Winning projects and candidates

Bien que le virus de l'hépatite E (HEV) soit la première cause d'hépatite aiguë dans le monde, et ait été classé très récemment par l'OMS dans la liste des pathogènes les plus à risque, son cycle infectieux est encore très mal caractérisé. Dans notre laboratoire, nous nous intéressons depuis plusieurs années à la protéine de capside du HEV, nommée ORF2. En effet, nous avons montré qu'au cours de son cycle infectieux, le HEV produit au moins 3 formes de sa protéine de capside ORF2 : l'ORF2 infectieuse (ORF2i), l'ORF2 glycosylée (ORF2g) et l'ORF2 clivée (ORF2c). Ces formes ORF2 remplissent des fonctions distinctes dans le cycle infectieux du HEV. La protéine ORF2i est le constituant structurel des particules infectieuses tandis que les protéines ORF2g/c ne sont pas associées à du matériel infectieux mais agissent probablement comme des leurres immunologiques. Les protéines ORF2g/c sont sécrétées en grandes quantités dans le surnageant de culture et sont les antigènes les plus abondants détectés dans le sérum des patients.

Récemment, nous avons étudié les mécanismes moléculaires et cellulaires impliqués dans la biogenèse, la localisation subcellulaire et les fonctions des différentes formes de l’ORF2. Nous avons notamment montré qu'au moment de la traduction, la protéine ORF2 est massivement transloquée dans la lumière du RE, par un processus dépendant du translocon. Elle suit ensuite la voie de sécrétion classique où elle subit des modifications post-traductionnelles (maturation des N-glycanes, O-glycosylation, sialylation et maturation par des protéases) pour générer les formes solubles ORF2g/c. L'ORF2i est quant à elle produite par une voie différente d'adressage puisqu'après traduction elle reste ancrée du côté cytosolique des membranes. En effet, nous avons montré qu'il existe un mécanisme de régulation fine de l'expression de l'ORF2 reposant sur la présence d'un motif présent à l'extrémité N-terminale de la protéine. Ce motif riche en résidus Arginine, nommé ARM, régulerait l'adressage subcellulaire des formes ORF2 en modulant la topologie et la fonctionnalité du peptide signal de l'ORF2.

De manière intéressante, nous avons obtenu des résultats préliminaires suggérant que la production de la protéine ORF2i pourrait être dépendante de l'EMC (ER-membrane complex), qui est un complexe impliqué dans la traduction, le repliement et l'insertion membranaire de certaines protéines cellulaires et virales. C'est pourquoi, dans ce projet de recherche, nous proposons de démontrer qu'en plus du translocon, l'EMC serait impliqué dans le processus de traduction de la protéine ORF2 en prenant en charge et en régulant l'intégration dans les membranes de la protéine ORF2i. Pour cela, différentes approches méthodologiques et expérimentales seront développées. Au-delà du mécanisme de traduction de la protéine ORF2 du HEV, nous proposons également d'analyser par profilage ribosomique (Ribo-seq) le traductome de cellules infectées ou non par le HEV afin d'établir une cartographie des modifications de l'expression des protéines cellulaires induites par l'infection, ainsi que des mécanismes de détournement de la machinerie cellulaire par le HEV.

Le développement de notre projet devrait apporter de nouvelles connaissances sur les mécanismes du cycle infectieux nécessaires à la lutte contre l'hépatite E ainsi que pour la compréhension générale des stratégies virales de détournement de la machinerie cellulaire.

Le complexe ribonucléoprotéique 7SK (7SKsnRNP) composé du petit ARN nucléaire non-codant 7SK et de protéines nucléaires, régule l’activité du facteur positif d’élongation de la transcription (P-TEFb), hétérodimère constitué d’une cycline T et de la kinase cycline-dépendante CDK9. P-TEFb est essentiel pour la transcription des ARN messagers par l’ARN polymérase chez les eucaryotes. L’assemblage 7SKsnRNP capture P-TEFb, inhibant ainsi son activité kinase indispensable à la levée des pauses de la transcription par l’ARN polymérase II (ARNpol II). Lorsque P-TEFb est libéré du complexe 7SKsnRNP, CDK9 phosphoryle le domaine C-terminal de l’ARNpol II ainsi que les répresseurs de transcription NELF et DSIF, restaurant ainsi la transcription par l’ARNpol II.

P-TEFb est un facteur cellulaire indispensable pour la régulation de la réplication du virus de l’immunodéficience humaine (VIH). Il joue un rôle essentiel dans l’initiation de la transcription chez le VIH-1. P-TEFb est recruté par la protéine virale Tat qui interagit avec la cycline T1 via son domaine d’activation, tandis que son domaine de liaison à l’ARN s’associe à l’ARN TAR (« trans-activating responsive ») localisé dans la région 5’ non traduite du génome viral. Des études biochimiques révèlent également que P-TEFb peut être présent dans trois complexes distincts. Le premier complexe est composé de P-TEFb et de la protéine Brd4 qui contient deux bromo-domaines se liant aux résidus lysines acétylés dans la chromatine. P-TEFb a également été trouvé associé au « Super Complexe d’Elongation » (SEC). Le troisième complexe contient P-TEFb et l’assemblage 7SKsnRNP. Tat peut capturer P-TEFb dans chacun de ces complexes.

Le complexe 7SKsnRNP contient trois protéines nucléaires dont HEXIM1 avec laquelle P-TEFb interagit de manière réversible. Tat est capable de déplacer la protéine HEXIM1 de l’ARN 7SK, provoquant ainsi la libération de P-TEFb. L’ARN 7SK régule ainsi indirectement la transcription de l’ARN du VIH en contrôlant la disponibilité de P-TEFb.

Dans le cadre du projet présenté, nous nous intéressons tout particulièrement au mécanisme fin d’interaction de l’ARN non codant 7SK avec Tat et HEXIM1. Ces deux protéines contiennent des motifs de liaison à l’ARN similaires (ARM : « Arginine Rich Motif »). Elles ciblent la même région de l’ARN 7SK mais avec des mécanismes d’interaction différents. Ceci est particulièrement intrigant : comment deux protéines comportant des domaines de liaison à l’ARN aussi similaires, peuvent-elles cibler le même ARN de manières distinctes ?

Afin de mieux comprendre les facteurs régissant ces interactions, nous proposons d’étudier les interactions HEXIM1/7SK et Tat/7SK en combinant des méthodes biophysiques et biochimiques. Nos objectifs sont de: (i) mesurer des données cinétiques et thermodynamiques pour comparer les interactions de 7SK avec Tat et HEXIM1 ; (ii) mesurer des données cinétiques et thermodynamiques du déplacement de HEXIM1 par Tat, (iii) analyser les changements conformationnels globaux de 7SK sous l’effet de l’interaction avec ses deux partenaires protéiques et (iv) élucider les structures des complexes par Cristallographie. Pour réaliser les mesures cinétiques et thermodynamiques, nous utiliserons la technologie « switchSENSE », ainsi que la titration calorimétrique isotherme (ITC). L’ITC est une technique utilisée pour mesurer les paramètres d’affinité (KD), et thermodynamiques d’interaction entre biomolécules (enthalpie et entropie), ainsi que la stoechiométrie (n). La technique « switchSENSE », nouvelle en France, permet l’analyse d’interactions entre molécules en temps réel et d’accéder à la mesure de constantes cinétiques d’association (kon), de dissociation (koff) et de la constante d’affinité KD, donc complémentaire de l’ITC. L’utilisation combinée de ces méthodes peut fournir une vue détaillée du mécanisme d’interaction entre biomolécules et ainsi, des données fondamentales sur la régulation l’activité de P-TEFb par l’ARN 7SK.

Une meilleure compréhension des facteurs régissant les interactions entre l’ARN 7SK et ses partenaires pourrait contribuer à obtenir des informations supplémentaires sur la réplication du VIH.

Avec la généralisation de la thérapie antirétrovirale maternelle pour prévenir la transmission mère-enfant (PTME), le nombre d’enfants exposés au VIH sans être infectés (HEU) continue à augmenter. Au cours des 10 dernières années, au moins 10 millions d’enfants HEU sont nés, atteignant jusqu’à 30% des nouveau-nés dans les pays à forte prévalence du VIH. Des études antérieures ont montré un risque accru de mortalité pour ces enfants par rapport aux enfants non exposés au VIH (HUU) vivant dans le même milieu. Cependant, cette augmentation de la mortalité était probablement due à une mauvaise santé maternelle et à l’absence d’allaitement maternel prolongé, la plupart des données disponibles à ce jour datant de l’ère pré-ART. L’étude proposée vise à répondre à certaines des questions restantes concernant la santé des enfants HEU, en utilisant les données individuelles de plus de 14 000 enfants HEU et de 11 000 enfants HUU en Afrique. Cet ensemble de données unique, créé dans le cadre des efforts précédents pour s’attaquer à la vulnérabilité des enfants HEU, sera complété par des données individuelles et agrégées pour permettre différentes approches statistiques. Plus spécifiquement, le projet vise à mieux comprendre l’association entre le traitement antirétroviral maternel, les pratiques d’allaitement maternel et la mortalité chez les nourrissons HEU ; à estimer le risque relatif de mortalité chez les enfants HEU par rapport aux enfants HUU ; à explorer les facteurs associés au ralentissement de la croissance linéaire/pondérale et à la vitesse de croissance des enfants HEU et à comparer ces résultats anthropométriques entre les enfants souffrant HEU et HUU ; et à quantifier au niveau populationnel la mortalité parmi les enfants HEU dans les 21 pays africains prioritaires pour l’ONUSIDA, compte tenu de la couverture en traitement antirétroviral maternel et des pratiques d’alimentation infantile adéquates. L’étude sera menée en partenariat étroit avec l’OMS et l’ONUSIDA afin de s’assurer que les conclusions de l’étude contribueront à l’agenda politique national et international.

Les virus responsables du SIDA, HIV-1 et HIV-2, ont développé des protéines dîtes auxiliaires afin d’échapper aux défenses immunitaires de l’hôte. Ces protéines virales inactivent les facteurs de restriction qui inhibent la réplication virale. Ainsi, Vpx, qui appartient à la lignée lentivirale HIV-2/SIVsmm, augmente l’infection virale en induisant la dégradation du facteur cellulaire SAMHD1. La dégradation de SAMHD1 ne permet pas d’expliquer l’ensemble des phénotypes associés à Vpx, ce qui nous a conduit à rechercher de nouvelles protéines cellulaires ciblées par cette protéine virale Vpx. Suite à un crible protéomique, nous avons identifié le complexe HUSH en tant que nouvelle cible de Vpx, un complexe composé des protéines Tasor, MPP8 et periphilin, et qui est impliqué dans la répression épigénétique de transgènes. Nos résultats montrent une diminution de l’expression de HUSH dans les cellules primaires et dans les cellules infectées par un virus HIV-2 qui exprime Vpx. Vpx interagit avec HUSH et induit sa dégradation par le protéasome, via le recrutement d’une ubiquitine ligase assemblée par DCAF1. De ce fait, Vpx est capable de réactiver des virus latents dans un modèle de latence, contrairement à des mutants de Vpx incapables d’assurer la dégradation de HUSH. De plus, nous avons montré que la fonction d’antagonisme de HUSH est spécifique de protéines virales issues de certaines espèces de singe. L’ensemble de nos résultats révèle que HUSH est un facteur de restriction au même titre que SAMHD1, actif dans les cellules T primaires CD4+ et contrecarré par Vpx.

Notre hypothèse est donc que HUSH représente un facteur additionnel clé de la latence virale chez les individus infectés par les virus HIV. Le projet présenté vise à étudier le rôle de la restriction HUSH dans la pathogénèse chez le patient. Dans cette optique, trois axes sont proposés :

1- Identification d’un peptide ou molécule qui induirait la dégradation de HUSH.

Le but ultime de cet axe est de tester si l’inactivation de HUSH peut permettre de réactiver des virus latents présents dans les cellules de patients infectés. Malheureusement, l’outil « Vpx » ne permet pas d’aborder cette question car le simple fait de « transfecter » ou « transduire » des cellules les active et réveille les virus indépendamment de la présence de toute protéine virale. Ainsi, mimer l’activité de Vpx avec un peptide ou molécule pourrait constituer une alternative pour valider nos conclusions sur des échantillons cliniques.

2- Etude de protéines Vpx issues de patients HIV-2 à différents stades de la maladie afin d’établir une corrélation potentielle entre l’inactivation de HUSH et la pathogénèse.

Nous faisons l’hypothèse que l’évolution de la maladie chez des patients infectés par le virus HIV-2 pourrait dépendre (entre autres) de variations au niveau des séquences de Vpx qui auraient un impact sur la dégradation de HUSH.

3- Etude d’une corrélation potentielle entre l’activité de HUSH et la virémie chez les patients infectés par HIV-1 ou HIV-2.

Nous proposons d’étudier s’il existe une corrélation entre l’activité de HUSH, mesurée via l’expression des gènes cibles de HUSH (dont l’expression est favorisée si HUSH est inactivée) et les taux d’ARN viral plasmatique (rapportés aux charges d’ADN viral intégré).

Nous espérons que l’ensemble de nos résultats permettra de caractériser le rôle de la restriction HUSH chez les patients infectés.

Malgré des efforts considérables, la tuberculose (TB) reste un problème majeur de santé publique. Il n’existe toujours pas de vaccin efficace contre la TB et des souches de Mycobacterium tuberculosis (MTB) multirésistantes aux antibiotiques, c’est-à-dire résistantes aux deux médicaments antituberculeux de première ligne, la rifampicine et l’isoniazide, continuent d’émerger. La TB sensible aux médicaments peut être guérie en associant jusqu’à 4 antibiotiques pendant 6 mois. Toutefois, il est plus difficile de guérir la TB multirésistante (MDR-TB) et ultrarésistante, qui nécessite jusqu’à deux ans de traitement avec des médicaments de deuxième et de troisième intention plus toxique et plus coûteux, souvent avec un succès limité. De nouvelles stratégies sont nécessaires de toute urgence pour prévenir l’émergence de la résistance aux antibiotiques, raccourcir la durée du traitement et limiter les effets secondaires. Outre le développement de médicaments antituberculeux “classiques” ciblant des facteurs clés de la physiologie de MTB, des approches dirigées contre l’hôte sont apparues comme une stratégie prometteuse pour compléter les antibiotiques existants ou à venir. MTB manipule les voies de signalisation de l’hôte pour affaiblir l’immunité innée et adaptative. Il pourrait donc être possible de reprogrammer le système immunitaire de l’hôte afin de mieux contrôler, voire de tuer, MTB. Les facteurs liés à l’hôte peuvent également influencer la pharmacocinétique et la pharmacodynamique des médicaments antimicrobiens, affectant ainsi leur efficacité et/ou leur toxicité. La combinaison d’antibiotiques avec des molécules ciblant l’hôte pour améliorer leur efficacité est donc très prometteuse pour améliorer le traitement des infections bactériennes, y compris la TB.

Nous proposons ici d’utiliser une combinaison d’approches immunologiques et d’imagerie à haut débit pour identifier des composés dirigés contre l’hôte qui pourraient améliorer l’efficacité des antibiotiques contre la TB.

Nos objectifs sont les suivants

1. i) Identifier des molécules qui pourraient améliorer l’efficacité de la bédaquiline et du linézolide, deux médicaments utilisés pour traiter des patients atteints de MDR-TB qui ne répondent pas au traitement ou de XDR-TB. Nous identifierons ces composés en criblant dans des macrophages humains infectés par MTB, une bibliothèque de composés approuvés par la Food and Drug Administration américaine ou testés dans des essais cliniques de phase I, à l’aide de la microscopie confocale automatisée à haut débit.
2. ii) Caractériser in vitro les mécanismes moléculaires des molécules les plus prometteuses identifiées ci-dessus.

Étant donné que ce projet identifiera de nouveaux facteurs de l’hôte et composés chimiques capables de potentialiser l’efficacité des antibiotiques, les résultats de ce projet auront un impact important et un potentiel translationnel élevé. Ils pourraient permettre le développement de stratégies innovantes pour combattre les infections bactériennes au-delà de la TB.