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La distribution mondiale et régionale du VIH-1 dépend de nombreux facteurs, tels que la prévalence du VIH-1, la mobilité des populations, les facteurs socio-économiques, les différentes souches virales et les différences d’accès au traitement antirétroviral et aux soins cliniques. Il est important de mieux comprendre la dynamique de l’épidémie de VIH-1, car elle sert de support aux recherches sur l’évolution du profil de l’épidémie et sur les implications potentielles pour le diagnostic, la prise en charge clinique et la santé publique.

Notre objectif est de retracer l’origine géographique de l’acquisition du VIH-1 pour les migrants en Europe du Sud, en utilisant les méthodes d’épidémiologie moléculaire les plus récentes. Nos objectifs sont:

– Réaliser des analyses phylogénétiques et phylogéographiques de l’acquisition du VIH-1 parmi les migrants de chaque pays participant (France, Grèce, Italie, Espagne et Portugal),

– Effectuer une analyse phylogénétique et phylogéographique globale de l’acquisition du VIH-1 chez les migrants au niveau européen,

– Évaluer les caractéristiques de la dynamique de transmission à travers la valeur ajoutée du séquençage à haut débit dans des chaînes de transmission spécifiques.

L’étude sera menée en utilisant toutes les données de séquences VIH-1 disponibles auprès des principaux centres de référence pour le VIH dans cinq pays européens participants et toutes les données accessibles au public dans le monde entier pour les sous-types et les formes recombinantes les plus répandus infectant les migrants. L’analyse sera basée sur des méthodes moléculaires pouvant fournir des estimations précises de l’origine la plus présumée de l’acquisition du VIH-1. Une combinaison de méthodes sera utilisée afin de tracer avec précision les caractéristiques spatiales de l’acquisition du VIH-1. Grâce au grand nombre de patients (n = 47039) qui seront inclus dans cette étude et provenant de pays à prévalence élevée du sud de l’Europe et compte tenu du nombre croissant de réfugiés en provenance d’Afrique du Nord et du Moyen-Orient, qui présentent l’une des plus fortes augmentations de nouvelles infections par le VIH au cours des dernières années, les résultats issus de ce projet fourniront de nouvelles informations sur les caractéristiques d’acquisition et de dispersion de l’infection VIH-1 parmi les migrants. Ces données obtenues grâce à des outils innovants auront un impact sur la prévention, les stratégies de dépistage et la prise en charge clinique du VIH.

CALENDRIER: juillet 2020 – décembre 2020: collecte des séquences et des données cliniques; janvier 2021 – décembre 2021: analyse phylogénétique; janvier 2022- décembre 2022: séquençage UDS, analyse phylogénétique et statistique UDS; janvier 2023 – juin 2023: valorisation des résultats (soumission de résumé aux congrès, publication).

Le virus de l’immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1) se procure son enveloppe lipidique par bourgeonnement de la membrane plasmique des cellules hôtes infectées. Plusieurs études ont montré que la membrane du VIH-1 diffère de la membrane cellulaire de l’hôte, notamment en étant enrichie en lipides spécifiques tels que la sphingomyéline (SM) et la phosphatidylsérine. Ceci suggère que les virus bourgeonnent de la membrane hôte à partir de sous-domaines, existants ou induits. La composante minimale requise pour l’assemblage du VIH-1 à la membrane plasmique est la protéine virale Gag, car son expression est suffisante pour promouvoir la formation de particules de type viral dont l’enveloppe lipidique est dérivée de la membrane de la cellule hôte. La liaison de Gag à la membrane plasmique dépend du phosphatidylinositol 4,5-bis phosphate (PI(4,5)P2), lipide chargé négativement. Dans la membrane plasmique de cellules de mammifères, les lipides sont distribués de façon asymétrique, ainsi PI(4,5)P2 et PS sont dans le feuillet interne alors que SM et Chol forment des domaines caractéristiques dans le feuillet externe. L’une des questions essentielles concernant l’assemblage du VIH-1 est de savoir comment la liaison de Gag au PI(4,5)P2 du feuillet interne recrute les domaines riches en SM du feuillet externe. Dans ce projet, notre objectif est de déchiffrer les mécanismes moléculaires de la sélection par Gag de son environnement lipidique spécifique à la membrane plasmique des cellules hôtes.

    Nous avons développé des peptides/protéines originaux qui lient des lipides spécifiques, ainsi que de petites molécules fluorescentes pour suivre les propriétés physiques des biomembranes. Ces outils seront utilisés pour étudier la distribution des lipides et les propriétés physiques de la membrane lors de l’assemblage de Gag, à l’aide de techniques de microscopie avancées telles que la microscopie à super-résolution et la microscopie électronique, en combinaison avec des expériences de génétique et de biologie cellulaire. Ce projet comprend trois objectifs principaux :

1) Déterminer l’environnement lipidique autour de Gag dans la membrane plasmique. En utilisant des cellules fixées, nous examinerons la répartition détaillée de divers lipides dans la membrane plasmique lorsque Gag se lie à la membrane plasmique des cellules HeLa. Ceci permettra de clarifier l’existence d’un milieu lipidique défini autour de Gag.

2) Rechercher de quelle manière les lipides sont recrutés autour de Gag lors de son assemblage. En utilisant des cellules vivantes, nous étudierons la dynamique des domaines lipidiques et les propriétés physiques locales de la membrane lors de l’assemblage de Gag. Ceci permettra de clarifier comment sont recrutés les lipides autour de Gag et si leur redistribution induit des propriétés physiques particulières de la membrane.

3) Examiner les effets de manipulation génétique des lipides de l’hôte et de molécules perturbant les domaines lipidiques sur l’environnement lipidique de Gag et sur son assemblage. Nous examinerons ainsi l’impact de la manipulation génétique de la composition en acides gras des lipides et de petits composés altérant les domaines lipidiques sur la liaison de Gag à la membrane plasmique et la composition lipidique de son environnement. Cela permettra de mieux comprendre les mécanismes moléculaires du recrutement des lipides par Gag.

Cette étude devrait permettre d’identifier des cibles lipidiques pour une thérapie anti-VIH. La rapidité de la mutagenèse virale et l’émergence de souches résistantes représentent un enjeu majeur pour l’efficacité des médicaments utilisés en tri-thérapie. Le ciblage des lipides de l’hôte qui ne sont pas affectés par les mutations du virus pourrait s’avérer être une approche originale pour développer de nouveaux médicaments anti-VIH permettant de surmonter ces limitations.

La latence provirale liée à la répression du LTR5′ est considérée comme un état viral silencieux. Or, il est maintenant démontré qu’en plus d’une transcription sens, le VIH-1 possède une transcription antisens et que in vitro, ces transcrits antisens répriment le LTR5′ et freinent sa réactivation. De plus, des données suggèrent que ces transcrits agissent comme des lncRNAs. Notre hypothèse est que les transcrits antisens du VIH-1 pourraient ainsi contribuer à l’établissement et/ou au maintien de la latence chez les personnes vivant avec le VIH-1 (PVVIH) mais également agir sur le lymphocyte T infecté. Dans ce cadre, notre objectif global est de caractériser l’expression in vivo et l’impact des transcrits antisens selon les objectifs spécifiques suivants:

Objectif 1: Quantification des transcrits antisens totaux chez les PVVIH Nous avons déjà valider les RT-PCR spécifiques des transcrits antisens totaux ou du transcrit sens Gag/Pol. Nous déterminerons les niveaux relatifs (RTqPCR) et nombre de copies (PCR digitale) de ces transcrits dans 2 séries de 30 PVVIH présentant une réplication virale active (encore non traités) ou une infection latente (thérapie antirétrivirale). Les valeurs seront normalisées sur le nombre de copies d’ADN total VIH ou d’ADN viral intégré. L’INSERM est promoteur de cette partie pour laquelle le Pr JP Viard (Hôtel-Dieu) est investigateur et cette étude fait l’objet d’une demande auprès du CPP qui sera soumise fin Septembre.

Objectif 2: Caractérisation des différents transcrits antisens. Nous réaliserons un séquençage pleine longueur par la technologie MinION (Oxford Nanopore Technologies), permettant d’obtenir des séquences complètes de transcrits. Pour maximiser la détection des transcrits antisens et minimiser la contamination par les transcrits sens, nous réaliserons le séquençage sur deux lignées latentes, J1.1 et ACH-2, pour lesquelles nous avons détecté une expression des transcrits antisens associée une  faible production des transcrits sens. En outre, ceci sera couplé à une étape de capture par oligonucléotides, soit des transcrits antisens totaux soit des transcrits sens totaux. Lors de l’analyse bioinformatique, les séquences retrouvées dans la capture sens seront éliminées des séquences antisens. Ceci sera réalisé en collaboration avec la plate-forme IBEN de l’ENS. Nous chercherons ensuite à détecter individuellement les transcrits antisens chez les PVVIH.

Objectif 3: Caractérisation des cibles cellulaires des transcrits antisens. Cette étude sera réalisée avec un transcrit antisens bien étudié, ASP-L, capable d’induire la répression épigénétique du LTR5’. Nous allons cloner un cDNA codant une forme non traduisible d’ASP-L dans un vecteur de transduction rétroviral ne contenant donc aucune autre séquence VIH-1 et portant un promoteur inductible permettant de contrôler le niveau de production. Le même vecteur contenant un cDNA neutre sera utilisé comme contrôle. Les transductions seront réalisées dans des lymphocytes T Jurkat et des analyses par RNAseq  (PF génom’IC de l’Institut Cochin) et protéomique (PF 3P5 de l’Institut Cochin) seront réalisées après sélection  (puro). Pour l’approche protéomique, nous utiliserons la méthode Label Free et analyserons en parallèle les extraits protéiques totaux et la fraction des protéines de surface (marquage par une biotine non-perméante+purification par billes streptavidine).Nous validerons ensuite les cibles identifiées par RTqPCR, western blot et cytometrie.

Ce projet implique deux équipes: Equipe 1 (C. Pique), avec une expertise dans l’étude des transcriptions sens et antisens des rétrovirus et qui comprend des virologues/cliniciens spécialistes du VIH et l’Equipe 2 (S. Gallois-Montbrun), experte dans la caractérisation des transcrits du VIH-1 par l’approche Nanopore. Dans l’équipe 1, deux personnes seront impliquées à 100%, une TCE INSERM statutaire et un IE bénéficiant d’un CDD Sidaction jusqu’en Mars 2023 dont le renouvellement sera demandé en 2022. De plus, nous travaillerons avec des plates-formes et bénéficierons de l’expertise du groupe de Véronique Avettand-Fénöèl dans l’analyse de la transcription du VIH chez les PVVIH.

Les réservoirs viraux sont un obstacle majeur à l’éradication du virus de l’immunodéficience humaine (VIH). Le tissu adipeux représente un site remarquable pour la réplication et la persistance virale. La fraction stromale contient des cellules activées du système immunitaire inné et adaptatif qui augmentent en nombre durant l’infection, l’obésité et l’inflammation chronique. Une dysfonction de ce tissu est commune à la majorité des individus infectés par le VIH qui présentent des pathologies allant de la dyslipidémie à la lipodystrophie et la redistribution des masses graisseuses. Le tissu adipeux est également sensible aux traitements antiviraux.

Les adipocytes et les cellules résidentes du tissu adipeux interagissent avec les lymphocytes T CD4+ et les macrophages, ce qui a d’importantes implications pour la pathogénicité du VIH. Les adipocytes sont aussi intimement associés aux tissus lymphoïdes et ils sont abondants au sein de la moelle osseuse. Ils sont une source majeure de métabolites et de signaux de survie pour les cellules immunitaires. Le microenvironnement adipocytaire a donc d’importantes conséquences sur le statut de l’infection.

Puisque les adipocytes sont des cellules endocrines qui interagissent extensivement et régulent l’immunité, cela justifie de préciser l’effet de l’infection virale sur la physiopathologie du tissu adipeux, mais aussi le rôle du tissu adipeux sur la réplication du VIH et sur sa persistance, en fonction de sa nature et de sa localisation.

Ce projet rassemblera l’expertise complémentaire de deux équipes de recherche qui ont pour thématique respective 1) les mécanismes moléculaires contrôlant le destin cellulaire, notamment au cours de l’adipogenèse, et 2) l’étude du réservoir VIH dans le tissu adipeux humain et simien et l’utilisation du modèle simien dans l’infection par le VIH.

Notre stratégie implique l’utilisation de modèles animaux qui permettent notamment l’obtention répétée de matériel biologique (sang), et difficilement accessible chez l’homme (graisse brune). Le macaque cynomolgus de l’île Maurice infecté par le VIS (virus de l’immunodéficience simienne) est un modèle de choix pour l’étude de l’infection par le VIH. Des échantillons de tissus graisseux blancs et bruns seront prélevés sur des macaques sains et infectés pour l’obtention de progéniteurs adipeux.

Pour étudier de manière pertinente l’interaction entre les cellules immunitaires et les adipocytes, nous développerons une co-culture paracrine 3D. Ce modèle sera composé d’adiposphères obtenues à partir de préadipocytes primaires simiens ou issus de lignées humaines établies à partir de tissu adipeux blanc ou brun, associées à des inserts de cellules immunitaires normales ou infectées par le SIV. Une analyse phénotypique du devenir des populations adipeuses et immunitaires sera réalisée. Elle sera complétée par un dosage de cytokines inflammatoires (IL-6, TNFα), adipokines (leptine, adiponectine) et métabolites (pyruvate, lactate) impliqués dans l’inflammation et l’infection. A terme, une compréhension plus complète de la physiologie des compartiments cellulaires et anatomiques du tissue adipeux permettra d’élaborer des stratégies pour éradiquer l’infection HIV latente et améliorer le statut métabolique des patients. Des molécules affectants le métabolisme et/ou modulant les fonctions du tissu adipeux et des cellules immunitaires, pourront être analysées dans ces modèles cellulaires 3D.

En plus des éléments cis-régulateurs localisés dans la longue répétition terminale 5’ (LTR 5’) du virus de l’immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1), notre laboratoire a identifié une importante région cis-régulatrice intragénique (IRR), présentant une activité enhancer sur le promoteur viral localisé dans le LTR5’. A l’origine identifiée comme étant associée à une région chromatinienne ouverte dans un contexte myéloïde uniquement, nos résultats récents ont montré que l’IRR était également critique pour médier la transcription et la réplication du VIH-1 dans des lymphocytes T infectés, démontrant l’importance d’étudier le rôle fonctionnel de l’IRR dans les deux contextes cellulaires d’infection par le VIH-1. De manière intéressante, nous avons identifié dans l’IRR trois sites de liaison pour le facteur de transcription myeloïde-spécifique PU.1. Le présent projet de recherche vise à comprendre plus avant les mécanismes moléculaires régulant la transcription et la latence du VIH-1 dans les deux cibles cellulaires majeures de l’infection, en étudiant le rôle joué par l’IRR sur l’activité promotrice du LTR5’. Dans la première partie du projet, nous étudierons le rôle du facteur de transcription myeloïde-specifique PU.1 dans la régulation transcriptionnelle et épigénétique du VIH-1 dans un modèle d’infection hautement physiologique, en réalisant des expériences d’infection de macrophages primaires dérivés de monocytes (MdMs) avec des particules virales contenant le génome viral du VIH-1 sauvage ou muté au niveau des sites intragéniques de liaison pour le facteur PU.1. Ensuite, afin de caractériser davantage le rôle fonctionnel de PU.1 dans la transcription et la réplication du VIH-1, nous inhiberons la liaison de PU.1 par une approche pharmacologique en utilisant un composé appelé diamidine hétérocyclique DB2115, connu pour inhiber sélectivement la liaison de PU.1 à ses sites cibles. Dans la seconde partie du projet, nous étudierons le rôle du facteur nucléaire T-spécifique se liant aux PU-boxes de l’IRR dans un contexte d’infection T-lymphocytaire. Nous étudierons le rôle de ce facteur dans la régulation transcriptionnelle et épigénétique du VIH-1 afin de démontrer les fonctions critiques jouées par l’IRR dans les deux contextes cellulaires majeurs d’infection par le VIH-1. Dans la dernière partie du projet, étant donné que la régulation transcriptionnelle du VIH-1 est un mécanisme multifactoriel complexe, comprenant de multiples niveaux de contrôle dont la structure tri-dimensionnelle (3D) de la chromatine, nous étudierons le rôle de protéines architecturales sur la régulation de la structure chromatinienne 3D des cellules infectées par le VIH-1. Plus précisément, dans l’IRR mais également le long du provirus VIH-1, nous avons identifié des sites de liaison pour CTCF et YY1, deux protéines architecturales impliquées dans la formation de boucles chromatiniennes. De plus, notre laboratoire a acquis une expertise importante dans la caractérisation des boucles chromatiniennes médiées par CTCF en étudiant d’autres rétrovirus dont le BLV et le HTLV-1. Afin d’étudier si le provirus du VIH-1 est capable de modifier l’organisation 3D de la chromatine dans les cellules infectées, nous étudierons le recrutement in vivo de CTCF et YY1 le long du provirus VIH-1 ainsi que leurs potentielles interactions 3D, par des expériences de 4C-seq. Par des expériences de CRISPR/Cas9, nous muterons ensuite les différents sites de liaison viraux pour CTCF et YY1 afin d’abolir la formation des boucles chromatiniennes et de caractériser le rôle fonctionnel de ces facteurs dans la latence virale et sur le transcriptome de la cellule infectée. Cette partie du projet de recherche contribuera à une meilleure compréhension des interactions 3D entre le provirus VIH-1 et son environnement génomique. En conclusion, notre projet de recherche permettra une connaissance plus approfondie des mécanismes moléculaires associés à la transcription et à la persistance du VIH-1 dans les deux réservoirs cellulaires majeurs du VIH-1 latent, ainsi que de nouvelles options thérapeutiques innovantes visant à contrôler l’infection virale.