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Développement et caractérisation in vitro et in vivo de dérivés de composés naturels antiviraux contre les souches africaines contemporaines du virus Zika

Le virus Zika (ZIKV) est un arbovirus zoonotique transmis principalement aux humains par les moustiques de genre Aedes. ZIKV appartient au genre Orthoflavivirus de la famille des Flaviviridae. Les souches de ZIKV sont classées en génotypes africain, asiatique. Les souches africaines contemporaines, telles que GUINEA-18 et SENEGAL-11, ont récemment montré des effets tératogènes accrus et des taux de transmission par les moustiques plus élevés par rapport aux souches asiatiques. De plus, chez les adultes infectés, les souches épidémiques asiatiques de ZIKV peuvent persister dans les sécrétions corporelles telles que les sécrétions oculaires, l'urine et, surtout, le liquide séminal, bien après la phase aiguë de l'infection. Cela représente un risque important pour la transmission sexuelle du virus. Ces caractéristiques soulignent la nécessité urgente d'interventions ciblées, d'autant plus qu'il n'existe actuellement ni vaccins ni traitements curatifs pour la fièvre Zika, ce qui en fait une préoccupation majeure de santé publique mondiale.

Le projet de thèse vise à identifier et développer des analogues de Macarangin dérivés de plantes et des dérivés synthétiques de ferrocène comme composés antiviraux potentiels contre les souches africaines du ZIKV. Ces composés seront évalués pour leur capacité à inhiber la réplication virale en utilisant des modèles in vitro et in vivo. Le projet se concentrera sur deux axes principaux : la rupture de la chaîne de transmission en évaluant la capacité des molécules naturelles à inhiber la réplication virale dans l'intestin des moustiques en utilisant le modèle Drosophila, et l'inhibition de la réplication virale dans les cellules humaines permissives pour agir comme antiviraux.

Les études ex vivo seront menées en collaboration avec les institutions partenaires du consortium CAZIKANO, en utilisant des modèles physiologiquement pertinents tels que les testicules adultes humains. Les résultats attendus de cette recherche contribueront de manière significative à la compréhension des mécanismes d'action de ces composés et à l'élaboration de stratégies antivirales efficaces contre les souches contemporaines africaines du ZIKV.

Décryptage des mécanismes d'infection des souches contemporaines du virus Zika africain dans les intestins de Drosophila et d'Aedes

Le virus Zika zoonotique (ZIKV) est un virus transmis par les moustiques qui est apparu en 2007 en Micronésie, provoquant par la suite des épidémies significatives dans le Pacifique Sud, les Amériques et l'Asie du Sud-Est. Le ZIKV appartient au genre Orthoflavivirus et est principalement transmis par les moustiques Aedes. En plus de la transmission par les moustiques, le ZIKV peut également être transmis verticalement, entraînant des syndromes congénitaux chez les nouveau-nés. Le virus circule sous différents génotypes, notamment les lignées africaines et asiatiques historiques, cette dernière étant responsable des récentes épidémies. Il est intéressant de noter que les souches africaines contemporaines ont été signalées comme étant plus efficacement transmises par les moustiques et causant des symptômes plus graves par rapport aux souches asiatiques.

Chez les vecteurs moustiques, les particules de ZIKV prolifèrent initialement dans l'intestin moyen avant de se disperser dans tout le corps pour atteindre les glandes salivaires. Ce processus implique de surmonter les barrières physiques et cellulaires locales ainsi que l'immunité intestinale. En raison des limitations des outils moléculaires et génétiques existants, de nouveaux modèles sont nécessaires pour étudier les interactions hôte-ZIKV au niveau de l'intestin moyen. La mouche des fruits Drosophila melanogaster, qui partage une composition cellulaire intestinale similaire à celle des moustiques, constitue un système modèle efficace pour étudier les interactions hôte-ZIKV. Les résultats préliminaires de notre laboratoire montrent que les drosophiles adultes infectées oralement par une souche historique de ZIKV présentent une mort excessive des entérocytes, rappelant l'apoptose induite par le ZIKV dans l'intestin moyen des moustiques.

Le projet de doctorat repose sur l'utilisation de la drosophile pour étudier au niveau mécanistique comment les barrières de l'intestin moyen modulent l'activité infectieuse des souches contemporaines du ZIKV africain. Une étude comparative sera spécifiquement menée entre deux souches du virus Zika isolées en Afrique (2011 et 2018) et une souche brésilienne de 2015. En parallèle, nous validerons nos résultats dans l'intestin moyen des espèces d'Aedes.

À Nouméa, en Nouvelle-Calédonie, les moustiques Aedes aegypti infectés par Wolbachia, une bactérie symbiotique intracellulaire héréditaire qui rend son hôte résistant aux virus, ont été déployés comme stratégie de biocontrôle pour prévenir les épidémies de virus de la dengue (DENV). Cependant, il a été démontré que l'infection du moustique par Wolbachia modifie la diversité des virus et des bactéries qui y résident. En outre, on sait que le microbiote du moustique affecte la sensibilité de son hôte aux arbovirus et peut modifier la compétence du vecteur, ce qui peut avoir des conséquences en aval sur la transmission des arbovirus par les moustiques. Cependant, malgré la possibilité que ces interactions aient un impact sur la durabilité de l'intervention de Wolbachia, notre compréhension actuelle des interactions entre Wolbachia et le microbiote des moustiques est encore limitée.
Ici, nous visons à étudier les interactions globales entre Wolbachia et le microbiote des moustiques et leurs effets sur la compétence vectorielle des moustiques pour les arbovirus. Nous émettons l'hypothèse que ces interactions moduleront la force du blocage du DENV induit par Wolbachia, ce qui aura un impact sur l'efficacité à long terme de la stratégie de biocontrôle de Wolbachia actuellement mise en œuvre dans 13 pays à travers le monde.

Une analyse métagénomique sur des moustiques sauvages infectés ou non par Wolbachia sera réalisée pour étudier comment l'infection par Wolbachia modifie la composition du microbiote du moustique (bactéries et virus). Les composants viraux du microbiote en présence ou en l'absence de Wolbachia seront isolés. Nous étudierons ensuite la capacité de ces virus isolés à influencer la compétence vectorielle pour le DENV chez les Ae. aegypti infectés ou non par Wolbachia. Les composants bactériens seront également étudiés, mais pas dans le cadre de ce projet de doctorat. Ainsi, la première année du doctorat sera consacrée à l'isolement du virus et à la participation à l'analyse métagénomique. Les deuxième et troisième années seront consacrées à la recolonisation par les virus sélectionnés des Ae. aegyti infectés ou non par Wolbachia et à la compétence vectorielle du DENV qui en découle.

La stratégie Wolbachia étant déployée dans de plus en plus de pays, il est essentiel d'étudier les impacts des interactions multitrophiques Wolbachia × microbiote chez les moustiques sur le phénotype de blocage du virus et sur la transmission des arbovirus.

L'originalité de ce projet réside dans i) l'utilisation d'une approche communautaire globale pour comprendre les interactions microbiennes sur le phénotype de l'hôte ii) la tentative de modifier la composition du microbiote chez Ae. aegypti pour mesurer son impact sur le blocage du virus induit par Wolbachia. À cette fin, ce projet combine la microbiologie, la bioinformatique, la biologie des vecteurs et l'expertise en entomologie médicale pour examiner une question de recherche fondamentale dans le contexte d'un environnement d'étude éco-épidémiologique très pertinent. Les résultats du projet fourniront les connaissances nécessaires et opportunes pour identifier les facteurs de risque environnementaux qui renforceraient ou compromettraient le blocage du virus induit par Wolbachia et, par conséquent, l'efficacité de la lutte antivectorielle basée sur Wolbachia.

Les papillomavirus humains (HPV) sont parmi les virus les plus oncogènes connus chez l'homme, mais nous savons relativement peu de choses sur leur histoire naturelle aux premiers stades de l'infection. En particulier, même pour le génotype le plus virulent, le HPV16, plus de 90 % des infections disparaissent au bout de quelques mois ou années. En outre, des résultats antérieurs ont montré que les femmes dont les communautés de microbiote vaginal ne sont pas optimales, c'est-à-dire pauvres en bactéries lactobacilles, sont plus susceptibles d'être séropositives pour le HPV. Ce projet combinera plusieurs techniques de modélisation et types de données pour décrypter les interactions entre les HPV et le microbiote. Tout d'abord, nous utiliserons des modèles d'écologie communautaire pour acquérir une compréhension mécaniste des interactions entre la dynamique de l'infection à HPV et le microbiote vaginal. Ensuite, nous utiliserons des modèles statistiques pour analyser les données longitudinales afin de déterminer ce qui conduit à des transitions dans le statut HPV. Enfin, nous analyserons les données métagénomiques pour étudier la coévolution des bactéries du microbiote vaginal et des HPV tout au long d'une infection. Les données proviendront de l'étude PAPCLEAR et ont déjà été collectées. Ces résultats auront un impact particulièrement fort sur la santé des femmes, étant donné que les HPV sont responsables de la quasi-totalité des cancers du col de l'utérus et que le microbiote vaginal affecte la fertilité et le bien-être général.

Le virus du chikungunya est un arbovirus ré-émergent qui se transmet à l'homme par l'intermédiaire du moustique vecteur Aedes, provoquant des épidémies à grande échelle avec une propagation rapide et des taux d'infection élevés. Endémique en Afrique, en Asie et en Amérique, le CHIKV provoque des arthralgies fébriles chez l'homme, qui peuvent persister dans certains cas pendant des années. Compte tenu de la propagation du vecteur Aedes et de l'absence d'antiviraux efficaces, le CHIKV représente un risque important pour la santé publique, la société et l'économie. Il est essentiel de comprendre le processus de réplication virale pour mettre au point des traitements efficaces. La réplication et la transcription du CHIKV sont assurées par un complexe réplicase (CR) formé de quatre protéines non structurelles (nsP1-4) codées par le génome viral. Le génome de l'ARN simple brin positif (+ssRNA) détourne les ribosomes de l'hôte après la désenrobage et la libération dans la cellule. Les nsP sont traduits sous forme de polyprotéine à partir du premier cadre de lecture ouvert (ORF1) et clivés en CR actifs par la protéase nsP2. Les données structurales et biochimiques actuelles sur les nsP se limitent à des domaines ou des protéines individuels, ce qui restreint notre compréhension de leur fonction concertée dans la synthèse de l'ARN. Dans notre laboratoire, la structure du CHIKV CR complet a récemment été résolue à l'aide de la cryoEM à particule unique, révélant un complexe de 3MDa. Grâce à ces assemblages, nous pouvons enfin envisager une étude holistique de la synthèse in vitro de l'ARN dans cette importante famille de virus.

Ce projet combinera des tests d'activité avec des structures cryo-EM du CR tardif à différents stades de la synthèse de l'ARN+ afin d'élucider la fonction du complexe. Le projet déterminera les modèles d'ARN optimaux pour la réplication, évaluera le couplage entre les différents PNS pendant la synthèse de l'ARN et fournira des instantanés structurels du CR à différents stades de la réplication. Pour ce faire, on testera la liaison de l'ARN aux CR CHIKV reconstitués par polarisation de fluorescence ou par déplacement de mobilité en utilisant des ARN couplés à des fluorophores et en comparant les activités de synthèse de l'ARN de divers sous-complexes nsP afin d'expliquer la fonction de l'hélicase nsP2 et de la barrique nsP3. Les CR seront incubés avec des séquences d'ARN optimales pour l'analyse cryo-EM, dans le but de capturer le complexe dans les états de pré-initiation et d'élongation. Des mutants de CR ciblés seront générés et testés sur la base des connaissances structurelles. Les résultats attendus montreront que le CR est actif dans la synthèse de l'ARN, détermineront les préférences en matière de matrice et mettront en évidence une activité de synthèse spécifique au promoteur. Cela fournira un aperçu structurel et fonctionnel détaillé de la réplication de l'ARN, grâce auquel nous comprendrons le rôle coopératif des PNS dans la synthèse de l'ARN. L'étudiant acquerra des compétences en matière de transcription de l'ARN, de purification du CR, de cryo-EM et d'analyse des données afin de fournir une approche intégrée de la recherche sur la réplication virale.

L'émergence régulière de nouveaux pathogènes viraux représente un risque croissant pour la santé publique mondiale. Ce projet de thèse vise à développer une approche innovante combinant des techniques de criblage à haut débit d'interactions protéine-protéine (PPIs) et des méthodes d'intelligence artificielle (IA) pour accélérer l'identification de cibles thérapeutiques potentielles et de peptides inhibiteurs contre les virus émergents.

En exploitant les avancées récentes dans les modèles de langage pour protéines (pLM) et génomes (gLM), ainsi que les prédictions de structure d'AlphaFold, il sera possible de rapidement modéliser les fonctions, interactions et structures des protéines virales dès la disponibilité de la séquence génomique, avant même de disposer d'un modèle de culture.

Le projet utilisera les virus Influenza A comme modèle pour mettre au point et valider cette approche, en se concentrant à la fois sur les souches humaines circulantes et les souches zoonotiques à haut risque pandémique. Les principales étapes comprennent : 1) le criblage des PPIs virales et virus-hôte par une approche d'intercation entre fragments, 2) l'identification de peptides inhibiteurs dominants négatifs (DNP) ciblant ces interfaces, 3) la modélisation in silico des complexes DNP-protéine, 4) l'analyse des fonctions et redondances virales par pLM et gLM afin d'être en mesure de sélectionner informatiquement les sous-unités virales à déstabiliser pour interrompre le cycle viral de la manière la plus efficace possible.

Les résultats attendus incluent l'identification des PPIs critiques pour la réplication virale, la validation de DNP inhibiteurs, la mise en place d'un pipeline de découverte rapide d'antiviraux contre les menaces émergentes, et des connaissances approfondies sur les mécanismes d'adaptation des virus grippaux humains et zoonotiques.

Le projet s'étendra sur 3 ans, avec une première année dédiée au criblage des PPIs et à la préparation des bibliothèques de DNP, une deuxième année axée sur les tests d'inhibition et la modélisation, et une troisième année consacrée à l'optimisation et à la validation cellulaire.

Contexte et justification : Le Burkina Faso fait face depuis plusieurs années à une émergence et réémergence d’arbovirus occasionnant des épidémies et des décès. Malgré l’existence d’un système de surveillance de ces arbovirus certains tels le USUV et le WNV ne sont pas couverts par cette surveillance. Le virus du Nil occidental (WNV) et le virus Usutu (USUV) sont des arbovirus phylogénétiquement apparentés transmis principalement par les moustiques du genre Culex. Les oiseaux constituent les principaux hôtes amplificateurs et l’Homme et le cheval sont des hôtes accidentels. Il est difficile de prédire à quel moment ces pathogènes peuvent passer de l’animal à l’homme d’où l’importance de la surveillance des reservoirs animaux impliqués dans le cycle enzootique de ces virsus. Une surveillance aviaire du USUV et du WNV permettrait d’identifier les espèces impliquées dans l’amplification et la circulation de ces virus au Burkina Faso et d’anticiper sur la survenue d’épidémies humaines.

Objectif : L’objectif de cette étude est de réaliser une surveillance moléculaire et sérologique du USUV et du WNV chez les oiseaux domestiques et sauvages et les chevaux en zone urbaine et semi urbaine au Burkina Faso en tenant compte des variations saisonnières.

Méthodes : Il s’agira d’une étude transversale descriptive à recueil prospectif qui se déroulera sur 3 ans en milieux urbains (Bobo-Dioulasso) et semi-urbain (Banfora). Les échantillons seront collectés en tenant compte des variations saisonnière pour voir la dynamique de la circulation des arbovirus en fonction des saisons. Des prélèvements sanguins seront réalisés sur les chevaux. Chez les oiseaux, un prélèvement de goutte de sang sur du papier buvard sera réalisé ainsi qu’un écouvillonnage oral ou rectal. Des prélèvements d’organes seront également réalisés chez les oiseaux trouvés morts. Au total, 385 échantillons d’oiseaux domestiques, d’oiseaux sauvages et de chevaux seront collectés. Tous les échantillons collectés seront convoyés dans le laboratoire d’accueil à Montpellier pour les analyses moléculaires et sérologique. Sur le plan moléculaire, tous les échantillons seront analysés par RT-PCR pour la détection de l’ARN des virus recherchés et les échantillons positifs feront l’objet de séquençage et d’analyses phylogéniques pour identifier les souches de virus circulants. Sur le plan sérologique, les échantillons seront d’abord screené par un test ELISA commercial Pan-Flavivirus et les échantillons positifs seront ensuite testés par séroneutralistion pour détecter les anticorps spécifiques à chaque virus.

Résultats attendus : Les résultats de notre travail permettront d’identifier les espèces aviaires impliquées dans le maintien de cycle enzootique du USUV et de WNV au Burkina Faso ainsi que les saisons de forte circulation de ces virus. Nous aurons à la fin de notre travail, une information sur les souches virales circulantes. L’étude sur les chevaux nous permettront de valider la pertinence de l’utilisation de ces derniers comme sentinelles dans la surveillance de ces flavivirus. Nous pourrons ainsi faire des propositions concrètes aux autorités compétentes du Burkina Faso afin d’améliorer la surveillance et la lutte contre ces virus.

Echéancier : La mise en place et l’obtention des autorisations administratives et des consentements se fera pendant les cinq premiers mois de la première année ; l’acquisition des échantillons du sixième au neuvième mois de la première année et les neufs premiers mois de la deuxième année ; l’analyse de Laboratoire à partir du dixième mois de la première année jusqu’à la fin de la troisième année ; l’analyse des données à partir du premier mois de la deuxième année jusqu’à la fin de la troisième année ; la valorisation des données à partir du septième mois de la deuxième année jusqu’à la fin de la troisième année.