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Objectifs : Ce projet s’inscrit dans le cadre de l’essai SMILE, une étude multicentrique ouverte de phase 2/3, randomisée, évaluant l’innocuité et l’effet antiviral d’un inhibiteur de l’intégrase le dolutegravir associé au darunavir/ritonavir (DRV/r) versus une trithérapie antirétrovirale classique ininterrompue. Trois cents enfants infectés par le VIH-1 et contrôlé d’un point de vue virologique depuis au moins 1 an (ARN du VIH-1 <50 c / mL) ont été inclus en Europe occidentale et orientale, Afrique du Sud, Thaïlande, Ouganda et d’Amérique latine. Les buts de ce volet complémentaire seront de décrire la pharmacocinétique du dolutegravir et du darunavir ainsi que leur forme libre (active) dans une large population d’enfants, afin de comprendre les facteurs à l’origine de la variabilité interindividuelle et de déterminer la posologie optimale pour chaque enfant. Nous vérifierons également si l’interaction décrite entre dolutegravir et darunavir ne modifie pas significativement les concentrations de ces composés. Nous tenterons de relier ces concentrations à la charge virale des enfants. Ces résultats seront importants pour le traitement des enfants, compte tenu de la place que prennent ces 2 molécules.

Situation du sujet : La pharmacocinétique du dolutégravir n’a été établie que dans 2 études (IMPACTP1093 et Odyssey), soit chez 10 et 26 enfants, ce qui ne permet pas d’évaluer et d’expliquer la variabilité interindividuelle. De plus, le darunavir est donné en une prise par jour chez des enfants de 6 à 12 ans suite à des simulations mais cette dose n’a jusqu’ici jamais été administrée à l’enfant dans un essai clinique. Aucune donnée concernant la forme libre, forme active de la molécule, n’a été rapportée ni pour le darunavir, ni pour le dolutegravir chez l’enfant. Une interaction pharmacocinétique a été montrée entre ces 2 molécules mais ne semble pas avoir d’impact clinique chez l’adulte.

Problématique : Nos hypothèses de travail sont que i) la variabilité interindividuelle des concentrations chez l’enfant peut être expliquée par des facteurs comme le poids, l’âge, la bilirubine, ii) la posologie optimale peut être déterminée en fonction de ces facteurs  ii) les variations de niveau de protéines plasmatiques de l’enfant modifient la fraction libre, active de médicament et celle-ci peut être relié à l’issu virologique du traitement iii) l’impact de l’interaction pharmacocinétique entre le darunavir et le dolutegravir peut être négligé.    

Méthode : Un ou 2 prélèvements de sang sont prévus aux semaines 4, 12 et 24 de traitement, les concentrations d’antirétroviraux de la forme totale et de la forme libre seront dosées par LC-MS/MS. Les données de concentrations seront analysées selon une approche de population. Le lien entre la détectabilité de la charge virale et les expositions (forme libre) à toutes les molécules prises par le patient sera étudié grâce à une régression logistique.  

Echéancier des travaux : Le rendu des analyses se fera d’ici septembre 2021.

Résultats attendus : Ce travail permettra de décrire la pharmacocinétique du dolutegravir et du darunavir ainsi que leur forme libre (active) chez 150 enfants, nous tenterons de relier ces concentrations à la charge virale des enfants. Nous déterminerons la posologie optimale de darunavir et de dolutegravir à administrer quel que soit l’âge, le poids de l’enfant.

La méthode RDS (« respondent-driven sampling » ou échantillonnage dirigé par les répondants) est une méthode de recrutement basée sur les pairs.  Des personnes de la population d’intérêt y recrutent des individus de la même population en cascade sur plusieurs vagues de recrutement. Cette méthode permet d’atteindre des populations difficiles d’accès par des moyens traditionnels pour des raisons sociales et/ou discriminatoires.

Les études utilisant le recrutement RDS dans l’objectif d’estimer la prévalence du VIH portent sur des populations clefs dites à « hauts risques », difficiles à étudier comme : la population trans, les travailleurs du sexe et les hommes qui ont des rapports avec des hommes (HSH) et plus récemment, les jeunes HSH en France. La mise en place de stratégies de prévention combinées incluant la prophylaxie de pré-exposition (PrEP) est complexe dans ces populations. De nombreuses méthodes de recrutement ont été testées s’appuyant sur le recours aux associations et aux réseaux de soins. Cependant, la RDS n’a jamais été évaluée dans un objectif d’implémentation d’un programme de prévention.

Au Brésil, où la population HSH reste discriminée, une étude RDS dans 12 grandes villes brésiliennes en 2016 a montré la prévalence toujours élevée de l’infection à VIH. Mais lorsque la PrEP a été introduite, en 2017, on a plutôt eu recours à la constitution de cohortes d’HSH avec un recrutement « classique » par le biais d’institutions, comme dans l’étude « Combina » réalisée dans 5 grandes villes brésiliennes. Dans ces cohortes, les participants sont venus d’eux même en consultation dans le but précis de prendre la PrEP : Il est probable que leurs caractéristiques diffèrent de celles qu’aurait permis un recrutement RDS démarré grâce à des individus issus de populations difficiles d’accès par les canaux traditionnels.

Notre hypothèse est que le profil des populations de ces cohortes « classiques » diffère des populations recrutées par RDS, de par leurs critères socio-démographiques et comportementaux. L’utilité d’une approche RDS en tant que stratégie de recrutement dans un programme de prévention combinée n’est pas formalisée et son impact potentiel sur l’épidémie de VIH méconnu.

L’objectif du travail sera de comparer les caractéristiques des personnes recrutées dans Combina, une cohorte « classique », à celui des personnes recrutées dans une étude RDS dans les mêmes villes brésiliennes et à la même période. Les étapes suivantes seront nécessaires afin de permettre un travail joint des équipes brésiliennes et françaises à partir des données brésiliennes: 1) la traduction en Anglais des questionnaires permettant d’avoir une base commune ; 2) L’identification de variables socio-démographiques et de comportement recueillies conjointement dans Combina et dans l’étude RDS de 2016 permettant une comparaison directe les populations ; 3) l’alignement des variables qui diffèrent entre les questionnaires mais explorent des entités comparables afin d’augmenter l’information disponible; 4) finalement une analyse quantitative des résultats entre les deux enquêtes.

Les résultats obtenus permettront l’écriture d’un projet portant sur l’implémentation d’études RDS interventionnelles au Brésil ainsi qu’à un projet de modélisation et simulation de l’impact du recrutement RDS dans l’implémentation de mesures de prévention combinées. Il permettra également une réflexion sur la transposabilité de ces approches en contrastant avec les caractéristiques de cohortes et RDS actuellement en cours en France.

Le projet entre dans la continuation d’une collaboration France-Brésil. Il implique des équipes brésiliennes qui ont mis en place et analysés les deux dernières enquêtes RDS de grande envergure au Brésil, ainsi que le programme Combina. L’équipe française est spécialisée dans l’analyses de données et la modélisation de l’impact d’intervention sur des processus épidémiques. Ils ont également une connaissance approfondie des outils d’analyse des enquêtes RDS et sont à l’origine de la première étude française combinant le recrutement RDS à un programme de prévention combiné (ANRS-TRUST).

Le virus de l'hépatite B (VHB) est l'un des agents pathogènes humains les plus graves : environ 250 millions de personnes souffrent d'hépatite B chronique et environ 800 000 en meurent chaque année. Le VHB est un virus enveloppé avec une nucléocapside icosaédrique contenant de l'ADN partiellement double brin (rcDNA). Le composant élémentaire de la capside est un dimère de la protéine Core de 183 résidus (ou 185 selon le génotype): les 149 résidus N-terminaux (Cp149) constituent le domaine d'assemblage qui peut s'auto-assembler in vivo et in vitro en capsides icosaédriques avec principalement une triangulation T = 4 (120 dimères). Les 34 (ou 36) acides aminés restants, riches en arginine, constituent le domaine C-terminal (CTD) qui est essentiel pour l'encapsidation de l'ARN viral prégénomique (pgRNA) par Core. Le CTD peut être phosphorylé jusqu'à 7 fois in vivo, mais seuls trois sites de phosphorylation sont nécessaires à l'encapsidation. Un mutant recombinant de Core a été conçu pour imiter ce scénario en remplaçant les trois sérines clés par des glutamates (Cp183-EEE). Enfin, des molécules qui perturbent l'assemblage de la capside (CAMs pour capsid assembly modulators) en interférant avec les contacts entre les dimères de Core sont de puissants inhibiteurs in vitro de la réplication du VHB et de nouvelles options potentielles de médicaments anti-VHB. Des études in tubo sur la Cp149 ont révélé les modes d'action potentiels des CAMs. Les CAMs semblent agir soit en favorisant l'assemblage, conduisant à la formation de capsides vides (CAM-E), soit en les détournant de la voie d'assemblage, conduisant à des capsides malformées et aberrantes (CAM-A). Certains CAM ont également démontré des effets supplémentaires in vitro, y compris la perturbation de capsides déjà formées et la diminution de l'ADN viral nucléaire (cccDNA).

Nous proposons ici de capitaliser sur notre méthodologie biophysique et structurale originale, qui combine la physique des objets biologiques et la virologie structurale, pour clarifier le mode d'action d'une nouvelle série prometteuse de CAMs basée sur le composé à squelette glyoxamide GLP-26 (Amblard et al, 2020, 2023). Notre méthodologie combine la diffusion des rayons X aux petits angles (SAXS) sur des sources synchrotron et la cryo-microscopie électronique (cryo-EM), y compris des études résolues en temps. Nous l'avons validée avec la caractérisation de deux composés CAM-A et CAM-E prototypiques (Kra et al, 2023). Dans ce projet suite, nous étendrons la méthodologie d’une part à la photométrie de masse, une technique en molécule unique, d’autre part à la modélisation structurale des données SAXS grâce à des simulations Monte Carlo et l'apprentissage automatique. Cette méthodologie modifiée permettra de travailler dans des conditions moins artificielles que celles utilisées jusqu'à présent dans la biophysique de Core. Ainsi des concentrations particulièrement faibles de Core seront utilisées, dans lesquelles il est possible de différencier les comportements d'assemblage de Cp149 et de Cp183/Cp183-EEE, en particulier en présence de CAMs. L'accent sera mis sur deux séries distinctes de CAMs dérivés de GLP-26 : d’une part la forme active d’un dérivé actuellement en essais cliniques, ALG-00184 ; d’autre part des dérivés à double tête GLP-26 (D-CAMs), dont nous venons de montrer qu'ils ont des effets atypiques sur l'assemblage de la capside (Amblard et al., en révision), effets qui doivent être clarifiés.

Titre du projet : Caractérisation des sites d’intégration du génome du VIH-2 dans le génome humain

L’intégration du génome du VIH sous sa forme ADN proviral dans le génome des cellules cibles infectées constitue un réservoir viral persistant à vie, capable de réactiver en quelques jours la réplication virale en cas de baisse de la pression thérapeutique. De façon remarquable, l’infection par le VIH-2, dont l’épidémie concerne principalement l’Afrique de l’Ouest, est caractérisée par une évolution naturelle atténuée par rapport au VIH-1 et environ 70% des patients présentent spontanément une charge virale plasmatique indétectable en absence de traitement antirétroviral, avec des niveaux d’ADN proviral réservoir très faibles.

L’infection par le VIH-2 constitue donc un modèle d’infection rétrovirale naturellement atténuée, dont la maîtrise des déterminants viraux et immunologiques de la latence et du contrôle de la réplication virale serait d’une grande valeur dans la lutte contre la pandémie. Or dans l’infection par le VIH-1, une récente publication chez 13 patients Elite Controllers, qui maintiennent une charge virale indétectable sans antirétroviraux, a décrit une distribution très particulière des sites d’intégration virale, orientée vers les régions non ou peu exprimées du génome humain.

Objectif principal : Mise au point de l’approche expérimentale de séquençage des sites d’intégration (capture-enrichissement/NGS et amplification ciblée PCIP-Seq LTR-linker) adaptée au contexte de faible charge provirale du VIH-2 dans les échantillons cliniques.

Objectifs secondaires : cartographie des sites d’intégration du VIH-2 dans le génome humain à partir d’infections de cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) in vitro et d’échantillons cliniques de la cohorte française ANRS I MIE CO5 VIH-2 ; comparaison des sites d’intégration aux données disponibles pour le VIH-1 ; reconstruction des génomes viraux associés aux sites d’intégration.

Type d’étude et population : L’approche technique sera validée en deux temps : d’abord sur cellules infectées in vitro, puis sur des échantillons cliniques de PBMC. Dans la cohorte ANRS I MIE CO5 VIH-2, l’étude sera transversale rétrospective pour caractériser les sites d’intégration virale et la séquence provirale dans des échantillons de PBMC conservés chez des participants non traités avec une charge virale indétectable (nous inclurons 10 infections VIH-2 de groupe A + 10 infections VIH-2 de groupe B).

La cohorte nationale ANRS I MIE CO5 VIH-2, mise en place depuis 1994 est coordonnée au plan virologique par le service de virologie de l’hôpital Bichat-Claude Bernard (Pr Diane Descamps) et représente une opportunité unique de travail sur cette thématique grâce à une large collection d’échantillons biologiques (PI : Pr Jade Ghosn).

Résultats attendus : la mise en place de ces techniques au laboratoire permettra de décrire pour la première fois les sites d’intégration du VIH-2 dans le génome humain, de les comparer aux sites d’intégration du VIH-1 et de rechercher une distribution particulière dans les zones non-géniques, non-codantes ou réprimées. La valorisation des cellulothèques de la cohorte CO5 VIH-2 permettra d’inclure un nombre significatif d’échantillons cliniques et ces nouvelles approches moléculaires associées au séquençage en NGS permettront de coupler les données de site d’intégration et de séquence virale. L’analyse de ces éléments permettra une meilleure compréhension des mécanismes pouvant participer au caractère atténué de l’infection VIH-2.

La primoinfection de l’enfant a lieu en contexte d’immaturité du système immunitaire. Son évolution naturelle est bimodale : en l’absence de traitement antirétroviral, environ 15% des enfants infectés par le VIH-1 en période périnatale présentent une évolution rapide vers le stade SIDA et un risque élevé de décès avant 3 à 4 ans. Une multithérapie instaurée dans les premiers mois de vie réduit considérablement la mortalité. Fait notable, le bénéfice clinique d’un traitement précoce perdure après l’arrêt des traitements, avec la disparition de la forme clinique rapide et sévère pour les enfants traités. L’initiation du traitement antirétroviral pendant la primo-infection peut conduire à un contrôle virologique pendant plusieurs années chez l’adulte. Plusieurs cas de contrôle post-traitement ont été décrits suite à une infection en période périnatale traitée précocement.

Le traitement précoce des nourrissons induit donc un équilibre beaucoup plus favorable entre l’hôte et le virus, avec un bénéfice clinique lors d’interruptions thérapeutiques. Le succès du traitement précoce est d’autant plus important que la situation d’échec virologique après un succès initial est fréquente dans la population infectée en période périnatale.

L’objectif du projet est de documenter les aspects physiopathologiques du traitement précoce en étudiant la reconstitution immunitaire qualitative, l’activation immunologique, l’immunité cellulaire adaptative et innée et le réservoir viral.

L’étude CLEAC est une enquête transversale multicentrique au sein de la file active des enfants infectés par le VIH-1, suivis dans les services franciliens participant à la cohorte ANRS-CO10-EPF consistant à effectuer des prélèvements sanguins couplés aux prises de sang réalisées dans le cadre du suivi biologique de routine, à visée d’explorations immuno-virologiques détaillées.

L’étude CLEAC cible des sujets âgés de 5 à 18 ans infectés par le VIH-1 par voie verticale dont le traitement antirétroviral a débuté avant l’âge de 6 mois (groupe « traitement précoce ») ou après l’âge de 24 mois (groupe « traitement tardif ») et avec un succès thérapeutique initial (obtention d’une virémie VIH-1 <400 copies/ml au plus tard 24 mois après l’instauration du traitement).

L’ANRS soutient ce projet et a accordé un financement partiel (AO 2015-2). Les inclusions dans l’étude CLEAC seront achevées le 31 mars 2018 et l’objectif sera atteint : 79 des 80 sujets prévus sont inclus au 1er mars 2018. Une analyse pilote des résultats déjà obtenus montre la pertinence des hypothèses initiales et  pointe deux nouveaux axes de recherche. La présente demande concerne la réalisation des tests évaluant :

• la polyfonctionnalité des lymphocytes T spécifiques du VIH,
• les marqueurs plasmatiques de l’activation immunitaire,
• les lymphocytes T « follicular helper » (TFH) et des lymphocytes B,
• l’ADN VIH-1 intégré,
• les caractéristiques virales (sous-type, génotropisme, sérologie).

Le bilan immuno-virologique détaillé de l’étude CLEAC chez des sujets dont l’histoire de l’infection par le VIH-1 est connue permettra de progresser dans la compréhension physiopathologique des interactions hôte/virus chez l’enfant et de l’impact de la période d’initiation du traitement antirétroviral.

Il permettra l’étude les caractéristiques immunologiques et virologiques d’enfants et d’adolescents chez qui pourrait être espéré un contrôle immuno-virologique lors de l’interruption ultérieure du traitement antirétroviral. En effet, le traitement précoce dans ce contexte pédiatrique pourrait favoriser l’accumulation de conditions nécessaires à une rémission.