Winning projects and candidates

Les traitements actuels permettent rarement de guérir les patients chroniquement infectés par HDV. De nouveaux agents ciblant directement la réplication de HDV pourraient donc permettre d’améliorer l’arsenal thérapeutique actuel. L’objectif du projet est d’apporter la preuve de concept que l’utilisation d’oligonucléotides antisens (ASO) dirigés contre les ARNs HDV seraient efficaces pour cibler l’infection HDV et de décortiquer précisément leurs mécanismes d’action. Nous avons synthétisé 112 ASOs ciblant HDV et les avons criblés pour leur effet antiviral dans des cellules HuH7-NTCP différenciées. Dix-huit candidats ASOs ont permis une diminution de plus de 80% du nombres de cellules infectées par HDV sans toxicité avec une dose de 1 µM. Parmi eux, 6 ont été sélectionnés pour confirmation de leur effet antiviral avec différentes doses. Les EC50 obtenues ont atteint le nanomolaire.

Objectif #1: Comprendre le mode d’action direct des ASOs anti-HDV. Nous déterminerons si les ASOs anti-HDV induisent une dégradation des ARNs HDV par des expériences de stabilité des ARNs combinés à des RT-ddPCR spécifiques. Si c’est le cas, nous déterminerons si la RNAse H est impliquée dans le processus par des expériences de pertes de fonction. Nous utiliserons également des digestions avec la RNAse R et des fractionnements cytoplasm/noyau pour comprendre si les ASOs anti-HDV peuvent agir sur les ARN HDV en conformation bâtonnet ou s’ils agissent uniquement sur les multimères linéaires nucléaires formés pendant l’amplification en cercle roulant d’HDV. Nous étudierons des mécanismes alternatifs possible d’inhibition de HDV par les ASOs anti-HDV. En fonction de la séquence qu’ils ciblent, les ASOs pourrait inhiber la synthèse des ARN HDV, son activité ribozyme, sa ligation ou l’association des antigènes viraux à HDV-G ou HDV-AG par encombrement stérique par exemple. Toutes ces hypothèses seront testées par analyses des ARN naissants, électrophorèse native et immunoprécipitation ARN.

Objectif #2: Déterminer si les ASOs anti-HDV ont aussi un mécanisme antiviral indirect. En raison de leurs propriétés physiques, les ASOs peuvent aussi stimuler les récepteurs de l’immunité innée et donc présenter un mode d’action antiviral secondaire via l’activation de réponses innées. En utilisant des cellules rapportrices, des cellules sanguines humaines ainsi que des hépatocytes immunocompétents, nous évaluerons les propriétés immunostimulatrices des ASO santi-HDV. Si nous en mettons en évidence, nous déterminerons si celles-ci participent à l’effet antiviral des ASOs anti-HDV en utilisant des milieux conditionnés pour traiter des cellules dHepaRG infectées par HDV.

Objectif #3: Détermination d’un possible effet synergique/additive des ASOs anti-HDV et anti-HBV in vitro. Comme la sécrétion des particules HDV dépend de la synthèse d’HBsAg, des ASOs ciblant les ARN HBV devrait en théorie limiter la propagation d’HDV. Nous testerons cette hypothèse, encore inexplorée avec un ASOs HBV dans le cas de co-infection HBV/HDV. De plus, nous déterminerons si la combinaison d’ASOs anti-HBV et anti-HDV augmente l’effet antiviral sur HDV.

Objectif #4: Validation in vivo de l’efficacité d’un ASOs anti-HDV pour bloquer l’infection HDV et détermination d’un effet synergique/additif avec un ASOs anti-HBV. Tout d’abord, nous testerons l’effet d’un candidat ASOs anti-HDV en combinaison ou non avec du Bepirovirsen dans des souris humanisées pour le foie infectées par HBV et HDV. Enfin, si des propriétés immunostimulatrices ont été mise en évidence pour les ASOs anti-HDV, nous validerons notre nouvelle approche thérapeutique dans un modèle de souris immunocompétentes (souris exprimant une version humanisée chimérique de NTCP infectées par HDV et des AAV-HBV) pour évaluer la contribution de l’effet indirect des ASOs anti-HDV dans l’effet antiviral global.

Les données générées permettront d’aller vers le développement de stratégies utilisant des ASOs pour traiter l’infection HDV chronique.

Chez les personnes vivant avec le VIH sous traitement antirétroviral, la persistance du virus dans les cellules infectées de manière latente constitue le principal obstacle à la guérison de l’infection. En effet, le principal réservoir latent est constitué de lymphocytes T CD4+ mémoire quiescents contenant des provirus intégrés mais transcriptionnellement silencieux. Lors de l’interruption du traitement, ces provirus latents ont la capacité de redevenir transcriptionnellement actifs, conduisant à un rebond viral rapide.

La terminaison prématurée de la transcription de l'ARN polymérase II est un mécanisme clé de régulation de l'expression provirale du VIH. Ce processus, dont on sait aujourd'hui qu'il se produit à des fréquences étonnamment élevées dans de nombreux gènes, limite la production de transcrits viraux complets et constitue ainsi une étape majeure dans la régulation de l'expression et de la latence des gènes du VIH. Nous avons récemment identifié le complexe PCF11/WDR82 comme un nouveau facteur cellulaire qui renforce la terminaison prématurée de la transcription dans les cellules latentes. Ce projet vise à mieux comprendre les mécanismes sous-jacents contrôlant cette étape clé.

Nous présentons ici des données préliminaires montrant que PCF11/WDR82 joue un rôle central dans le recrutement de cofacteurs impliqués à la fois dans la terminaison de l'ARN Polymérase II et dans la dégradation des ARNs nucléaires naissants. Dans ce projet, nous utiliserons une combinaison d'approches cellulaires, biochimiques et moléculaires pour valider et caractériser le rôle de PCF11/WDR82 dans le contrôle de la transcription du VIH. Nous allons : 1) identifier et caractériser fonctionnellement les partenaires de PCF11/WDR82 ; 2) caractériser l’architecture du complexe et sa dynamique de recrutement sur les provirus latents 3) quantifier l’impact de PCF11/WDR82 sur la terminaison prématurée et la dégradation des RNA viraux. 

Des études récentes ont souligné l'implication potentielle de facteurs de terminaison prématurée de la transcription dans le maintien de la latence du VIH au sein des réservoirs de lymphocytes T infectés chez les personnes sous traitement antirétroviral. Notre projet vise à élucider les mécanismes moléculaires par lesquels PCF11/WDR82 pourrait induire cette répression transcriptionnelle des provirus latents.

Les études fondamentales du cycle du virus de l'hépatite B (VHB) sont couramment conduites à l'aide de modèles cellulaires majoritairement employés dans des conditions environnementales de pression partielle en oxygène (normoxie ; pO2 de 21%). L'hépatocyte in situ évolue pourtant dans un environnement naturel faiblement chargé en oxygène (hypoxie physiologique ; pO2 entre 3 et 8%, entre la veine centro-lobulaire et l'espace porte). Or, l'hypoxie physiologique a un impact majeur sur les cellules hépatocytaires, notamment sur l'homéostasie lipidique et la physiopathologie associée. Ainsi les conditions d'études usuelles du VHB en laboratoire (normoxie) sont susceptibles de modifier profondément une ou des étapes naturelles du cycle viral et/ou les interactions entre virus et environnement cellulaire.

En station hypoxique dédiée, nous avons développé au laboratoire un modèle de culture de cellules cultivées sous hypoxie physiologique pour l'étude de la morphogenèse et du caractère infectieux du VHC. Ce modèle confirme l'activation du métabolisme lipidique cellulaire et montre un impact positif important sur la formation et le pouvoir infectieux des particules virales produites. L'hypoxie physiologique est ainsi un acteur majeur de la morphogenèse, de l'antigénicité et de l'infectiosité des virions du VHC ; des conséquences qui peuvent tout à fait se concevoir pour le VHB, un autre virus hépatotrope dont le cycle est aussi sous la dépendance des lipides intracellulaires. Des études publiées par d'autres groupes ont d'ailleurs identifié, in vitro comme in vivo, que la réplication virale était très positivement affectée par la culture de cellules en hypoxie physiologique, attestant de l'importance du taux naturel en O2 sur le cycle viral dans son ensemble.

L'objectif global de ce projet est donc d'étudier et de comprendre les mécanismes qui sous-tendent la formation des particules sous-virales (ou SVP) et complètes du VHB, mais aussi d'analyser le caractère infectieux des virions, dans des conditions physiologiques d'oxygénation des cultures cellulaires.

Pour cela, et à partir de résultats préliminaires prometteurs, plusieurs stratégies expérimentales complémentaires seront déployées, visant d'abord à caractériser le rôle spécifique de l'hypoxie sur le métabolisme lipidique et l'expression des SVPs du VHB en cellules productrices. Un travail particulier de l'étude du rôle éventuel de l'ApoE dans cette étape sera conduit, puisqu'elle a été montrée comme importante à la fois dans la morphogenèse et le caractère infectieux du VHB. Ce travail s'accompagnera d'une caractérisation morphologique et biochimique des SVPs produites par des approches biochimiques, d'imagerie en microscopie électronique et par spectrométrie de masse. Enfin, l'impact de l'hypoxie physiologique sur le pouvoir infectieux des virions du VHB sera étudié. D'une part, l'effet de l'hypoxie sur la production et le pouvoir infectieux des virions, que nous caractériserons biochimiquement, sera abordé mais d'autre part le rôle de l'hypoxie physiologique sur la sensibilité des cellules à l'infection par des virions produits en normoxie sera analysé.

Au final, en combinaison avec certaines caractéristiques lipidiques, ce projet nous permettra de mieux délimiter l'importance de l'hypoxie physiologique dans les étapes de morphogenèse mais aussi du pouvoir infectieux des virions du VHB néo-formés. Par le caractère original de la culture cellulaire, ce travail pourrait aussi permettre à terme d'identifier des caractéristiques virales et cellulaires utiles au développement d'approches thérapeutiques innovantes.