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Le virus de l’hépatite E (VHE) est responsable de la majorité des cas d’hépatites aigües et de jaunisse dans le monde. Chaque année, 20 millions de personnes sont infectées et environ 60000 en décèdent. Le VHE représente un problème de santé publique à la fois pour les pays en voie de développement et pour les pays développés. Dans les premiers la contamination se fait essentiellement par ingestion d’eau souillée par de matières fécales alors que dans les second la transmission est principalement zoonotique ou alors associée à des greffes d’organes et transfusions sanguines. En Europe, lors des 10 dernières années le nombre de cas reportés d’infection par le VHE a été décuplé. A l’exception d’un vaccin uniquement disponible en Chine, il n’existe à ce jour pas de traitement spécifique pour combattre cette infection. Le VHE est un petit virus icosaédrique (27-34nm), de la famille des Hepeviridae, qui contient une molécule d’ARN simple brin de 7.2kb. Les particules infectieuses sont nues dans les selles et la bile mais enveloppées lorsqu’elles circulent dans le sang, par des lipides provenant des exosomes des cellules infectées. Le VHE est donc un virus quasi-enveloppé. Son ARN génomique code pour 3 protéines : ORF1, ORF2 et ORF3. ORF1 possède les enzymes requises pour la réplication de l’ARN viral, ORF2 correspond à la protéine de capside et est un déterminant antigénique majeur ; enfin ORF3 est une petite protéine encore mal caractérisée. Elle possède deux régions hydrophobes ainsi qu’une région riche en proline qui est prédite désordonnée. ORF3 interagit avec de nombreuses protéines de l’hôte et virales. Elle pourrait être impliquée dans l’établissement d’un contexte cellulaire favorable au cycle du virus. ORF3 n’est pas directement impliquée dans la réplication de l’ARN viral et dans l’assemblage des virions mais est requise pour la sécrétion des particules infectieuses. Ce processus se fait via l’interaction avec la protéine Tsg101 du complexe ESCRT-I, laquelle est impliquée dans le bourgeonnement de plusieurs virus enveloppés, comme le VIH ou Ebola. ORF3 a été localisée au niveau des membranes intracellulaires et également de la membrane plasmique. Une insertion transmembranaire, associée à un processus d’oligomérisation, a été proposée pour ORF3 qui formerait alors une viroporine. Cependant, il a également été montré que l’association membranaire de ORF3 est liée à la palmitoylation de sa région riche en cystéine.

Afin de mieux comprendre le(s) rôle(s) que joue(nt) ORF3 dans le cycle du VHE nous souhaitons réaliser une étude structurale et fonctionnelle de cette protéine. Nous produirons cette protéine de manière recombinante puis étudierons sa structure 3D et sa dynamique, par RMN en solution. Nous chercherons à identifier l’ensemble des déterminants moléculaires qui participent à l’ancrage membranaire de ORF3 et testerons sa fonction potentielle de viroporine. Pour étudier ORF3 dans un contexte membranaire par RMN en solution, nous utiliserons notamment la technologie des nanodisques (bicouche lipidique stabilisée par une protéine d’assemblage). Nous visons à déterminer un modèle structural de la protéine ORF3 ancrée à la membrane. Ensuite, nous chercherons à mettre en évidence une potentielle interaction entre ORF3 et deux peptidyl-prolyl cis/trans isomérases humaines, CypA et FKBP12, qui ont récemment été impliquées dans la palmitoylation et l’ancrage membranaire de la protéine Tat du VIH. Enfin, nous caractériserons, toujours par RMN, les bases moléculaires de l’interaction de ORF3 avec la protéine Tsg101. Les résultats de ce projet devraient nous permettre de mieux appréhender le fonctionnement de ORF3 au cours du cycle du VHE, et pourraient, à plus long terme, être utilisés pour concevoir des inhibiteurs ciblant cette protéine ou ses interactions.

Contexte : Les personnes originaires d’Afrique subsaharienne sont le deuxième groupe le plus touché par l’épidémie de VIH en France. Une partie des infections VIH survient en France, en lien avec la précarité et les difficultés structurelles rencontrées lors de l’installation. Ces difficultés sont partagées par les immigrés originaires des Caraïbes non françaises (essentiellement Haïtiens). De nombreux acteurs œuvrent pour faciliter l’accès aux services de santé et à l’information pour ces immigrés, toutefois l’intégration de pratiques de prévention ou de soins nécessite plus que le simple apport de connaissances ou des réponses médicalisées. Il apparaît nécessaire d’agir sur l’empowerment, afin d’apporter des ressources aux individus et aux communautés pour améliorer leur pouvoir d’agir dans le contexte complexe et nouveau du pays d’accueil. Des associations et des chercheurs mènent ensemble une recherche interventionnelle intitulée MAKASI : « Mobilisation des Afro-Karibéens pour l’Appui à la Santé et l’Installation ». Elle vise à renforcer l’empowerment en santé sexuelle des immigrés, afin qu’ils s’approprient et mettent en œuvre les moyens de prévention et de soins pour réduire leur exposition aux risques sexuels.

Objectifs : La phase pilote de cette recherche (AO 2017-1) a permis de construire une intervention d’empowerment qui consiste en un entretien individuel unique basé sur les principes de l’entretien motivationnel, articulé à une orientation active vers les services sociaux ou de santé adéquats, éventuellement avec accompagnement lorsque nécessaire. Notre hypothèse est que cette intervention va renforcer chez les immigrés quatre dimensions de l’empowerment en santé sexuelle : la capacité à exprimer leurs besoins, les compétences en santé sexuelle (connaissances, accès aux services), l’estime de soi (autonomie, santé mentale, capacité de négociation), la conscience de l’exposition au VIH et aux IST. La recherche proposée vise à mesurer l’efficacité de l’intervention sur ces quatre dimensions, ainsi que d’en réaliser une évaluation des processus et de l’efficience (coût-efficacité).

Méthodes : L’intervention est délivrée au sein des unités mobiles d’Afrique Avenir qui proposent sur des lieux de passage fréquentés par des populations africaines et caribéennes (marchés, gares…) une sensibilisation à la santé sexuelle. Elle est proposée à toute personne originaire d’Afrique subsaharienne ou des caraïbes non françaises et déclarant des situations sexuelles qui peuvent les exposer au VIH ou aux IST, des situations de précarité sociale ou des difficultés d’accès aux services de santé. L’évaluation mobilise une approche par les méthodes mixtes intégrées, avec un volet quantitatif d’évaluation d’impact et en parallèle une recherche qualitative sur les processus, afin d’établir l’attribution causale des effets de l’intervention. La mesure d’impact se fera par la comparaison d’indicateurs caractérisant les 4 dimensions de l’empowerment en santé sexuelle citées ci-dessus et d’indicateurs d’exposition aux risques sexuels, entre un bras où l’intervention est immédiate, et un bras où cette intervention est différée de 3 mois (bras contrôle) (n=600 par bras). L’évaluation qualitative des processus de l’intervention (pertinence et pérennité) sera basée sur une approche ethnographique de l’intervention et du parcours des participants. Une collecte des coûts permettra de mesurer l’efficience.

Perspectives : Ce projet permettra de montrer l’efficacité et l’efficience d’une intervention innovante pour une réduction de l’exposition aux risques en santé sexuelle chez les immigrés venant d’Afrique sub-saharienne et des Caraïbes, et mettra en évidence les conditions de sa reproduction ou de son extension. Il s’inscrit en articulation étroite avec l’initiative vers Paris sans Sida qui développe les dimensions collectives de l’empowerment via différentes approches dans les communautés concernées.

Objectifs : L’objectif principal est d’évaluer, chez les individus atteints d’hépatite chronique B (HCB), l’efficacité, le coût et le coût-efficacité 1) des traitements par analogues nucléos(t)idiques (traitements actuels) par rapport à l’absence de traitement, 2) des traitements curatifs (permettant une guérison fonctionnelle ou totale) par rapport aux traitements actuels. Les objectifs intermédiaires sont (i) de développer un modèle de progression de l’HCB, (ii) de déterminer le seuil d’efficacité au-delà duquel les traitements futurs pourraient réduire la morbi-mortalité ainsi que le seuil de coût pour que ces traitements soient coût-efficaces, (iii) de définir quand ces traitements doivent être initiés.

Situation du projet : En France, en 2004, environ 280 000 individus étaient porteurs chroniques du virus de l’hépatite B (VHB). L’HCB peut conduire au développement de complications graves, comme la cirrhose et le cancer hépatocellulaire (CHC), responsables de 1327 décès attribuables à l’HCB en 2001. Les traitements actuels ne permettent pas l’éradication du génome viral, mais seulement une virosuppression, rarement accompagnée par la perte de l’antigène HBs. Cette réponse permet une forte réduction des risques de cirrhose et de complications, mais contraint la plupart des patients à un traitement administré à vie. Il est par conséquent nécessaire de trouver de nouvelles cibles thérapeutiques qui permettent d’obtenir une guérison fonctionnelle, amplifiant la perte de l’antigène HBs (« functional HBV cure ») ou une guérison complète, permettant également l’éradication de l’ADN viral des hépatocytes (« sterilizing HBV cure »).

Problématique : De nouveaux traitements de type curatif seront bientôt disponibles. Dans un souci d’allocation optimale des ressources et d’optimisation de la prise en charge, il est important d’évaluer sous quelles conditions de tels traitements peuvent être efficaces et coût-efficaces.

Méthodes : Ce projet est une évaluation médico-économique et s’appuie sur des méthodes d’aide à la décision. Nous développerons un modèle de Markov pour simuler la trajectoire de la population atteinte d’HCB et tester différentes stratégies de traitement (type de traitement, moment d’initiation). Nous évaluerons l’intérêt de chaque stratégie en terme de complications évitées (cirrhose, CHC, décès), d’années de vie gagnées, d’années de vie ajustées sur la qualité (QALYs, quality-adjusted life years) gagnées et de ratios coût-efficacité (euros dépensés par année de vie (de qualité) gagnée. Les données d’histoire naturelle, d’efficacité des traitements actuels, de coût et de qualité de vie seront issues de la littérature. Concernant les traitements futurs, nous ferons des hypothèses sur leur effet et leur coût, et évaluerons les conditions nécessaires à leur efficience. Des analyses de sensibilités déterministe et probabilistes seront réalisées. Une analyse de la valeur de l’information sera aussi menée pour identifier les bénéfices attendus de recherches supplémentaires, notamment de recherche épidémiologique et permettre de prioriser les futures recherches visant à obtenir une meilleure information sur les paramètres sources d’incertitude.

Echéancier des travaux : (i) Septembre à Novembre 2018 : Revue de la littérature ; (ii) Décembre 2018 à Août 2019 : Recueil des données d’histoire naturelle de l’hépatite chronique B et de l’efficacité des traitements, et développement du modèle ; (iii) Septembre à Décembre 2019 : Evaluation des traitements actuels : analyse coût-efficacité et analyse de sensibilité ; (iv) Janvier 2019 à Mai 2020 : Evaluation des traitements futurs : analyse coût-efficacité, analyse de sensibilité et valeur de l’information ; (v) Juin à Août 2020 : Valorisation.

Résultats attendus : Notre analyse pourra aider à mieux aiguiller la recherche fondamentale et la recherche clinique sur l’arsenal thérapeutique futur de l’hépatite B, en déterminant et explorant les conditions nécessaires pour que les traitements de types HBV cure soient coût-efficaces. Elle permettra également d’éclairer la prise de décision en fournissant aux décideurs une évaluation de différentes stratégies de traitement de l’HCB.

La plupart des virus à ARN enveloppés exploitent la machinerie cellulaire ESCRT-III (endosomal sorting complexes required for transport) pour la dernière étape de leur cycle de multiplication, le bourgeonnement. Néanmoins, les virus enveloppés utilisent seulement les protéines CHMP2, CHMP3 et CHMP4 et l'ATPase VPS4. Étant donné que cette machinerie est essentielle pour les événements cellulaires de coupure de membrane, cela limite la possibilité d'acquérir des mutations qui l'inhibent. Cependant, de nombreuses espèces ont évolué pour conserver des duplications mutées de CHMP3 (appelées rétroCHMP3), qui préservent les fonctions cellulaires de l'ESCRT mais agissent comme des inhibiteurs du bourgeonnement viral à large spectre

In vitro, les protéines ESCRT-III ont la propriété de s’auto-assembler sur les membranes plasmiques en formant des filaments de composition variable, présentant également une diversité de formes : les CHMP4 forment des filaments en spirales plates et lâches, alors que les CHMP2A-CHMP3 s'assemblent en hélices compactes. Cependant, il reste encore à déterminer la composition des fibres aux sites de bourgeonnement du VIH-1 en particulier, on ne sait pas si ce sont des spirales de CHMP4B ou des polymères hélicoïdaux de CHMP2A/CHMP3 comme ceux observés in vitro. De plus, il n'est pas encore clair si ces filaments sont échangés ou s'ils sont successivement recrutés et désassemblé lors de la fission membranaire. En fin de compte, la distribution spatiale des filaments ESCRT-III et les transitions entre chaque fibre le long du col de bourgeonnement restent des sujets controversés.

La compréhension de la dynamique et de l'architecture du complexe ESCRT-III natif aux sites de bourgeonnement du VIH-1 est limitée en raison de la résolution spatiale et du recrutement transitoire des ESCRT-III. Nous proposons d'utiliser les ciseaux moléculaires pour marquer les protéines ESCRT-III par des protéines fluorescentes de différentes couleurs à leur loci chromosomiques. Nous utiliserons l'imagerie cellulaire « Total Internal Reflection Fluorescence » (TIRF) à haute résolution temporelle pour établir la cinétique de leur échange, assemblage et désassemblage lors du bourgeonnement. Pour obtenir une résolution spatiale suffisante, nous tirerons parti des récentes améliorations de la Single Molecule Localization Microscopy (SMLM) telle que les améliorations récentes de Points Accumulation for Imaging Nanoscale Topography (PAINT). De plus, nous utiliserons des techniques de microscopie électronique à cryogénie. Ces technologies de pointe promettent de fournir des images cellulaires de haute résolution des protéines ESCRT-III, dans le but d'élucider la cinétique, l'arrangement spatial, l'organisation structurelle et l'interaction de chaque filament.

Ces approches seront appliquées à divers mutants connus pour bloquer le bourgeonnement à différentes étapes, notamment des mutants de VPS4, des dominant négatifs des ESCRT-III et les mutants rétroCHMP3. Cela nous permettra de déterminer le rôle de CHMP4B, CHMP2A, CHMP3 et VPS4. De plus, l'inclusion des protéines rétroCHMP3 enrichira notre compréhension des fonctions spécifiques de CHMP3 et nous fournira des éléments pour comprendre les mécanismes altérés par les retroCHMP3.

Dans le cadre du "contrat d'initiation", nous mettrons en place les modèles cellulaires pour l'imagerie cellulaire. Nous fournirons les premières preuves de concept afin d'atteindre les objectifs décrits ci-dessus. L'utilisation de techniques d'imagerie avancées telles que la TIRF, la SMLM et la cryo microscopie électronique aidera à explorer l'organisation spatiale et la dynamique des filaments ESCRT-III, enrichissant notre compréhension de leur implication dans la fission membranaire lors du bourgeonnement viral. Cette recherche repoussera les limites technologiques de l'imagerie, contribuant à des progrès méthodologiques en biologie cellulaire. L'étude des variantes rétroCHMP3 révèlera comment ces protéines inhibent le bourgeonnement viral tout en préservant les fonctions cellulaires essentielles, offrant des pistes pour de nouveaux antiviraux moins toxiques.

L’hépatite E est une pathologie hépatique causée par le virus de l’hépatite E (HEV) et transmise principalement par voie féco-orale. Le HEV représente la cause majeure d’hépatites virales dans le monde et l’Organisation Mondiale de la Santé (OMS) estime à 20 millions le nombre de nouvelles infections par an. Le HEV cause une infection aiguë qui finit par être résorbée par le système immunitaire dans la majorité des cas.  Cependant, l’infection peut évoluer vers une hépatite chronique ou fulminante chez les patients immuno-déprimés et les femmes enceintes, respectivement. Le taux de mortalité est estimé de 40 000 à plus de 70 000 décès par an. HEV est le seul membre de la famille des Hepeviridae classé dans le genre Orthohepevirus.  Le génome du HEV est à ARN monocaténaire de polarité positive d’environs 7 kb. Il contient trois cadres ouverts de lectures (ORF1 à 3). L’ORF1 code pour une poly-protéine non structurale, impliquée dans la réplication du génome. Les produits des ORF 2 et 3 sont, quant à eux, impliqués dans l’encapsidation et la libération des particules virales néoformées. L’ORF1 code pour sept protéines non-structurales incluant:  la méthyltransférase (MeT), le Y-domaine (Y), la cystéine peptidase apparentée à la papaïne, un domaine hypervariable riche en proline (HVR), un Macro domaine (ou X domaine), un domaine hélicase ainsi qu’une ARN polymérase –ARN dépendante (RdRp).  Ces différents domaines jouent un rôle crucial dans l’inhibition de la réponse immunitaire innée pour promouvoir la progression de l’infection. 

 Dans les cellules infectées il se produit une accumulation d’intermédiaires de réplication d’ARN double brin (ARNdb), qui va induire la réponse immunitaire innée de l’hôte par activation du système Oligoadenylate synthetase /endoribonuclease L (OAS/RNAse L), interféron dépendant. L’OAS est activée suite à sa fixation à des ARN db et génère, à partir de l’ATP, des oligoadenylates (2’5’A). Ces derniers vont se fixer sur la ribonucléase cellulaire RNAse L et provoquer son activation. La RNAse L activée clive les ARN cellulaires et viraux. Ce processus conduit à l’activation de signaux promouvant la transcription des gènes stimulés par les interférons, l’inhibition de l’infection virale et l’apoptose de la cellule infectée. En contrepartie, les virus ont développé différents moyens pour échapper à la réponse antivirale de l’hôte. Des études sur les virus tels que l’Ebola, l’hépatite C, l’influenza A, et plus récemment les Coronavirus et les Rotavirus, ont montré que les protéines non structurales de ces virus peuvent inhiber le système OAS/RNAse L par séquestration d’ARNdb ou l’inhibition directe de la voie OAS/ RNAse L. Cette inhibition dépend de la présence de motifs H-x-(S/T)-x, assurant une activité phosphodiestérase. La transfection des différents segments de l’ORF1 dans les cellules de mammifère inhibe fortement la production d’interférons. Cependant, les mécanismes moléculaires impliqués dans cette évasion restent à être élucidés.  

Le but de ce projet est d’une part d’identifier et de caractériser des activités enzymatiques, et d’autre part de déterminer des motifs moléculaires impliqués dans l’inactivation de la réponse immunitaire innée. La réalisation de ce projet repose sur (i) la conception de façon rationnelle de constructions contenant les motifs H-x-(S/T)-x; (ii) l’expression des constructions générées en système cellulaire afin d’étudier leur effet sur la modulation de la réponse immunitaire innée ; (iii) la caractérisation biochimique des protéines recombinantes de l’ORF1, permettant d’élucider les mécanismes moléculaires observées en cellules ; (iv) la confirmation du rôle des motifs /domaines identifiés, à l’aide de mutagénèse dirigée, dans la modulation de la réponse immunitaire innée.

Finalement, l’identification et la compréhension des activités virales, impliquées dans l’inactivation de la défense cellulaire, pourrait permettre l’identification de cibles pouvant être exploitées pour la génération d’agents antiviraux spécifiques.

L’impact social et économique de la tuberculose (TB) causée par le pathogène Mycobacterium tuberculosis (Mtb), reste très élevé, avec un impact croissant de la résistance aux antibiotiques. Actuellement, les infections multiples affectant les patients tuberculeux et la pharmaco-résistance sont les facteurs-clés de la morbidité à long terme et de la mortalité, à la fois chez les patients HIV+ et chez les patients HIV- . Il est ainsi important de mener de nouvelles études sur les mécanismes de diversification et d’émergence de la résistance aux antibiotiques par le bacille tuberculeux.

Chez Mtb, la résistance repose sur l’acquisition de mutations chromosomiques dans les cibles des antituberculeux du fait de l’absence de transferts horizontaux. Alors que le rôle des génotypes mutateurs dans l’émergence de la résistance est bien reconnu chez plusieurs agents pathogènes bactériens, la fréquence des génotypes hypermutateurs parmi les isolats cliniques de Mtb et leur contribution effective à l’émergence de la résistance bactérienne sont encore mal comprises. Comprendre ces émergences permettrait de développer de nouvelles stratégies de prévention voire de nouvelles stratégies antibactériennes. Notre objectif général est de fournir de nouvelles informations sur la diversité génétique des gènes des systèmes de réparation de l’ADN de Mtb, et d’en tester les impacts sur l’émergence effective de résistances.

Nous nous appuierons sur les données préliminaires acquises et leur élargissement, pour couvrir 80,000 données brutes de séquençage publiques de souches cliniques de Mtb. Sur 60,000 souches déjà analysées, nous avons identifié 108 mutations dans 27 gènes de différents systèmes de réparation de l’ADN, mutations qui sont associées à des génotypes résistants. Elles constituent autant de candidats hypermutateurs. Dans ce projet, la stabilité et l’effet fonctionnel de chaque variant candidat seront modélisés grâce à des outils de bio-informatique structurale. Nous caractériserons ensuite les candidats dans Mtb sur un modèle ex vivo d’infection de macrophages humains, pour mesurer leur contribution précise à l’évolution du taux de mutation intra-hôte, caractérisé en particulier par un important stress oxydatif. Ce travail permettra d’identifier les acteurs-clés du système 3R dans l’émergence de la résistance aux antibiotiques, et donc d’identifier les cibles à favoriser dans la recherche de nouveaux agents thérapeutiques, pour renforcer l’efficacité des systèmes de réparation pendant les traitements. Notre approche est ainsi multi-échelle et multi-factorielle: elle s’appuie sur la diversité génétique bactérienne à l’échelle mondiale, sur l’analyse biochimique fine des acteurs moléculaires contrôlant l’apparition de nouveaux variants et va jusqu’à des manipulations ex vivo sur un nombre limité de souches, en conditions contrôlées, mimant l’évolution intra-hôte. Cette étude permettra : (1) d’augmenter le catalogue des variants naturels connus du système de réparation de l’ADN de la tuberculose et (2) d’améliorer notre compréhension de l’impact de mutations ponctuelles sur la structure et la fonctionnalité des protéines 3R, (3) de décrire le lien entre modifications dans le système de réparation des mycobactéries et résistance aux antibiotiques dans un contexte modélisant l’évolution intra-hôte, (4) d’améliorer notre compréhension de l’évolution intra-hôte du bacille tuberculeux en vue de proposer de nouveaux systèmes de prévention, de diagnostic, de suivi voire de traitements. Ces recherches pourraient bénéficier à la lutte contre d’autres pathogènes intracellulaires.

Ce projet multidisciplinaire et holistique va ainsi améliorer notre compréhension de l’évolution de l’agent de la tuberculose et des mycobactéries qui lui sont apparentées. Ce projet intéresse la recherche fondamentale sur les mycobactéries tout en répondant au besoin critique du marché mondial concernant la résistance aux antibiotiques. Cette étude a le potentiel d’avoir un impact, à long terme, sur le secteur de la santé et du bien-être tout au long de la vie