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Introduction : L’adolescence est une période cruciale durant laquelle de nombreux changements d’ordre physique, mental et social surviennent avec plus de comportements à risque que pendant les autres périodes de la vie. L’accroissement de l’accès au traitement antirétroviral a entrainé une réduction de la mortalité liée au VIH dans toutes les classes d’âge, à l’exception de celle des adolescents qui constituent une population particulièrement vulnérable. Cette sur-mortalité élevée chez les adolescents vivant avec le VIH (AVVIH) est essentiellement liée à des difficultés d’observance au traitement, lesquelles difficultés sont exacerbées par une annonce explicite de leur statut VIH faite souvent trop tardivement et dans de mauvaises conditions. Depuis 2016, l’accès à la mesure de la charge virale, indicateur clé de la surveillance thérapeutique s’améliore en Afrique de l’Ouest. Nous faisons l’hypothèse que l’amélioration des conditions d’annonce du statut VIH aux AVVIH avant l’âge de 12 ans améliorerait leur santé mentale, et leur observance, et que l’identification précoce de ceux ayant avec une charge virale détectable en cours du suivi permettrait de renforcer leur observance au traitement : ces interventions ciblées permettraient d’améliorer  la réponse virologique et de prévenir l’apparition de résistances aux antirétroviraux pour préserver leur capital thérapeutique. Il s’agit d’une priorité de santé publique, en particulier dans les pays à ressources limitées où les nouveaux traitements antirétroviraux sont rares.

L’objectif de ce projet est d’évaluer l’acceptabilité sociale et familiale et l’efficacité d’un paquet d’interventions visant 1/ à améliorer la qualité et la fréquence de l’annonce complète du statut d’infection par le VIH (avant 12 ans), et 2/ à améliorer l’observance modulée selon la réponse virologique pour améliorer le taux de suppression virologique (charge virale indétectable) chez les AVVIH traités par trithérapie antirétrovirale dans des cohortes pédiatriques en Afrique de l’Ouest.

Méthodes : Nous conduirons un essai randomisé séquentiel en grappe « stepped-wedge » dans six sites de prise en charge différents en Afrique de l’Ouest niché dans la cohorte pédiatrique «International Epidemiology Databases to Evaluate AIDS (IeDEA)» West-Africa. La durée de cette étude sera de 36 mois. Tous les AVVIH âgés de 10 à 17 ans, entrés dans les soins avant l’âge de 10 ans (infectés par transmission mère-enfant) seront éligibles pour cette étude. A l’inclusion, le statut vis-à-vis de l’annonce du statut VIH sera évalué pour chaque adolescent et une charge virale sera réalisée. Notre intervention combinera un soutien à l’annonce complète du statut VIH avant l’âge de 12 ans pour ceux n’ayant pas encore eu l’annonce. Les adolescents avec une charge détectable bénéficieront d’un programme de renforcement d’observance personnalisé avec des agents communautaires et des pairs-éducateurs formés, et un suivi  virologique durant 6 mois. L’analyse de cette stratégie sera multicritère : acceptabilité sociale et familiale des interventions, efficacité globale sera évaluée : 1/ par la différence de proportion d’adolescents en échec virologique (charge virale supérieure à 1000 copies/mL) avant, et 12 mois, puis 18 mois après la mise en place du paquet l’interventions dans les sites, et 2/ par la différence de proportions d’adolescents de moins de 12 ans informés de leur statut d’infection à VIH avant et 18 mois après la mise œuvre de l’intervention ; analyse coût-efficacité.

Résultats attendus : Cette étude contribuera à évaluer une stratégie de soutien familial et professionnel à l’annonce complète et de renforcement de l’observance thérapeutique des AVVIH basée sur la charge virale, et adaptée au contexte de l’Afrique de l’Ouest qui soit efficace et pérenne. Si les résultats sont probants, il s’agira de disséminer ensuite cette stratégie aux autres sites de prise en charge des adolescents en Afrique francophone (réseau VIVRADO). Le projet permettra un plaidoyer pour obtenir des traitements de 3ème ligne, et constituera une plate-forme structurante pour le renforcement des capacités, y compris la formation de masters et doctorat.

Chez les eucaryotes, la traduction est un processus dynamique et rapide qui est régulé à la fois par la structure intrinsèque de l’ARN et de nombreuses protéines cellulaires qui se fixent sur l’ARNm. Contrairement au mécanisme de traduction procaryote, la sous-unité 40 S ne peut pas se lier directement sur l’ARN et l’attachement a lieu par le biais d’interactions ARN-protéines qui se mettent en place grâce à un ensemble de 12 facteurs d’initation (eIFs pour eukaryotic Initiation Factors). La sous-unité 40 S du ribosome associée à ces facteurs d’initiation constitue le coeur d’un vaste complexe macromoléculaire auquel se joint de nombreuses autres protéines de liaison à l’ARN pour former le complexe de préinitiation. Celui-ci a une composition variable en fonction de l’ARN considéré ce qui module sa fonction et lui permet de s’adapter aux contraintes structurelles que l’on trouve chez certains transcrits.

L’initiation de la traduction chez les eucaryotes, qu’elle soit opérée à partir de l’extrémité 5’ (coiffe-dépendante) ou en position interne (IRES-dépendante) consiste à attirer et lier le complexe de préinitiation sur l’ARNm afin qu’il puisse parcourir la région 5′ non traduite (5’UTR) pour accéder au codon AUG. Lorsqu’il arrive sur le site initiateur, ce complexe de préinitiation est dissocié pour permettre la liaison de la sous-unité 60 S du ribosome et constituer le ribosome 80S; celui-ci va ensuite parcourir la phase codante pour produire la protéine d’intérêt. L’étape d’initiation est l’étape limitante et elle détermine le taux de production protéique global de l’ARN concerné. A ce titre, l’initiation de la traduction est un processus extrêmement régulé et contrôlé à la fois par la structure de l’ARNm et la composition du complexe de préinitiation.

L’ARN génomique du VIH-1 est traduit dans le cytoplasme de la cellule infectée par la machinerie cellulaire de l’hôte et code pour les polyprotéines Gag et Gag/Pol. Il commence par une coiffe (guanosine méthylée-m7GTP) qui est suivie par une longue région 5′ non traduite (5’UTR) de 336 nucléotides qui contient de nombreux motifs complexes d’ARN dont la tige boucle TAR, le PBS, les signaux de dimérisation (DIS) et d’encapsidation (Psi). L’initiation de la traduction de l’ARNg est particulière puisqu’elle peut s’opérer à la fois à partir du 5′ de l’ARN (mécanisme coiffe-dépendant) ou sur 2 séquences IRES distinctes qui se trouvent dans la région 5’UTR (IRES1) et au début de la phase codante pour Gag (IRES2). Il est donc possible de recruter 3 complexes de préinitiation sur l’ARNg mais on ne sait pas si ces complexes peuvent se former simultanément ou si leur assemblage est mutuellement exclusif. On ne connait pas leur composition protéique ni leur dynamique d’assemblage au cours de la progression du cycle viral ou de l’état physiologique de la cellule hôte. En revanche, on sait qu’ils ont une composition variable en fonction de leur site de recrutement sur l’ARN.

Les objectifs de ce projet sont de cartographier et identifier la composition de ces complexes d’initiation sur leurs sites d’assemblage, c’est à dire à l’extrémité 5′ de l’ARN (coiffe/TAR) ou au niveau des 2 IRES afin de mieux comprendre comment s’articule la traduction du VIH-1. Pour ce faire, nous utiliserons la technique récente de biotinylation de proximité en combinaison avec un système d’édition de type CRISPR/Cas13 pour cibler des régions précises de l’ARN génomique. Cela permettra de cartographier les interactions protéines-protéines et déterminer le réseau complexe de ces interactants dans un rayon d’environ 10 nm autour des sites d’initiation.

Les infections causées par le virus de l’hépatite C (VHC) sont toujours un problème majeur de santé publique, avec quelque 71 millions de personnes chroniquement infectées, causant la mort de 399000 d’entre elles en 2016. Des antiviraux à action directe ont été développés contre le VHC et permettent aujourd’hui des taux de guérison de 95%. Cependant, l’éradication du VHC sera difficile car l’infection est initialement asymptomatique, il n’ y a pas de vaccin et les traitements sont très coûteux. De fait, l’incidence de cancers associés au VHC continue à augmenter. Enfin, le VHC est devenu un excellent modèle de recherche fondamentale sur les virus à ARN, particulièrement les virus à ARN simple brin de polarité positive. Récemment, l’équipe de Volker Lohmann a publié une étude remarquable sur une souche de HCV de génotype 1b isolée d’un sérum à fort titre viral d’un patient ayant subi des transplantations de foie (German liver transplant 1, GLT1). Cet isolat post-transplantation a montré une haute efficacité de réplication en culture cellulaire. Après adaptation à la production de particules infectieuses in vitro, cette souche était toujours infectieuse in vivo, contrairement aux autres souches de HCV adaptées à la culture cellulaire.

De nouvelles données non publiées obtenues dans le cadre d’une collaboration entre les équipes Lohmann et Bressanelli ont identifié la protéine NS5A, et possiblement son interaction avec NS5B, comme étant à l’origine des propriétés particulières de GLT1. Nos résultats préliminaires ouvrent une toute nouvelle perspective sur les interactions établies par NS5A et pourraient contribuer à résoudre plusieurs énigmes sur la réplication du VHC. Ainsi, nos objectifs dans ce projet sont:

– Objectif 1 : une étude biophysique et structurale de peptides de NS5A définis à partir des résultats sur GLT1 et d’autres isolats post-transplantation et à partir de modélisations avancées utilisant AlphaFold.

– Objectf 2 : Des structures cristallographiques en phases cubiques lipidiques. Le construit envisagé a aussi été défini grâce à AlphaFold et devrait permettre à NS5A de s’assembler dans cet environnement mimant une membrane.

– Objectif 3 : La structure cristallographique en phases cubiques lipidiques du complexe NS5A-NS5B.

– Objectif 4 : Finalement, de nouvelles modélisations avancées de NS5A-NS5B de souches hyperréplicatives, modélisations appuyées sur les résultats structuraux des objectifs 1-3.

Le virus de l’hépatite E (VHE) est responsable de la majorité des cas d’hépatites aigües et de jaunisse dans le monde. Chaque année, 20 millions de personnes sont infectées et environ 60000 en décèdent. Le VHE représente un problème de santé publique à la fois pour les pays en voie de développement et pour les pays développés. Dans les premiers la contamination se fait essentiellement par ingestion d’eau souillée par de matières fécales alors que dans les second la transmission est principalement zoonotique ou alors associée à des greffes d’organes et transfusions sanguines. En Europe, lors des 10 dernières années le nombre de cas reportés d’infection par le VHE a été décuplé. A l’exception d’un vaccin uniquement disponible en Chine, il n’existe à ce jour pas de traitement spécifique pour combattre cette infection. Le VHE est un petit virus icosaédrique (27-34nm), de la famille des Hepeviridae, qui contient une molécule d’ARN simple brin de 7.2kb. Les particules infectieuses sont nues dans les selles et la bile mais enveloppées lorsqu’elles circulent dans le sang, par des lipides provenant des exosomes des cellules infectées. Le VHE est donc un virus quasi-enveloppé. Son ARN génomique code pour 3 protéines : ORF1, ORF2 et ORF3. ORF1 possède les enzymes requises pour la réplication de l’ARN viral, ORF2 correspond à la protéine de capside et est un déterminant antigénique majeur ; enfin ORF3 est une petite protéine encore mal caractérisée. Elle possède deux régions hydrophobes ainsi qu’une région riche en proline qui est prédite désordonnée. ORF3 interagit avec de nombreuses protéines de l’hôte et virales. Elle pourrait être impliquée dans l’établissement d’un contexte cellulaire favorable au cycle du virus. ORF3 n’est pas directement impliquée dans la réplication de l’ARN viral et dans l’assemblage des virions mais est requise pour la sécrétion des particules infectieuses. Ce processus se fait via l’interaction avec la protéine Tsg101 du complexe ESCRT-I, laquelle est impliquée dans le bourgeonnement de plusieurs virus enveloppés, comme le VIH ou Ebola. ORF3 a été localisée au niveau des membranes intracellulaires et également de la membrane plasmique. Une insertion transmembranaire, associée à un processus d’oligomérisation, a été proposée pour ORF3 qui formerait alors une viroporine. Cependant, il a également été montré que l’association membranaire de ORF3 est liée à la palmitoylation de sa région riche en cystéine.

Afin de mieux comprendre le(s) rôle(s) que joue(nt) ORF3 dans le cycle du VHE nous souhaitons réaliser une étude structurale et fonctionnelle de cette protéine. Nous produirons cette protéine de manière recombinante puis étudierons sa structure 3D et sa dynamique, par RMN en solution. Nous chercherons à identifier l’ensemble des déterminants moléculaires qui participent à l’ancrage membranaire de ORF3 et testerons sa fonction potentielle de viroporine. Pour étudier ORF3 dans un contexte membranaire par RMN en solution, nous utiliserons notamment la technologie des nanodisques (bicouche lipidique stabilisée par une protéine d’assemblage). Nous visons à déterminer un modèle structural de la protéine ORF3 ancrée à la membrane. Ensuite, nous chercherons à mettre en évidence une potentielle interaction entre ORF3 et deux peptidyl-prolyl cis/trans isomérases humaines, CypA et FKBP12, qui ont récemment été impliquées dans la palmitoylation et l’ancrage membranaire de la protéine Tat du VIH. Enfin, nous caractériserons, toujours par RMN, les bases moléculaires de l’interaction de ORF3 avec la protéine Tsg101. Les résultats de ce projet devraient nous permettre de mieux appréhender le fonctionnement de ORF3 au cours du cycle du VHE, et pourraient, à plus long terme, être utilisés pour concevoir des inhibiteurs ciblant cette protéine ou ses interactions.