Projets et candidats lauréats

La tuberculose (TB) demeure l’une des maladies infectieuses les plus meurtrières au monde, responsable de plus d’un million de décès chaque année. Malgré d’importants efforts de contrôle, l’émergence de souches multirésistantes (MDR-TB) et ultrarésistantes (XDR-TB) représente toujours une menace majeure pour la santé publique. L’agent pathogène responsable, Mycobacterium tuberculosis (Mtb), a développé des mécanismes sophistiqués lui permettant de persister dans l’hôte, d’échapper aux réponses immunitaires et de résister aux traitements antibiotiques.

L’éthionamide est une prodrogue nécessitant une activation enzymatique par la bactérie pour exercer son effet bactéricide. L’enzyme EthA, principalement responsable de cette activation, est étroitement régulée par le répresseur transcriptionnel EthR. Un aspect notable est que l’opéron mymA, impliqué dans le métabolisme lipidique et la réponse au stress, est également associé à l’activation de l’éthionamide. Des études récentes ont identifié le répresseur transcriptionnel VirS comme un régulateur clé de l’expression de mymA. L’Alpibectir, premier médicament approuvé ciblant un régulateur transcriptionnel bactérien, inhibe VirS, modulant ainsi la sensibilité bactérienne aux antibiotiques. Cependant, les mécanismes moléculaires régissant l’interaction de VirS avec l’ADN et son rôle plus large dans la physiologie bactérienne restent mal compris. Ce projet vise à élucider les mécanismes de régulation de VirS, à évaluer son impact sur l’adaptation et la survie de Mtb, et à approfondir notre compréhension du mode d’action de l’Alpibectir.

Nous émettons l’hypothèse que VirS fonctionne à la fois comme un répresseur et un activateur, à l’image d’AraC chez E. coli, et que cette dualité est modulée par phosphorylation et/ou liaison de ligands. Pour tester ces hypothèses, nous proposons : (1) de caractériser le mode de liaison à l’ADN et les états oligomériques de VirS, (2) d’étudier la modulation de son activité par phosphorylation et par interaction avec des effecteurs moléculaires, (3) de résoudre son organisation structurale, (4) d’identifier les signaux environnementaux influençant son activité, et (5) d’examiner l’effet bactériostatique induit par VirS observé chez Mtb.

Pour atteindre ces objectifs, nous adopterons une approche multidisciplinaire combinant des techniques biochimiques, biophysiques, structurales et génétiques. Les propriétés de liaison à l’ADN seront évaluées par électrophorèse de retard sur gel (EMSA), essais de stabilité thermique (TSA) et titrage calorimétrique isotherme (ITC). L’oligomérisation et les changements conformationnels de VirS seront étudiés par diffusion dynamique de la lumière (DLS) et diffusion des rayons X aux petits angles (SAXS). L’organisation structurale de VirS sera déterminée par cryo-microscopie électronique (cryo-EM), offrant une résolution détaillée de ses mécanismes de régulation. Parallèlement, des essais avec rapporteurs géniques et des analyses transcriptomiques permettront d’identifier les signaux environnementaux modulant l’expression de mymA. De plus, un criblage par CRISPR interférence sera utilisé pour identifier les partenaires génétiques impliqués dans l’effet bactériostatique médié par VirS.

Les résultats attendus incluent une compréhension détaillée du mode de régulation de l’opéron mymA par VirS, l’identification des principaux signaux environnementaux modulant son activité, ainsi que la découverte de nouvelles interactions régulatrices chez Mtb. Ces avancées permettront d’affiner notre compréhension du mécanisme d’action de l’Alpibectir dans la réponse au stress bactérien et pourraient révéler de nouvelles cibles moléculaires pour le développement de thérapies anti-tuberculeuses.

Ce projet vise à mieux comprendre les mécanismes qui limitent la réplication du VIH-1 dans les macrophages en présence de la protéine SAMHD1. Il s'agit d'un sujet peu exploré car les études sur les macrophages se concentrent essentiellement sur leur infection, ce qui nécessite des traitements qui inactivent SAMHD1. Les macrophages isolés sont peu permissifs au VIH-1 en raison des faibles concentrations de dNTP, empêchant la réplication du génome viral. Cette barrière métabolique est largement attribuée à l'activité dNTPase de SAMHD1. Cependant, des preuves solides indiquent que la phosphorylation du résidu T592 supprime l'action anti-VIH-1 de SAMHD1 sans affecter son activité dNTPase. Ces observations démontrent que la déplétion des dNTP ne suffit pas à expliquer la fonction antivirale de SAMHD1 et indiquent l'implication de propriétés non-dNTPase mecconues, qui pourraient nécessiter des associations physiques et/ou fonctionnelles avec des partenaires viraux et/ou cellulaires. Nos résultats récents montrent que SAMHD1 interagit avec les capsides du VIH-1 dans les macrophages infectés. Nous émettons donc l'hypothèse que SAMHD1 pourrait interagir avec d'autres facteurs cellulaires liant la capside pour inhiber la réplication du VIH-1 dans les macrophages.

Pour ce projet de recherche, nous avons choisi de nous concentrer sur la protéine Myxovirus resistance 2 (MX2), une guanosine triphosphatase (GTPase) inductible par l'interféron (IFN) qui se lie à la capside du VIH-1 et qui est censée inhiber sa décapsidation et/ou son entrée dans le noyau. Notre choix est basé sur le manque évident de recherche sur le mécanisme antiviral dépendant de la MX2 dans les macrophages. Nous notons également que les études explorant la fonction anti-VIH-1 de SAMHD1 sont menées dans des contextes cellulaires où l'expression de MX2 est faible ou absente. Ainsi ces observations soulignent la nécessité de développer des modèles expérimentaux appropriés où les mécanismes sous-jacents à la coopération SAMHD1-MX2 pour restreindre le VIH-1 peuvent être explorés. Nous avons utilisé la technologie CRISPR/Cas9 pour inactiver l'expression de SAMHD1, de MX2 ou des deux dans la lignée cellulaire THP-1, qui est un modèle bien établi pour étudier la réplication du VIH-1 dans les macrophages humains. Nous combinerons ces nouvelles lignées cellulaires avec des tests biochimiques, d'imagerie et virologiques complémentaires. Nous avons également établi plusieurs collaborations pertinentes avec des groupes de recherche ayant des connaissances et des compétences complémentaires aux nôtres. Notre projet vise à poursuivre 2 objectifs principaux :

Objectif 1. Caractérisation biochimique des interactions impliquant SAMHD1, MX2 et/ou la capside du VIH-1.

1. Etablir si l'interaction entre SAMHD1 et Mx2 est directe et caractériser les propriétés physico-chimiques associées.
2. Cartographier le domaine de liaison SAMHD sur MX2 et étudier l'impact des événements de phosphorylation pour l'interaction SAMHD1-MX2.
3. Étudier les conditions requises pour l'assemblage des complexes contenant SAMHD1, MX2 et/ou la capside du VIH-1.

Objectif 2. Études fonctionnelles visant à décrypter les mécanismes qui sous-tendent l'action anti-VIH-1 coopérative de SAMHD1 et MX2 dans les macrophages.

1. Caractériser comment SAMHD1 et MX2 influencent mutuellement l'expression et la distribution dans les cellules THP-1 de type macrophage.
2. Définir l'endroit où les complexes contenant SAMHD1, MX2 et/ou la capside du VIH-1 s'assemblent dans les cellules THP-1.
3. Déchiffrer la chronologie de l'action antivirale de SAMHD1 et MX2
4. Valider les résultats les plus significatifs dans des macrophages humains primaires.

En apportant de nouvelles connaissances sur les mécanismes qui façonnent la réponse des macrophages à l'infection par le VIH-1, notre étude ouvrira la voie à l'identification de nouvelles cibles antivirales et immunitaires. Ceci est d'un intérêt primordial pour la conception de nouvelles stratégies thérapeutiques visant à éradiquer ou contrôler le virus et à réduire l'activation immunitaire chronique (en ligne avec les objectifs de l'Axe prioritaire 3 de l'ANRS – Guérir le VIH/SIDA).

L'enveloppe lipidique du virus de l'immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1) est obtenue lors du bourgeonnement à partir de la membrane plasmique (MP) des cellules hôtes infectées. La composition lipidique de la membrane virale
diffère de celle de la cellule productrice, étant enrichie de lipides spécifiques tels que la sphingomyéline (SM) et le phosphatidylinositol diphosphate (PI(4,5)P2). Ce résultat suggère que le virus bourgeonne à partir de domaines lipidiques spécifiques de la MP ou que le virus induit la formation de domaines lipidiques spécifiques. De plus en plus de preuves indiquent l'importance de la composition lipidique de la membrane du VIH-1 lors de l'entrée du virus et du
bourgeonnement. Le composant minimal requis pour l'assemblage du VIH-1 au niveau de la MP est la protéine virale Gag, car son expression est suffisante pour favoriser la formation de particules virales portant une enveloppe lipidique dérivée de la MP de la cellule hôte. Le ciblage de Gag vers la MP dépend de lipides chargés négativement, en particulier du phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PI(4,5)P2) ainsi que du Chol.
Dans la PM des cellules de mammifères, les lipides sont distribués de manière asymétrique : PI(4,5)P2, se trouve dans le feuillet interne tandis que SM est principalement situé dans le feuillet externe. Une question majeure dans l'assemblage du VIH-1 est de savoir comment la liaison de Gag au feuillet interne PI(4,5)P2 permet de recruter SM dans le feuillet externe. Récemment, nous avons examiné l'interaction de Gag avec SM et Chol dans la PM de cellules HeLa transfectées par Gag en utilisant des techniques avancées de microscopie quantitative en combinaison avec des sondes spécifiques aux lipides. Nos résultats indiquent une colocalisation transbicouche des domaines riches en Gag et en SM, une restriction induite par Gag de la mobilité des domaines endogènes riches en SM et une réorganisation des domaines riches en SM et en Chol d'une manière dépendante de l'oligomérisation et de la courbure de Gag.
Notre étude suggère que Gag lie, fusionne et réorganise les domaines lipidiques pendant l'assemblage. Dans ce projet, nous examinerons différents modèles qui expliquent l'enrichissement sélectif de SM et de Chol dans le VIH-1.
L'objectif spécifique de ce projet est de répondre aux questions suivantes :
1) La liaison de Gag modifie-t-elle les propriétés physiques des domaines riches en PI(4,5)P2 du feuillet interne, entraînant l'enrichissement de la SM dans le VIH-1 ?
2) La SM à très longue chaîne (C24) est-elle impliquée dans l'enrichissement de la SM dans le VIH-1 ? 

3) Le cholestérol est-il impliqué dans l'enrichissement de la SM dans le VIH-1 ?
4) L'inhibition d'une voie d'endocytose spécifique est-elle impliquée dans l'enrichissement de la SM dans le VIH-1 ?
Pour répondre à ces questions, nous réaliserons une série d'expériences de biologie cellulaire moléculaire et de biophysique en utilisant des techniques de microscopie avancées. Nous espérons que nos résultats révéleront les mécanismes moléculaires de la sélection de la SM du feuillet externe et du Chol par l'assemblage de Gag dans le feuillet interne de la PM. La compréhension du rôle des lipides dans l'assemblage de Gag fournira des informations fondamentales sur l'assemblage du virus VIH-1 pendant le bourgeonnement. Cette étude clarifiera également le rôle des propriétés physiques de la membrane sur le processus de bourgeonnement viral. Sur la base de nos résultats,
nous espérons que ce projet aboutira à la conception d'un nouveau type de médicaments anti-VIH ciblant les domaines lipidiques de l'hôte. La mutagenèse virale rapide et l'émergence de souches résistantes aux médicaments représentent un problème majeur pour l'efficacité et l'utilisation thérapeutique des réactifs antiviraux. Cibler les lipides de l'hôte qui ne sont pas affectés par la mutagenèse virale pourrait représenter une approche unique pour développer de nouveaux médicaments anti-VIH surmontant ces limitations. 

L’infection par le virus de l’immunodéficience humaine (VIH) est un problème de santé publique majeur, touchant près de 40 millions de personnes dans le monde. L’introduction des traitements antirétroviraux (TARV) a largement amélioré le pronostic de l’infection, qui est maintenant une maladie chronique dans les pays ayant accès aux TARV.  

Pourtant, la réplication du VIH reste indétectable chez certaines personnes vivant avec le VIH (PVVIH) appelées « HIV controllers » (HIC), sans TARV.  Leurs lymphocytes T (LT) CD8 et CD4 ainsi que leurs cellules NK possèdent des particularités aidant au contrôle, souvent combinées à certains HLA protecteurs. Les études sur la fraction myéloïde évaluent principalement le rôle des macrophages, des cellules dendritiques et des monocytes. Les polynucléaires neutrophiles (PN) qui représentent la majorité des leucocytes circulants et sont la première barrière immunitaire contre les pathogènes sont moins étudiés. Leur rôle antiviral est encore mal compris : les PN peuvent être bénéfiques à la résolution de l’infection ou délétères pour les tissus de l’hôte, en fonction du virus impliqué. Leur rôle dans la pathophysiologie de l’infection par le VIH reste mal défini. Nous souhaitons évaluer si les PN pourraient contribuer à l’installation et au maintien du contrôle spontané chez les HIC. Nous posons l’hypothèse que les PN de HIC sont moins inflammatoires que les PN de PVVIH sous TARV et que des sous-populations spécifiques de l’infection VIH associées à son contrôle soient identifiables. Les PN de HIC pourraient mettre en place des réponses antimicrobiennes plus efficaces, notamment contre le VIH, que les PN de PVVIH sous TARV. Ils pourraient aussi favoriser la prolifération et l’activation adéquate des LT et ainsi participer à la mise en place de cette réponse particulière caractéristique des LT de HIC.

Le projet vise à comprendre le rôle des PN dans la mise en place et le maintien du contrôle de l’infection par le VIH et plus particulièrement leur contribution au contrôle naturel. Pour répondre à cette question, nous voulons 1) caractériser le phénotype et les fonctions des PN de HIC, 2) évaluer leurs réponses antimicrobiennes face à divers pathogènes dont le VIH ; et 3) comprendre leur rôle immunomodulateur sur les autres cellules du SI et notamment les LT.

L’étude sera réalisée sur des PN du sang collecté chez des personnes présentant différents contextes d’infection : des PVVIH HIC (cohorte ANRS CO21 CODEX), des PVVIH sous TARV contrôlant efficacement le virus (cohorte ANRS CO6 PRIMO) et des personnes séronégatives pour le VIH. Une difficulté inhérente à l’étude des PN est la nécessité de traiter les prélèvements sanguins dans un délai court suivant le prélèvement. L’étude sera donc restreinte aux personnes vivant en Ile de France pour garantir la bonne qualité des analyses. Cette restriction justifie de la durée du projet (36 mois) afin de s’adapter à la réception et aux traitements extemporanés des prélèvements.

Les sous-populations des PN seront caractérisées par cytométrie en flux, transcriptomique et protéomique. Les fonctions classiques des PN (chimiotactisme, production de formes réactives de l’oxygène et de cytokines et chimiokines, formation de « neutrophil extracellular traps ») seront évaluées in vitro. L’originalité du projet repose également sur l’étude de la réponse antimicrobienne via le suivi de la phagocytose et l’activité microbicide des PN sur les bactéries E. coli et S. aureus, la levure C. glabrata et sur le VIH lui-même. Enfin, une autre force de l’étude est d’évaluer le rôle immunomodulateur des PN grâce à un système de co-culture entre PN et LT. Nous étudierons l’influence des PN sur l’activation, la prolifération et la poly-fonctionnalité des LT CD8 et CD4.

En résumé, l’objectif est d’évaluer la contribution des PN à la physiopathologie de l’infection par le VIH par une approche exhaustive de leur activité incluant leurs fonctions classiques, leur rôle antiviral direct et leur rôle immunomodulateur sur les partenaires de la réponse dirigée contre le VIH. L’objectif est d’identifier de nouvelles pistes d’amélioration de la réponse dirigée contre le VIH.

Les travaux de ces dernières années ont permis d’identifier des anticorps neutralisants à large spectre (broadly neutralizing antibodies ou bNAbs) très performants contre un grand nombre d’isolats primaires du VIH-1. Plusieurs essais cliniques ont montré que l’administration de bNAbs anti-VIH-1 réduit la charge virale des sujets virémiques ou retarde le rebond viral après l’interruption du traitement antirétroviral. Lorsqu’ils sont administrés précocement à l’initiation du traitement antirétroviral ou de façon répétée pendant le traitement, des essais récents ont également montré leur potentiel à contrôler de façon prolongée la réplication virale à l’arrêt du traitement, nourrissant ainsi les espoirs de développement de nouvelles thérapies favorisant la rémission.

Le potentiel thérapeutique d’un bNAb dépend de sa capacité neutralisante ainsi que de ses fonctions effectrices, qui nécessitent la reconnaissance de l’antigène. Des études récentes suggèrent que les propriétés fonctionnelles des bNAbs pourraient être améliorées par certains facteurs de restriction induits par les interférons (IFN) de type I. Nous proposons de renforcer ces travaux par une étude systématique de l’impact des facteurs de restriction membranaires IFITM3, SERINC5 et BST-2/Tetherin, ou d’un traitement des cellules infectées par différents sous-types d’IFNa, sur les propriétés neutralisantes des bNAbs ainsi que sur leur capacité à déclencher l’ADCC (cytotoxicité cellulaire dépendante des anticorps), l’ADCP (phagocytose cellulaire dépendante des anticorps) et la CDC (cytotoxicité dépendante du complément). Douze bNAbs, reconnaissant les différentes régions conservées du trimère Env, seront sélectionnés parmi les plus performants décrits à ce jour et utilisés ou envisagés pour des essais cliniques chez l’homme. Leurs propriétés fonctionnelles seront étudiées sur différents clones d’Env, issus de souches virales pertinentes telles que les virus transmis fondateur (T/F) ou des souches isolées du réservoir viral.

Ces travaux visent à déterminer dans quelle mesure il est possible d’améliorer l’efficacité fonctionnelle des bNAbs en présence d’IFN de type I ou de certains facteurs de restriction. A terme, une meilleure compréhension de la coopération entre les facteurs de restriction et les bNAbs pourraient conduire au développement de stratégies thérapeutiques plus efficaces, renforçant ainsi le potentiel des bNAbs.

Le carcinome hépatocellulaire (CHC) est l’une des principales causes de décès par cancer dans le monde. Malgré les progrès considérables réalisés dans le traitement du CHC par des thérapies ciblées et des immunothérapies combinées, ces traitements ont les bénéfices cliniques limités, voire nuls, chez les patients atteint de CHC à un stade avancé. Ainsi, des approches thérapeutiques innovantes sont nécessaires pour offrir de nouvelles opportunités de traitement aux patients. L'infection par le virus de l'hépatite B (VHB) est le premier facteur de risque de l'hépatocarcinogenèse. Dans le CHC lié au VHB, ∼85 % des tumeurs portent soit de l'ADN viral épisomal, soit des intégrations d'ADN viral dans le génome de l'hôte. Il est désormais reconnu que les antigènes du VHB peuvent être utilisés comme cibles pour une immunothérapie du CHC associé au VHB. Les vecteurs lentiviraux (LV) présentent de nombreux avantages en thérapie génique, vaccination et immunothérapie du cancer car ils sont très immunogènes, non cytopathiques et faiblement inflammatoires. De plus, les versions non intégratives des LV sont sans danger et dépourvues de toute génotoxicité. Nous proposons ici un projet visant à explorer une nouvelle immunothérapie pour le CHC lié au VHB avec des vecteurs anti-VHB basés sur les LV. Nous avons conçu et produit deux vecteurs, à savoir « Lenti-HBc » et « Lenti-HBs », qui codent respectivement pour les protéines de la capside (HBc) et de l’enveloppe (HBs) du VHB. Nos résultats préliminaires montrent que les Lenti-HBc et Lenti-HBs sont hautement immunogènes chez la souris. Comme modèle pour le CHC lié au VHB, des cellules hépatiques murines exprimant individuellement les antigènes HBc et HBs seront utilisées en vue de modéliser des tumeurs sous-cutanées et un CHC orthotopique lié au VHB. Pour étudier les effets antitumoraux de chaque vecteur Lenti-HBV, les souris seront greffées avec ces clones cellulaires murins exprimant les antigènes HBc et HBs, puis immunisées avec les vecteurs Lenti-HBV correspondants. Le potentiel thérapeutique des LV sera évalué par l’inhibition de la croissance tumorale. Afin de mieux caractériser l'immunité antitumorale induite par les Lenti-HBc et Lenti-HBs, l'environnement tumoral immunitaire sera déterminé après l'immunisation par le suivi de l'expansion et du recrutement cellulaire au site tumoral, par l'infiltration de cellules T spécifiques des antigènes HBc et HBs, ainsi que par les changements dans les populations myéloïdes. L’analyse du profil transcriptomique sera réalisée sur les leucocytes infiltrant la tumeur à l'aide du NanoString nCounter Immunology Panel, ce qui fournira des informations sur les modifications transcriptionnelles des cellules immunitaires intra-tumorales en réponse aux Lenti-HBc et Lenti-HBs. Les inhibiteurs de points de contrôle immunitaires sont désormais le traitement standard de première intention pour le CHC. Nous étudierons l'efficacité antitumorale et l'activité immunomodulatrice des Lenti-HBc ou Lenti-HBs combinés à l’inhibiteur anti-PD-1 dans nos modèles expérimentaux pour le CHC. Certains patients atteints de CHC lié au VHB ont une réplication virale active dans le foie. Nous évaluerons l'effet antiviral des Lenti-HBc et Lenti-HBs dans un modèle murin d'infection chronique par le VHB sur la réplication virale et étudierons la réponse des cellules T aux vecteurs Lenti-HBV dans le contexte de l’hépatite B chronique. Nous espérons que cette étude fournira une preuve de concept préclinique des effets antitumoraux des vecteurs anti-VHB basés sur les LV pour l'immunothérapie du CHC, mettra en lumière les mécanismes d’action des approches vaccinales et ouvrira de nouvelles possibilités pour la gestion future de la maladie.