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Il existe une très grande différence de lipidation entre les lipoviroparticules (LVPs) du virus de l’hépatite C (VHC) produites au cours de l’infection naturelle et celles produites in vitro par les cellules Huh7 (et les clones dérivés – modèle VHCcc) qui présentent un métabolisme lipidique déficient. Ces modèles permettent ainsi difficilement la juste compréhension des liens étroits qui unissent lipides cellulaires et virus permettant de produire ces LVPs très étroitement associées à la voie de sécrétion des lipoprotéines chargées de lipides neutres et à des apolipoprotéines (apo). Les apo, notamment l’apoE, jouent un rôle central dans différentes étapes du cycle viral. Or, la physiologie hépatique est caractérisée par des hépatocytes différenciés, évoluant sous une faible tension en oxygène (hypoxie), loin des cellules Huh7 dé-différenciées, cultivées en condition atmosphérique d’oxygénation (normoxie), qui servent à la production in vitro du VHCcc. Ainsi, nos objectifs sont : 1) d’établir et de caractériser un modèle de culture de cellules Huh7.5 différenciées, cultivées en hypoxie physiologique ; 2) d’évaluer l’impact de cette culture originale sur les caractéristiques infectieuses et ultrastructurales des LVPs produites et 3) d’explorer les mécanismes moléculaires hypoxie et/ou différenciation-dépendant qui sous-tendent la morphogenèse et l’infection virale en lien avec le métabolisme lipidique.

Nos résultats préliminaires montrent que des cellules Huh7.5 exposées au DMSO et plongées dans une hypoxie prolongée (Huh7.5Hypo–Diff) rétablissent divers marqueurs de la différenciation hépatocytaire mais aussi stabilisent fonctionnellement des facteurs de transcription centraux du métabolisme de l’hypoxie (HIF-1 et HIF-2). Ces cellules stockent en outre de plus nombreuses et de plus grosses gouttelettes chargées de lipides neutres que les cellules contrôles (Huh7.5Std), les cellules différenciées en normoxie (Huh7.5Diff) ou les cellules dé-différenciées en hypoxie (Huh7.5Hypo). Les lipoprotéines produites par Huh7.5Hypo–Diff sont deux fois plus grosses que celles des autres conditions (immunocapture et microscopie électronique – IC-MET) suggérant une meilleure production extracellulaire de lipoprotéines, potentiellement mieux couvertes d’apoE. Les cellules Huh7.5Hypo–Diff sont permissives à l’infection par le clone JFH1 du VHC et favorisent fortement la production extracellulaire des particules virales. Enfin, les LVPs produites par les Huh7.5Hypo–Diff présentent une taille et une structure similaires à celles isolées d’un sérum de patient infecté.

Nous avons ainsi établi un modèle de culture original où l’hypoxie prolongée couplée à la différenciation cellulaire optimise le métabolisme lipidique des cellules Huh7.5 et améliore la production de particules virales présentant une ultrastructure physiologiquement relevante.

Nous souhaitons à présent caractériser plus finement le métabolisme des lipides de ce modèle original et comprendre les mécanismes qui sous-tendent la morphogenèse virale. Ainsi, nous analyserons les synthèse et production des autres apo importantes pour les LVPs, nous évaluerons le rôle des HIFs dans le phénotype cellulaire et viral par l’emploi de cellules exprimant constitutivement HIF-1 ou HIF-2 ou de drogues stabilisant l’un ou l’autre des HIFs, nous déterminerons le pouvoir infectieux des particules produites en relation avec la densité des virions présents, nous affinerons notre connaissance du rôle de l’apoE (emploi de cellules dont l’expression d’apoE est modulée) dans la morphogenèse et l’infectiosité du VHC et enfin, avec ce modèle Huh7.5Hypo–Diff nous déterminerons le pouvoir de neutralisation de l’infection par des Ac produits par le laboratoire à partir de particules vaccinales portant ou non de l’apoE à leur surface.

Au final, notre projet vise à proposer un modèle original de production de particules virales du VHC de caractéristiques biochimiques et morphologiques proches de particules natives. Il permettra alors de mieux comprendre le lien existant entre métabolisme lipidique et cycle viral et de fournir un outil d’étude in vitro du pouvoir neutralisant d’Ac à visée vaccinale.

La majorité des maladies émergentes infectieux (MIE) sont d’origine zoonotique et 70 % sont causés par des agents pathogènes provenant de la faune sauvage. L’épidémie actuelle de COVID-19 avec le virus SRAS-CoV2 illustre clairement les conséquences d’une seule transmission inter-espèce avec un coronovirus (CoV), infectant plus d’un million d’individus et conduisant à un blocage de 4 milliards de personnes dans le monde entier en quelques mois seulement. Les chauves-souris sont à l’origine de CoVs humains, soit directement, soit par un hôte intermédiaire. Les contacts entre l’Homme et les chauves-souris sont variés et augmentent avec les changements environnementaux et climatiques, comme l’exposition directe au sang ou aux tissus infectés par la chasse, ou l’exposition indirecte aux fruits contaminés par leur salive, leur urine ou leurs excréments. Une grande diversité d’espèces de chauves-souris sont chassées en Afrique de l’Ouest et centrale. Par conséquent, il est maintenant plus que crucial de documenter la prévalence et la diversité génétique des coronavirus chez les chauves-souris.

L’objectif général du projet est de documenter des coronavirus circulants chez les chauves-souris dans les pays africains avec une forte probabilité d’émergence d’infections zoonotiques à partir de chauves-souris. Les objectifs spécifiques sont (i) documenter la diversité génétique et l’évolution des coronavirus chez les chauves-souris Africains; (ii) développer un essai sérologique à haut débit pour étudier les anticorps à différents coronavirus et estimer la prévalence des coronavirus chez différentes espèces de chauves-souris et (iii) étudier la saisonnalité de l’excrétion de coronavirus chez les chauves-souris.

Par nos études antérieures menées en Guinée, au Cameroun, en République démocratique du Congo (RDC) et Zimbabwe, nous avons déjà des échantillons de >10 000 chauves-souris dans leur habitat naturel disponibles (sang sur papier buvard, écouvillons oraux et anaux et échantillons fécaux. Le dépistage rétrospectif de la présence de coronavirus se fera en amplifiant et en séquençant un fragment de 440bp de RdRp. Sur un sous-ensemble d’échantillons, des efforts supplémentaires de séquence seront faits pour obtenir des séquences dans les gènes qui sont importants pour les essais sérologiques (gènes S et/ou N) ou des génomes complets en utilisant la technologie MinION. Nous utiliserons un essai sérologique à haut débit (approche Luminex) pour détecter les anticorps contre les coronavirus (SRAS-CoV1, SRAS-CoV2, MERSV, ..). Des échantillons provenant de colonies de chauves-souris au Cameroun et Guinée, prélevés au cours d’un suivi mensuel sur une période d’un an seront analysés pour la présence d’ARN viral et pour les anticorps dans les échantillons de DBS pour documenter la saisonnalité de l’excrétion virale dans différentes espèces.

Dans l’ensemble, cette étude fournira rapidement des informations clés sur la diversité génétique des coronavirus chez les chauves-souris en Afrique et des estimations sur leur prévalence. Il s’agit de la première étude à grande échelle en Afrique qui utilisera les mêmes techniques moléculaires et sérologiques afin de pouvoir comparer les résultats par région géographique et par espèce. L’étude apportera des informations importants sur la proportion de chauves souris qui excrètent le virus, ceux qui ont éte infécté et sur les saisons qui sont les plus à risque pour les transmissions zoonotiques. Les informations obtenues par ce projet contribueront également à l’élaboration d’une plate-forme diagnostique qui peut inclure un panel d’antigènes couvrant autant que possible la diversité des coronavirus pour identifier rapidement la circulation des nouveaux coronavirus chez l’homme ainsi que le développement de vaccins à large spectre. De même, des renseignements supplémentaires sur les cibles des médicaments antiviraux pour une grande diversité de coronavirus ayant un potentiel zoonotique seront utiles pour identifier l’activité des antiviraux.

Contexte: L’infection chronique par le virus de l’hépatite C (VHC) est la principale cause de développement de la maladie hépatique, de la cirrhose ainsi que du cancer du foie (carcinome hépatocellulaire (CHC) dans le monde. Il existe aujourd’hui des antiviraux capables de guérir l’infection chronique par le VHC, les antiviraux à action directe (AAD). Cependant, les stratégies thérapeutiques pour éviter la progression de la maladie hépatique et du CHC sont absentes, ce qui est problématique puisque l’éradication du virus n’empêche pas le risque de la progression de la maladie hépatique surtout chez les patients ayant développé une fibrose avancée. Les stratégies thérapeutiques pour éviter ou soigner la maladie hépatique ainsi que le CHC sont insuffisantes, ceci étant due à la mauvaise connaissance de la complexité de la maladie.  De ce fait, l’identification de gènes associés au développement du CHC est essentielle afin de caractériser la progression de la maladie hépatique et du CHC et pour identifier des cibles thérapeutiques pour éviter et soigner le CHC.

Résultats préliminaires: En utilisant une signature d’expression génique de 186 gènes permettant de prédire le risque de développer un CHC dans un modèle cellulaire que nous avons développé, nous avons découvert que la protéine transmembranaire Claudin-1 (CLDN1) est un gène important pour la carcinogénèse hépatique dont le mécanisme reste encore peu connu. De plus, les changements induis par CLDN1 au niveau transcriptionnel peuvent êtres réprimés en utilisant un anticorps monoclonal spécifique anti-CLDN1 développé par notre équipe.

Objectifs: En se basant sur le risqué élevé de développer une maladie hépatique et ainsi qu’un CHC chez les patients infectés par le VHC et considérant la nécessité de comprendre les gènes et voies de signalisations impliqués dans le processus, nous aimerions déterminer les mécanismes moléculaires d’action induis par CLDN1 qui favorisent la carcinogénèse hépatique.

Méthodes: Pour comprendre comment une protéine membranaire telle que CLDN1 peut induire des changements transcriptionnel, nous devons déterminer les sont les voies de signalisations impliquées. Afin de répondre à cette question, nous aimerions identifier les protéines qui interagissent avec CLDN1 au niveau de la membrane basolatérale de l’hépatocyte par co-immunoprécipitation. Aussi, nous aimerions identifier le domaine protéique de CLDN1 impliqué dans la signalisation induite par CLDN1. Pour ce faire, nous allons générer des mutants de CLDN1 qui vont être utilisés pour établir des lignées cellulaires hépatiques portant une inactivation génique pour CLDN1. Ces cellules vont être utilisées pour étudier l’effet de l’inactivation de CLDN1 sur l’expression de la signature génique des 186 gènes mais également sur les voies de signalisation cellulaire impliquées dans le CHC ainsi que la transition épithélio-mésenchymateuse (TEM) des cellules. Pour déterminer si les voies de signalisation Ephrin et Hedgehog sont impliquées, nous allons effectuer des analyses immunoblots sur des foies de souris traités avec l’anticorps monoclonal spécifique anti-CLDN1 en plus d’un anticorps contrôle. De plus, nous allons également étudier l’effect de l’environemment tumorale hépatique en générant des sphères de tumeurs ou «tumorspheres» à partir de tissus hépatiques humains, tumoraux ou adjacent à la tumeur et préalablement traités avec l’anticorps monoclonal spécifique anti-CLDN1 ou avec l’anticorps contrôle, provenant de patients ayant développé un CHC. Ces sphères seront analysées par RNA-Seq. En dernier lieu, afin de déterminer le role de CLDN1 dans la TEM des cellules, nous allons évaluer par immunoblot et PCR quantitative l’expression de marqueurs spécique de la TEM in dans des cellules préalablement traitées avec l’anticorps monoclonal spécifique anti-CLDN1 ou avec l’anticorps contrôle.

Résultats attendus: Nous anticipons de découvrir les mécanismes moléculaires d’action de CLDN1 la carcinogénèse hépatique. De plus les résultats de cette étude vont permettre l’identification de cibles thérapeutiques pour traiter la maladie hépatique ainsi que le CHC ainsi par l’infection par le VHC.

Le virus de l’hépatite E (HEV) est le 1er agent viral d’hépatite à l’échelle mondiale. Il peut être responsable d’une hépatite E chronique, définie par la persistance du virus pendant plus de 3 mois, chez les patients immunodéprimés. Des virus recombinants ayant incorporé des fragments de gène humain dans la région riche en proline (PPR) de leur génome ont été décrits au cours des infections chroniques. Ces fragments de gène humain possédaient une origine variée : protéine ribosomale S17, S19, tyrosine aminotransférase, inter alpha trypsine inhibiteur et favorisaient la réplication du HEV in vitro. Les mécanismes conduisant à cet avantage réplicatif comparativement au virus dépourvu du fragment humain sont actuellement inconnus.

L’objectif de ce projet est d’étudier le(s) mécanisme(s) conférant un avantage réplicatif aux virus recombinants ayant incorporé un fragment de gène humain.

 Dans la première partie de ce projet (semestre 1 et 2), nous allons étudier l’impact de 7 fragments humains récemment identifiés par notre équipe à l’aide d’une technique de séquençage haut-débit (SMRT PacBio). Les différents fragments seront insérés dans la PPR du plasmide codant pour le virus Kernow, principale souche de laboratoire utilisée pour l’étude du HEV. Le plasmide Kernow sans fragment humain sera utilisé comme contrôle. Après transcription in vitro, l’ARN obtenu sera transfecté dans la lignée cellulaire hépatique HepG2/C3A. Le stock viral obtenu après transfection sera utilisé pour infecter la lignée cellulaire hépatique HepG2/C3A. La capacité réplicative de chaque virus recombinant sera évaluée par quantification par RT-qPCR de l’ARN viral dans le surnageant de culture. Le nombre de foyers infectieux à J5 sera déterminé par immunofluorescence. Ces résultats seront confirmés sur des cellules d’hépatocytes primaires. L’impact de ces fragments humains sur le franchissement de la barrière d’espèce sera également étudié en introduisant ces fragments de gène humain dans une souche de génotype 1, génotype strictement humain. La capacité de ces virus recombinant à infecter des lignées cellulaires animale LLC-PK (rein de porc) et OHH1.Li (foie de biche) sera étudiée.

La deuxième partie de ce projet (semestre 3 et 4) vise à identifier les protéines interagissant avec la PPR. La région codant pour la PPR des virus recombinants possédant un avantage réplicatif sera amplifiée en utilisant une amorce permettant d’ajouter un tag HA et introduite dans un vecteur d’expression. Le plasmide sera ensuite transfecté dans la lignée cellulaire HepG2C3A. La protéine PPR sera concentrée par immunoprécipitation à l’aide de billes magnétiques coatés avec un anticorps anti-HA. Les protéines interagissant avec la PPR seront séparées par migration sur un gel SDS-PAGE et identifiées par spectrométrie de masse. L’identité des partenaires d’interaction sera confirmée par des approches de knock-down et surexpression pour mettre en évidence la perte/le gain d’avantage réplicatif en l’absence ou en présence de la cible de la PPR.

Ce projet permettra :

• de décrire le rôle de la PPR dans le cycle de réplication du HEV
• de déterminer l’impact de ces fragments humains dans le franchissement de la barrière d’espèce
• de préciser les mécanismes conduisant à l’amélioration de la capacité réplicative du HEV en présence de fragments de gènes humains.

            La vaccination fait partie des moyens de prévention de certaines infections sexuellement transmissibles proposés aux hommes ayant des relations sexuelles avec des hommes (HSH). En raison des risques auxquels ils sont exposés, les recommandations vaccinales françaises préconisent que les HSH se vaccinent contre l’hépatite B, l’hépatite A et, pour les moins de 26 ans, contre les infections à papillomavirus humains (PVH). Les données de couvertures vaccinales et les études sur les déterminants du recours à la vaccination chez les HSH sont peu nombreuses en France, pays par ailleurs caractérisé par une défiance de la population générale envers les vaccins, alimentée par des controverses multiples.

     L’objectif principal de ce projet est de mieux comprendre les freins et leviers du recours à la vaccination chez les HSH en France. Il porte plus spécifiquement sur les vaccinations contre l’hépatite A, l’hépatite B et les infections à PVH. Les objectifs secondaires sont : 1) d’estimer les couvertures vaccinales déclarées pour ces trois vaccins et, parmi les personnes non vaccinées, la prévalence de l’intention de se faire vacciner ; 2) d’estimer la prévalence de l’hésitation vaccinale (i.e., avoir déjà refusé, retardé ou accepté un vaccin tout en ayant des doutes sur cette vaccination) dans cette population, la part des personnes hésitant vis-à-vis des trois vaccins considérés dans cette étude, et les motifs de cette hésitation ; 3) d’étudier les facteurs associés au fait d’être vacciné (ou d’avoir l’intention de se faire vacciner) et à l’hésitation vaccinale liée spécifiquement à ces trois vaccins, en s’intéressant plus particulièrement : i) à certaines connaissances, croyances et perceptions (vis-à-vis des vaccins, de la prévention diversifiée du VIH…) ; ii) aux antécédents médicaux et aux pratiques sexuelles ; iii) aux facteurs liés au système et aux professionnels de santé ; iv) aux caractéristiques démographiques, économiques et sociales ; v) au niveau de confiance accordé aux autorités de santé et à la médecine conventionnelle et au degré d’implication des individus dans les décisions de santé.

     Ce projet sera mené par une équipe pluridisciplinaire incluant des chercheurs en santé publique, en sociologie et des experts de Santé publique France.

     Ce projet repose sur une méthodologie innovante associant 1) une enquête quantitative administrée sur support digital (sites de rencontre gay sur internet, réseaux sociaux…) auprès d’environ 15 000 à 18 000 personnes, selon le retour d’expérience de précédentes enquêtes de ce type ; 2) une enquête qualitative par entretiens individuels semi-directifs menés auprès d’une trentaine de personnes ayant répondu à l’enquête quantitative ; 3) un recueil de données issues des carnets de vaccination auprès d’environ 800 personnes ayant répondu à l’enquête quantitative, ceci afin d’estimer la qualité des données déclarées de comportement de vaccination ou non. Ce projet sera réalisé sur une période de 36 mois. La 1ère année sera consacrée à l’élaboration du questionnaire de l’enquête quantitative et des demandes d’autorisations, à la définition de la stratégie de diffusion du questionnaire et à la réalisation d’une enquête pilote auprès d’une trentaine de personnes. La 2ème année du projet sera consacrée à la collecte des données quantitatives et qualitatives et à la préparation des bases de données. La 3ème année sera consacrée à la réalisation des analyses statistiques, à l’analyse des entretiens qualitatifs et à la valorisation des résultats de l’enquête.

     Les résultats de ce projet devraient permettre d’avoir une meilleure connaissance et compréhension des comportements et des processus de décisions vis-à-vis de la vaccination contre les hépatites B et A et contre les PVH parmi les HSH en France. Ces résultats sont essentiels pour guider les décisions et les choix des pouvoirs publics, des professionnels de santé et des acteurs impliqués dans la prévention auprès de ce public, en matière de stratégies d’intervention et de contenu des actions afin de promouvoir et faciliter l’accès à ces vaccins en tenant compte des besoins et attentes des personnes.