfluidique original qui permettra de mesurer en temps réel la libération des virus par des cellules individuelles. Cette puce microfluidique va devoir opérer plusieurs fonctions:

– Piégeage : Le circuit microfluidique thermostaté à 37°c va comporter une cale pour piéger une cellule unique dans un flux continu de milieu de culture, sans l’endommager. Le piège cellulaire doit immobiliser la cellule dans un écoulement mais permettre le relargage des virions. Plusieurs géométries ont d’ores et déjà été validées pour différents types cellulaires.

– Unicité : le circuit doit garantir par son design qu’une seule cellule soit piégée et perfusée, alors que l’ensemencement est opéré à partir d’une solution diluée de cellules. Un système à plusieurs entrées/sorties contrôlé par des valves pneumatiques sera utilisé pour garantir que le milieu collecté ne provienne que de la perfusion d’une cellule unique.

– Détection : En aval du piège, le circuit recevra des systèmes de quantification des virions fluorescents utilisant soit un comptage optique par caméra rapide soit par spectroscopie de corrélation de fluorescence (détection ponctuelle dans un faisceau laser). Pour les virions non-fluorescents nous utiliserons une technique de comptage par nanopore unique de type « track etched » intégré dans le système microfluidique.

            La puce sera installée sur le statif d’un microscope inversé à fluorescence pendant toute la durée de l’expérience. Cette dernière sera stoppée à la mort cellulaire observée par coloration au DAPI présent dans le milieu de perfusion. Nous étudierons les cellules modèles HeLa exprimant un VIH-1-GFP non-infectieux (∆env) et déterminerons pour la première fois la fréquence, la cinétique, la durée de la libération des virions et la quantité de virions produits par cellule. Cette étude permettra d’appréhender l’hétérogénéité de production entre cellules issues d’une même population. Puis, nous étendrons cette étude à plusieurs types cellulaires afin de faire état du degré de variation d’un type cellulaire à l’autre. Cette étude de la vitesse de libération des virus en fonction du temps de viabilité cellulaire nous permettra de mieux comprendre les stratégies adaptatives de production du VIH-1 à son hôte. Par ailleurs, nous ferons varier plusieurs paramètres physiques comme la vitesse du flux microfluidique, la tension membranaire, ou encore biochimiques en induisant l’activation des cellules (TNFalpha, LPS) afin d’appréhender la mécanistique de la libération des virions. A ce jour, toutes ces données ne sont pas connues car inaccessibles par l’utilisation d’approches conventionnelles.

            Les applications de la viro-fluidique sont nombreuses. Elle pourra être utilisée pour étudier ou découvrir des facteurs cellulaires ou viraux impliqués dans la libération des virus. Elle pourra également faciliter l’étude des mécanismes de réactivation de la production virale dans les cas de latence. De manière plus générale, les outils de viro-fluidique développés ici, aussi bien pour la capture cellulaire que pour la quantification des virus en flux, seront transposables à d’autres pathogènes.

La protéine TRBP est une protéine impliquée dans divers mécanismes biologiques, tels que la réplication du virus HIV, ou en tant que co-facteur de la protéine Dicer, une RNase cytoplasmique de type III impliquée dans l’une des étapes de maturation des miARNs. Au cours de l’infection cellulaire par le virus HIV, TRBP favorise notamment la propagation virale en bloquant le caractère inhibiteur de l’ARN TAR viral sur la traduction des protéines virales, ou encore en interagissant directement avec les protéines PACT ou PKR, deux facteurs favorisant la multiplication du virus. Récemment, nous avons mis en évidence au laboratoire une interaction inédite entre la protéine TRBP d’une part, et la protéine RPAP3 d’autre part, qui appartient au complexe d’assemblage R2TP. Ce complexe multiprotéique joue le rôle de chaperon pour l’assemblage de diverses particules ribonucléoprotéiques, telles que les petites particules nucléolaires ou l’ARN polymérase II. Son implication et son rôle au cours du cycle viral du HIV ou de la maturation des miARNs n’a toutefois jamais été décrite. Notre mise en évidence d’une interaction directe entre la protéine TRBP et la protéine RPAP3 nous permet de proposer ce projet dans lequel nous tenterons de déterminer quels sont les fonctions possibles de la protéine RPAP3 et du complexe R2TP, en connexion avec TRBP, dans la réplication du virus.

La crise sanitaire du Covid 19 a mis en lumière un manque d’outillage méthodologique pour caractériser les inégalités intersectionnelles de santé en France de manière compréhensive. En effet, les personnes nées en Afrique dite « subsaharienne » ou « hors-Maghreb » ont subi une surmortalité criante sur tout le territoire, tandis que les chiffres pour les immigré·es européen·nes étaient équivalents à la moyenne des personnes nées en France. En même temps, des disparités importantes ont été observées parmi la population native en fonction du département de résidence, la Seine-St-Denis étant le plus touché.

Similairement, cette vulnérabilité différentielle à la maladie de certaines populations noires a été identifiée pour le VIH et le sida depuis plusieurs décennies. Ces sur-incidences ne peuvent uniquement être réduites à une importation des pays du Sud, des travaux récents soulignant la proportion importante de contaminations au VIH d’immigré·es d’Afrique subsaharienne pendant leur processus d’arrivée et d’installation en France, marqué par une insécurité juridique, économique et résidentielle. Il est donc pertinent de considérer l’existence de facteurs de défavorisation sanitaire transcendant les catégories d’analyses usuelles.

À travers une enquête qualitative, nous cherchons à dénaturaliser et matérialiser la proximité au VIH d’une minorité historiquement associée à la syndémie de sida, les personnes noires en France. Dans une perspective sociologique, nous considérons les noir·es comme un groupe social, une structure sérielle de positions d’infériorité. Nous décrivons donc la fabrique micro-, méso-, et macrosociale de la minoration raciale de manière intersectionnelle, comme un construit historique et politique structurant les rapports sociaux, aux conséquences manifestes sur les conditions matérielles d’existence, la surexposition aux risques et l’accès aux soins.

La Guyane française, département et région d’outre-mer situé sur le continent sud-américain et recouvert à 97 % de forêt amazonienne, est un vaste territoire, vulnérable et hétérogène où 53 % de sa population, qui se concentre sur le littoral atlantique, vit sous le seuil de pauvreté. Dans les communes les plus isolées de Guyane, communément regroupées sous le terme « Guyane intérieure », vivent environ 50 000 personnes d’origine diverse, en majorité amérindiennes, bushinenguées et créoles, dans des villages ou petites villes le long des fleuves Maroni et Oyapock et au cœur de la forêt (Saül). Dans ces zones isolées géographiquement et uniquement accessible par voie fluviale et aérienne, les indicateurs socio-économiques sont plus dégradés que dans le reste de la région et des problèmes de santé publique spécifique ont été identifiés (exposition au métaux lourds, santé mentale chez les jeunes, conduites addictives, augmentation des maladies chroniques, santé sexuelle et reproductive, prévalence élevée d’infections par le VIH, les hépatites virale et les IST, nutrition et sécurité alimentaire, couverture vaccinale).

Pour plusieurs raisons (offre de soins uniquement primaire dispensée par des dispensaires, mauvaise couverture sociale, coût et complexité logistique de déployer une enquête spécifique), les sources de données habituellement exploitées par Santé publique France pour décrire l’état de santé des populations ne couvrent pas les populations vivant dans les zones isolées. Les données de la recherche n’apportent que des informations partielles (sujets spécifiques et zone géographique limitée) et certains sujets prioritaires demeurent non explorés en population générale.

En réponse à ce manque de données, Santé publique France a conçu une méthode, originale et adaptée au terrain, d’enquête transversale multithématique en population générale avec administration de questionnaire en face à face par un médiateur en santé issu de la communauté et formé au métier d’enquêteur et la réalisation de prélèvements biologiques par un infirmier. Sept mois de terrain sont prévus pour recueillir les données sur un échantillon représentatif de 3000 personnes volontaires. Une restitution des résultats individuels et collectifs sera organisée.

Ce projet d’enquête s’inscrit dans une démarche participative, tenant compte des besoins de la population, et repose sur un partenariat logistique et scientifique avec le Centre Hospitalier de Cayenne, auquel sont rattachés tous les dispensaires présents dans les zones isolées ainsi que l’unité Inserm-CIC1424.

L’hépatite C chronique conduit au développement d’une stéatose, une accumulation anormale de gouttelettes lipidiques (GL) dans les hépatocytes, et à long terme une cirrhose et un carcinome hépatocellulaire (CHC). La diversité génétique du virus de l’hépatite C (VHC) est importante, avec 8 génotypes et ≥ 90 sous-types. Des études cliniques ont montré que les infections par le VHC de génotype 3 sont associées à une prévalence et une sévérité accrues de stéatose, ainsi qu’une progression plus rapide vers la fibrose. De plus, le VHC exploite le métabolisme lipidique de la cellule pour son cycle viral, notamment pour l’assemblage des particules lipovirales, une caractéristique qui contribue probablement aux désordres métaboliques associés à l’infection par le VHC (stéatose, insulino-résistance, diabète de type 2). Ces observations, ainsi que des modèles cellulaires d’expression transitoire ou de souris transgéniques suggèrent un possible rôle direct de la protéine de capside (ou core) du VHC dans la progression des atteintes hépatocytaires. Cependant, il reste à déterminer si les dérégulations observées ont également lieu dans des modèles pertinents d’infection et s’il existe des dérégulations exacerbées ou spécifiques selon l’origine génotypique de la protéine core.  

L’objectif général de ce projet est de mieux comprendre les mécanismes qui gouvernent le rôle de la protéine core dans la dérégulation de (i) la biosynthèse des GL, (ii) le métabolisme lipidique et glucidique hépatocytaire, et (iii) les signalisations reliées à la progression vers le CHC, et l’importance de la séquence de core.

Ce projet entre dans le cadre des objectifs de l’AC42. Les trois équipes impliquées, A. Martin (Institut Pasteur, Paris), P. Chouteau & P. Roingeard (INSERM U966, Tours), et E. Herker (Philipps University Marburg, Germany) ont obtenu de nombreux résultats préliminaires et possèdent une expertise reconnue et pertinente pour la réalisation des objectifs du projet.

Objectifs spécifiques et méthodes:

Nous utiliserons des virus recombinants intergénotypiques exprimant les protéines core de différents génotypes isolés de patients présentant une diversité de tableaux cliniques, afin de mener les études suivantes :

• Analyser comparativement l’effet de ces virus recombinants sur la biogenèse des GL dans des cellules Huh7.5 infectées, mais aussi dans des cultures de cellules Huh7.5 différentiées et maintenues en conditions hypoxiques, un système qui reproduit mieux les conditions de l’infection dans le microenvironnement du foie humain,
• Caractériser comparativement les profils de lipides et de protéines associés aux GL extraites de cellules infectées par les divers virus recombinants dont les séquences core ont été associées à des degrés variés de stéatose,
• Identifier les signalisations hépatocytaires et les régulations métaboliques qui seraient différentiellement affectées par les variants de core, en utilisant des cribles transcriptomiques à haut débit.

Résultats attendus:

Nous attendons de ces études qu’elles permettent d’identifier des fonctions biologiques ou des gènes spécifiquement dérégulés, ou encore des caractéristiques spécifiques de taille et de composition des GL selon des séquences de core exprimées par les virus. En croisant ces résultats avec ceux d’études interactomiques en cours (hors présent projet) et visant à identifier des partenaires hépatocytaires spécifiques de protéines core de certains génotypes / souches, nous espérons mieux comprendre les mécanismes de dérégulation hépatocytaire induits par core qui expliqueraient les évolutions pathologiques spécifiques. Globalement, ces travaux contribueront à établir une cartographie des risques permettant d’anticiper l’évolution des atteintes hépatocytaires chez les patients.

De plus, l’hépatite C chronique présentant des caractéristiques communes avec la stéatose hépatique non alcoolique (NAFLD), nos résultats renseigneront non seulement sur les mécanismes associés à la sévérité des infections à VHC de génotype 3, mais pourraient également éclairer les mécanismes associés à la NAFLD, une maladie dont la prépondérance s’accroit à l’échelle mondiale.