Projets et candidats lauréats

Objectifs. Les infections sexuellement transmissibles (IST) demeurent une préoccupation majeure en santé publique mais leur épidémiologie en France est relativement mal connue. Ce projet propose d'exploiter des outils de modélisation statistique pour analyser au mieux des données existantes d'incidence d'IST virales, avec un focus sur le VIH et les HPV, afin de mieux comprendre la propagation de ces infections en interaction avec le microbiote vaginal. Il se focalise sur deux IST en particulier : celles causées par le VIH et par les papillomavirus humains (HPV) à haut risque.

Situation du sujet. Les données exploitées proviendront de trois sources, qui nous fourniront des éclairages complémentaires : des données de dépistage national réalisées par le réseau de laboratoires de ville CERBA, des données d'un des plus grands centres de dépistage gratuits nationaux et, enfin, le Système National des Données de Santé (SNDS). Plusieurs des membres du consortium ont déjà un accès permanent au SNDS. De plus, il regroupe des expertises de points en biostatistiques, en épidémiologie et en virologie clinique.

Problématique. Ce projet porte autour de l'utilisation de la modélisation statistique pour mieux comprendre la propagation d'IST virales. Il visera à répondre à cinq questions en particulier :

1. Le dépistage sans ordonnance est-il un levier à privilégier dans la lutte contre le VIH ?
2. Existe-t-il des disparités spatio-temporelles en France dans la détection du VIH et sa prévalence ?
3. Les personnes vivant en France ont-elles toutes les mêmes risques d'exposition aux HPV ?
4. Quelle est la dynamique des coinfections génitales entre HPV ?
5. Quelle est l'incidence des vaginoses bactériennes récurrentes en France et quelle est leur association avec des IST virales ?

Méthodes. Ce projet reposera essentiellement sur de la modélisation statistique. Il mettra en jeu des techniques de pointe pour l'analyse des données spatio-temporelles, permettant de corriger au mieux les biais d'autocorrélation inhérents à ce type de données. Il utilisera aussi des outils très fins, comme l'approche par contrôles synthétiques afin de quantifier au mieux l'apport de politiques locales de prévention (en l'occurrence les départements pilotes pour la politique au labo sans ordo. Enfin, il exploitera des modèles de survie permettant de prendre en compte la nature censurée des données. Ces modèles seront appliqués à des bases de données générées et stockées localement ainsi qu'à celle du SNDS via la plateforme d'accès dédiée.

Échéancier des travaux. Le projet est prévu pour durer trois ans. La première année permettra d'obtenir les autorisations éthiques (notamment pour l'accès au SNDS) et de recruter un-e ingénieur-e en biostatistiques. Les analyses sur les bases de données existantes, notamment celle des laboratoires CERBA) pourront aussi débuter rapidement. La seconde année portera sur les analyses descriptives liées au SNDS. Enfin, la troisième année verra la réalisation des pans les plus ambitieux du projet, notamment l'analyse des interactions entre microbiote vaginal et IST virales.

Résultats attendus. Ces travaux nous fournirons des éclairages détaillés à différents niveaux, du local au national. Ils permettront d'optimiser les politiques de dépistage, de traitement et de prévention des IST en France à un niveau régional en tenant compte des disparités géographiques de prévalence et d'incidence. Enfin, ils amélioreront notre compréhension de la biologie des IST virales étudiées, par exemple au niveau de leurs interactions en coinfections ou avec le microbiote vaginal.

Le virus de l'immunodéficience humaine 1 (VIH-1) est un agent pathogène humain important qui persiste sous forme de réservoir et nécessite un traitement antirétroviral continu. L’incapacité du système immunitaire à éliminer l’infection par le VIH-1 est au moins en partie due à une activation immunitaire sous-optimale. Bien que le récepteur cGAS (cyclic GMP-AMP synthase) ait été proposé comme principal détecteur d’ADNs double brins (ADNdb) dérivés du VIH-1, ils sont de mauvais inducteurs de réponses antivirales car leur accessibilité est limitée. Les ADN simple brin (ADNsb) peuvent se former au cours du cycle de réplication du VIH-1, mais la manière dont ils induisent des réponses inflammatoires est très peu étudiée. Nous proposons ici d'explorer leur rôle dans la réponse immunitaire innée à l'infection par le VIH-1.

Nos données préliminaires montrent que la détection d’ADNsb est déclenchée dans les cellules immunitaires et non immunitaires, conduisant à l'activation des réponses d'interféron de type I (IFN) et associées au facteur nucléaire kappa B (NF-kB). Nous montrons que ces réponses à l’ADNsb peuvent être indépendantes du récepteur cGAS. Des analyses protéomiques réalisées dans des cellules humaines immunitaires et non immunitaires nous ont permis d'identifier et de valider des réseaux de protéines qui interagissent spécifiquement avec les ADNsb dans le cytosol. Nous souhaitons maintenant étudier le rôle joué par ce réseau de récepteurs et de modulateurs spécifiques des ADNsb dans la réponse intrinsèque des cellules dans le contexte de l'infection par le VIH-1. Pour cela, nous proposons un projet suivant deux axes :

1. Dissection du rôle des réseaux de protéines liant l'ADNsb dans la reconnaissance du VIH-1 dans ses cellules cibles.

2. Description du rôle de la détection des ADNsb au cours de l'infection par le VIH-1.

Nous utiliserons une approche de criblage ciblée basée sur la technologie CRISPR/Cas9 et des inhibiteurs spécifiques. Nous analyserons le rôle de la détection des ADNsb dans la régulation des réponses immunitaires innées à l'infection par le VIH-1 ainsi que dans sa réplication. Les travaux proposés apporteront une compréhension du rôle joué par les ADNsb dans l’immunité innée et dans la réponse à l’infection par le VIH-1. Ce travail ouvrira un nouveau champ de recherche et entraînera potentiellement des bénéfices pour les patients infectés par le VIH-1 en permettant d’envisager de nouvelles approches pour stimuler les réponses immunitaires antivirales.

Contexte et rationnel

Mycobacterium tuberculosis (Mtb), bactérie causale de la tuberculose (TB), est l'agent bactérien le plus mortel au monde et associé à l'émergence de la multirésistance. Le granulome est central dans l'immuno-pathogénie de la TB, jouant le rôle d’incubateur de mycobactéries. Sa composition cellulaire et son microenvironnement déterminent sa trajectoire. Des données récentes indiquent que les cellules Natural Killer (NK) NK sont indispensables au contrôle de la TB, au carrefour de l'immunité innée et de l'immunité adaptative. En contexte hyper-endémique, il a été suggéré que les individus "résistants innés" ne développent pas la TB grâce à l'activité protectrice des cellules NK. Dans le contexte de TB active, le contrôle des mycobactéries dans les granulomes est associé à une réponse adaptative Th1-Th17 cytotoxique et une proportion in situ plus élevée de cellules T/NK. Les cellules NK sont donc des candidates intéressantes comme biothérapie adjuvante.

Objectifs

L'objectif du projet NaKiTi est d'utiliser un modèle organoïde humain pour étudier la composition cellulaire et le microenvironnement immunorégulateur du granulome infecté par Mtb chez les individus naïfs et présentant une infection tuberculeuse latente (LTBI). De plus, en tirant parti du cadre conceptuel de l'immunothérapie du cancer, nous testerons une intervention adjuvante basée sur le transfert adoptif dans le modèle de cellules NK activées. Les signaux produits par le microenvironnement du granulome Mtb qui régulent l'activité des cellules NK seront étudiés. Plus spécifiquement, l'infection par Mtb de PBMCs naïfs renseignera sur l'interaction primaire entre les agrégats de macrophages infectés et les cellules NK et permettra de déterminer si une biothérapie de cellules NK activées peut induire l'éradication de Mtb. L'infection par Mtb des PBMCs d’individus LTBI permettra de comprendre l'interaction dynamique entre les cellules NK et les cellules T, et de déterminer si une biothérapie de cellules NK activées stimule l'activité des cellules T en aval.

Methodes

Nous utiliserons un modèle optimisé de granulome spatio-temporel in vitro 2.5 dimensionnel basé sur les cellules mononuclées sanguine humaines (PBMC) formant une monocouche sur une matrice extracellulaire s’organisant en agrégats granulomateux microscopiques en réponse à la souche virulente de Mtb H37Rv et avirulente H37Ra. La charge mycobactérienne et la composition du microenvironnement des granulomes seront étudiées à différents temps par l’étude : (i) du morphotype des granulomes par un score microscopique. (ii) Du microenvironnement immunitaire par la mesure des cytokines Th1, Th17, Th2 et de chimiokines clés dans les surnageants, ainsi que de l'enzyme indoleamine 2-3 dioxygénase. (iii) Immunophénotypique des cellules NK et T par analyse en cytométrie spectrale des principaux marqueurs d'expression. (iv) Du contrôle de l'infection à Mtb par comptage des unités formant colonies après rupture du granulome et lyse cellulaire, ainsi que de la dormance de Mtb en cultivant des bactéries du même micro-puits avec ou sans surnageant de culture filtré de la phase logarithmique tardive pour ressusciter les mycobactéries dormantes.

Calendrier

Le projet NaKiTi durera 36 mois, comprenant une première phase d'optimisation du modèle (T0 à mois 12). Puis une deuxième phase consacrée à la collecte des résultats caractérisant l'immuno-régulation et la trajectoire des granulomes (mois 12 à 24), suivie d’une troisième phase consacrée aux expériences de transfert adoptif (mois 18 à 30). La dernière phase consistera à analyser, valoriser et diffuser les résultats de NaKiTi (mois 30 à 36).

Retombées

Ce modèle préclinique in vitro de granulome humain infecté par Mtb permettra de disséquer les voies immuno-régulatrices de l’activité des cellules NK dans le granulome et son micro-environnement. Le modèle permettra de valider si une biothérapie adjuvante par cellules NK activées augmente la clairance bactérienne et restreint la trajectoire des granulomes infectés par Mtb. Il s'agit de la première étape d'une stratégie de recherche visant à tester l'utilité d'une telle biothérapie dans la TB.

L’OMS et l'ONUSIDA ont appelé à mettre fin à l’épidémie du VIH/Sida pédiatrique d'ici 2030. Alors que de nombreux pays continuent de progresser vers l’atteinte de cet objectif au sein de la population adulte, les enfants (âgés de 0 à 14 ans), adolescents (âgés de 10 à 19 ans) et jeunes adultes (âgés de 15-24 ans) vivant avec le VIH (EAVVIH) accusent un retard important. Nous faisons l’hypothèse que ce constat s’explique principalement par l’invisibilité de cette population pédiatrique, et l’absence d’interventions adaptées. Les EAVVIH constituent une population complexe et hétérogène d’un point de vue épidémiologique. Cette population est constituée d'enfants vivant avec le VIH depuis la période péri/postnatale et vieillissant jusqu'à l'adolescence, à laquelle s’ajoutent les adolescents et jeunes adultes nouvellement infectés horizontalement par le VIH au cours de l'adolescence, dont les jeunes populations clés et les jeunes femmes, touchées de manière disproportionnées par l’épidémie.  Pour atteindre l'objectif des « 95-95-95 », ciblant 95% des enfants vivant avec le VIH identifiés, 95% de ceux identifiés sous traitement et 95% de ceux traités en succès virologique, il est essentiel pour chacun des pays de connaitre l’ampleur de l’épidémie et définir les différents dénominateurs des populations cibles. La modélisation s'avère être un outil pragmatique et joue un rôle important pour mieux comprendre la dynamique des épidémies et pour planifier et évaluer les interventions de prévention.

L’objectif principal de notre projet est d’améliorer la précision des indicateurs VIH pédiatriques en Afrique de l’Ouest et du Centre. Pour y arriver, notre équipe développera un modèle de simulation novateur et interactif, qui pourrait être facilement utilisé par les planificateurs de programmes en santé dans trois pays clés : la Côte d’Ivoire, le Togo et le Cameroun.

Le projet s'appuiera sur les collaborations existantes dans chacun des trois pays et sera construit en lien avec les programmes nationaux. Nous établirons un « groupe de travail modélisation du VIH chez les enfants, adolescents et jeunes adultes », constitués de chercheurs, épidémiologistes et acteurs des programmes locaux, afin d'examiner les données disponibles et fournir des recommandations sur l’interprétation et l’utilisation de celles-ci. Le modèle que nous proposons sera un modèle de transition d'états, dépendant du temps. Il simulera distinctement les différentes populations : jeunes filles, et jeunes hommes à « faible risque », hommes ayant du sexe avec les hommes, les travailleuses du sexe, et leurs clients. Il prendra en compte les mouvements entre populations, ainsi que la transmission inter et intra populations et leur dynamique spatiale.  Nous projetterons sur la période 2020-2030 le nombre d’EAVVIH ainsi que la part attribuable à chacune des sous populations, et selon s’ils aient été diagnostiqués, s’ils ont initié un traitement antirétroviral et s’ils sont en suppression virologique. Notre évaluerons l’impact d’interventions existantes (par exemple, le diagnostic précoce avant l’âge de 2 mois) et l’impact du passage à l’échelle de nouvelles interventions, dont la prophylaxie préexposition pour les adolescents et les antirétroviraux à action prolongée. Enfin, nous conduirons plusieurs analyses de sensibilité pour évaluer l'impact de différentes sources d'incertitude sur les résultats du modèle calibré, ce qui nous permettra d’identifier quels paramètres sont les plus sensibles et donc les besoins en production de données pour la recherche. Enfin, nous développerons une application web, accessible en ligne, servant d’interface dans laquelle les programmes pourront sélectionner leur pays et insérer les paramètres propres à leur contexte.

A travers ce projet, nous proposons de tirer parti de l'expérience de chacune des équipes pour faire progresser la modélisation de l'épidémie de VIH chez les enfants, adolescents et jeunes adultes en Afrique de l’Ouest et du Centre et contribuer à l'élaboration de politiques de santé efficaces et efficientes, permettant à la région de rattraper son retard dans la lutte contre le VIH/sida.

La plupart des virus à ARN enveloppés exploitent la machinerie cellulaire ESCRT-III (endosomal sorting complexes required for transport) pour la dernière étape de leur cycle de multiplication, le bourgeonnement. Néanmoins, les virus enveloppés utilisent seulement les protéines CHMP2, CHMP3 et CHMP4 et l'ATPase VPS4. Étant donné que cette machinerie est essentielle pour les événements cellulaires de coupure de membrane, cela limite la possibilité d'acquérir des mutations qui l'inhibent. Cependant, de nombreuses espèces ont évolué pour conserver des duplications mutées de CHMP3 (appelées rétroCHMP3), qui préservent les fonctions cellulaires de l'ESCRT mais agissent comme des inhibiteurs du bourgeonnement viral à large spectre

In vitro, les protéines ESCRT-III ont la propriété de s’auto-assembler sur les membranes plasmiques en formant des filaments de composition variable, présentant également une diversité de formes : les CHMP4 forment des filaments en spirales plates et lâches, alors que les CHMP2A-CHMP3 s'assemblent en hélices compactes. Cependant, il reste encore à déterminer la composition des fibres aux sites de bourgeonnement du VIH-1 en particulier, on ne sait pas si ce sont des spirales de CHMP4B ou des polymères hélicoïdaux de CHMP2A/CHMP3 comme ceux observés in vitro. De plus, il n'est pas encore clair si ces filaments sont échangés ou s'ils sont successivement recrutés et désassemblé lors de la fission membranaire. En fin de compte, la distribution spatiale des filaments ESCRT-III et les transitions entre chaque fibre le long du col de bourgeonnement restent des sujets controversés.

La compréhension de la dynamique et de l'architecture du complexe ESCRT-III natif aux sites de bourgeonnement du VIH-1 est limitée en raison de la résolution spatiale et du recrutement transitoire des ESCRT-III. Nous proposons d'utiliser les ciseaux moléculaires pour marquer les protéines ESCRT-III par des protéines fluorescentes de différentes couleurs à leur loci chromosomiques. Nous utiliserons l'imagerie cellulaire « Total Internal Reflection Fluorescence » (TIRF) à haute résolution temporelle pour établir la cinétique de leur échange, assemblage et désassemblage lors du bourgeonnement. Pour obtenir une résolution spatiale suffisante, nous tirerons parti des récentes améliorations de la Single Molecule Localization Microscopy (SMLM) telle que les améliorations récentes de Points Accumulation for Imaging Nanoscale Topography (PAINT). De plus, nous utiliserons des techniques de microscopie électronique à cryogénie. Ces technologies de pointe promettent de fournir des images cellulaires de haute résolution des protéines ESCRT-III, dans le but d'élucider la cinétique, l'arrangement spatial, l'organisation structurelle et l'interaction de chaque filament.

Ces approches seront appliquées à divers mutants connus pour bloquer le bourgeonnement à différentes étapes, notamment des mutants de VPS4, des dominant négatifs des ESCRT-III et les mutants rétroCHMP3. Cela nous permettra de déterminer le rôle de CHMP4B, CHMP2A, CHMP3 et VPS4. De plus, l'inclusion des protéines rétroCHMP3 enrichira notre compréhension des fonctions spécifiques de CHMP3 et nous fournira des éléments pour comprendre les mécanismes altérés par les retroCHMP3.

Dans le cadre du "contrat d'initiation", nous mettrons en place les modèles cellulaires pour l'imagerie cellulaire. Nous fournirons les premières preuves de concept afin d'atteindre les objectifs décrits ci-dessus. L'utilisation de techniques d'imagerie avancées telles que la TIRF, la SMLM et la cryo microscopie électronique aidera à explorer l'organisation spatiale et la dynamique des filaments ESCRT-III, enrichissant notre compréhension de leur implication dans la fission membranaire lors du bourgeonnement viral. Cette recherche repoussera les limites technologiques de l'imagerie, contribuant à des progrès méthodologiques en biologie cellulaire. L'étude des variantes rétroCHMP3 révèlera comment ces protéines inhibent le bourgeonnement viral tout en préservant les fonctions cellulaires essentielles, offrant des pistes pour de nouveaux antiviraux moins toxiques.

Contexte : La protéine Rev, essentielle à la réplication du VIH-1, est responsable d’exporter – du noyau vers le cytoplasme – les ARNm viraux immatures, permettant l’expression de protéines virales tardives et constituant l'ARN génomique de nouveaux virions. Rev est importée dans le noyau par Importine β (Impβ) et ce processus est stimulé par Nucleophosmine 1 (NPM1). L'interaction directe de Rev avec Impβ ou NPM1 est cruciale, car son inhibition bloque respectivement son import nucléaire et inhibe l'infection et la réplication du VIH-1. Malgré leur importance dans le cycle viral, les bases moléculaires de ces interactions restent mal comprises.

Objectif : Ce projet vise à identifier et caractériser les mécanismes clés de l’import nucléaire de Rev dans les cellules infectées par le VIH-1, en étudiant ses interactions avec Impβ et NPM1. Nous utiliserons la cryo-microscopie électronique (cryo-ME) et la RMN pour obtenir des structures 3D à haute résolution des complexes Impβ/Rev et Rev/NPM1 déjà identifiés. Nous examinerons également la dynamique des interactions entre Rev, Impβ et NPM1 pour comprendre la régulation de leur formation. L'objectif est d’identifier et caractériser les interactions, stables ou transitoires, entre ces protéines et leur potentiel rôle régulateur dans les compartiments cellulaires lors de la réplication du VIH-1.

Approche méthodologique :

Complexe Rev/Impβ : Les données préliminaires indiquent que la fusion de Impβ avec le domaine de dimérisation de la protéine EsxA de S. aureus, permet de créer des homodimères stables d’Impβ (EsxA-Impβ)2 de plus de 200 kDa, capable d’interagir avec Rev. Nos résultats soulignent que la flexibilité intrinsèque à Impβ doit être réduite à l’aide d’un anticorps monoclonal pour renforcer l’interaction entre Impβ et Rev, garantissant ainsi la formation d’un ensemble de particules plus homogène pour l'analyse par cryo-ME.

Complexe Rev/NPM1 : Les données préliminaires obtenues par cryo-ME révèlent la structure du complexe pentamérique entre Rev et le domaine d’oligomérisation de NPM1, avec une résolution atteignant 3.4 Å. Cependant, nos résultats indiquent une certaine flexibilité des molécules de Rev au sein des complexes Rev/NPM1, suggérant l’existence de multiples conformations de Rev à la surface de NPM1. Pour affiner la classification 2D et obtenir les structures des complexes (Rev/NPM1OD)5 coexistants, nous utiliserons les prédictions d’interaction établies avec une forte confiance par AlphaFold. Pour mieux comprendre la fonction du domaine intrinsèquement désordonné de NPM1 (NPM1HBD) et étudier son comportement structurel et dynamique en présence de Rev, nous utiliserons la technique de RMN – adaptée à l’étude des bases mécanistiques des assemblages moléculaires désordonnés.

Régulation de l’import nucléaire de Rev par NPM1 et Impβ : Nous étudierons l’évolution des interactions au sein des complexes Rev/NPM1 et Rev/Impβ lorsque les trois protéines sont présentes dans un même environnement, in vitro, en utilisant une combinaison de techniques biochimiques, biophysiques et structurales. Les interactions identifiées seront ensuite analysées par cryo-ME. La localisation de ces interactions dans les différents compartiments cellulaires de cellules transfectées sera réalisée par microscopie, en utilisant des anticorps spécifiques et des protéines fluorescentes. Cette approche nous permettra d’étudier la dynamique des interactions impliquées dans l’import nucléaire de Rev dans un contexte cellulaire.

Résultats attendus : L'obtention de structures à haute résolution des complexes qui impliquent Rev, Impβ et NPM1 permettra d'identifier les résidus impliqués dans ces interactions cruciales pour la réplication virale. L'étude comparative des différents complexes contribuera à une meilleure connaissance du mécanisme moléculaire de l'import de Rev, qui devrait améliorer notre compréhension de cette étape mal comprise et non ciblée dans les traitements antiviraux disponibles.