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Les infections par les papillomavirus humains (VPH), l’herpès (HSV-2), le virus d’Epstein-Barr (EBV) et le VIH comptent parmi les infections virales humaines les plus répandues à travers le monde. Ces virus se transmettent pour la plupart par voie sexuelle et la majorité des femmes est infectée par les VPH très tôt, lors des premiers rapports sexuels. De plus, les femmes africaines sont à la fois les plus infectées par les VPH (24%), l’herpès (37%) ou le VIH. En France métropolitaine, les femmes immigrées africaines pourraient présenter une épidémiologie de l’infection à VPH similaire de celle rencontrée dans leur pays d’origine. Pourtant, il n’existe que très peu, ou pas de données sur l’épidémiologie de l’infection à VPH dans cette population vulnérable et à haut risque. Il devient dès lors nécessaire d’étudier l’épidémiologie de l’infection à VPH dans cette population ainsi que les potentiels facteurs de risque (virologiques, sociodémographiques) qui pourraient l’influencer. En effet, cela pourra apporter de nouvelles informations importantes pour la prise en charge des femmes immigrées d’origine africaine, notamment en adaptant les stratégies de prévention contre l’infection à VPH et le cancer du col de l’utérus à cette population clé. Nous nous proposons dans cette étude de dresser, dans une population de femmes immigrées originaires d’Afrique sub-Saharienne vivant en France métropolitaine, l’épidémiologie de l’infection à VPH et les potentiels facteurs de risques propre à cette population qui pourraient l’influencer. Dans un second temps, nous explorerons chez les femmes présentant des facteurs de risque élevé, des corrélations entre les signatures d’intégration viral du VPH et l’évolution clinique de l’infection.

La compréhension des mécanismes responsables de la latence du VIH-1 représente actuellement un enjeu majeur. Parmi ces mécanismes, la latence provirale ciblant la transcription contrôlée par le LTR5′ est considérée comme un état viral silencieux. Hors, il est maintenant démontré qu’en plus d’une transcription sens, le VIH-1 possède une transcription antisens. Différentes populations d’ARN antisens (non-épissés et épissés) ont été décrites in vitro, en particulier dans des lymphocytes T infectés de façon latente. Ceci modifie de façon profonde la vision de la latence provirale. En effet, le virus n’est pas “dormant” puisque des produits antisens sont détectés. En outre, des données de différentes équipes montrent que les transcrits antisens pourraient être directement acteurs de la latence en influençant l’activité du LTR5′ ou sa réactivation. Nous faisons l’hypothèse que les transcrits antisens pourraient jouer un rôle important dans la latence in vivo, en particulier chez les sujets infectés contrôlant la réplication virale.

Notablement, l’expression des transcrits antisens a été montrée chez des patients sous thérapie antivirale, mais pour le moment uniquement chez 5 sujets. Il parait donc nécessaire de lancer une étude à large échelle pour confirmer  l’expression des transcrits antisens in vivo, en lien avec les différentes situations cliniques. Dans ce cadre, notre objectif global est de mettre en place les outils et méthodes nécessaires à l’étude de la transcription antisens du VIH-1 dans des lymphocytes T de patients. Nous nous appuierons sur nos travaux portant sur le HTLV-1, qui nous ont déjà conduits à développer un protocole de RTqPCR spécifique des ARN antisens. Nous allons travailler sur deux objectifs spécifiques:

1) Mise au point d’un protocole de RTqPCR applicable aux échantillons cliniques

Pour les différentes mises au point, nous allons travailler sur des ARN extraits de lymphocytes T CD4+ Jurkat non infectés ou infectés avec la souche pNL4.3.

Pour les transcrits épissés, nous utiliserons des amorces spécifiques de la jonction d’épissage, assurant une détection spécifique. Pour les transcrits non épissés, nous utiliserons le protocole “RT tag” mis en place pour le HTLV-1, basé sur une amorce de transcription inverse composée d’une séquence neutre (tag) fusionnée à une séquence complémentaire du brin antisens. La PCR est ensuite réalisée en utilisant la séquence tag et une séquence virale comme amorces.

L’application aux patients nécessite de prendre en compte la diversité virale. En nous basant sur les séquences du groupe M disponibles (HIV Sequence Compendium), nous rechercherons dans chaque région d’amplification la zone la plus conservée et introduirons des bases dégénérées pour permette la détection d’un maximum de variants. Nous testerons ensuite les meilleures conditions en termes de concentration de primers, température et durée d’amplification et de méthode de PCR et de normalisation (gènes de ménage, transcrits sens, charge provirale).

2) Caractérisation de l’expression des transcrits antisens dans des lymphocytes T CD4+ 

Nous quantifierons le niveau d’expression des lymphocytes T dans des Jurkat J1.1 (provirus complet) avant (latence) ou après (productive) réactivation par le TNF.

Nous étudierons également l’expression des différents transcrits dans des cellules Jurkat infectées par la souche pNL4.3 après blocage ou induction de la transcription sens. Nous répéterons ces expériences dans des lymphocytes T CD4+ primaires infectés in vitro soit par la souche pNL4.3 soit par un isolat primaire (91US054 clade B). Nous nous intéresserons aussi à l’étape de réactivation de provirus latents en nous basant sur l’article de Martins et al (PMID:30918072) ayant analysé la réactivation virale dans des lymphocytes T CD4+ primaires mémoires générés et infectés in vitro.

Ce premier travail nous fournira les conditions pour comparer l’expression des transcrits antisens dans différentes cohortes de patients infectés par le VIH-1. Ceci se fera en collaboration avec le groupe de Véronique Avettand-Fènoël, spécialiste du suivi des patients, qui a rejoint notre équipe en 2019.

Bien qu’un vaccin soit disponible depuis 1982, le virus de l’hépatite B (VHB) reste un problème de santé mondial. Le VHB est un virus enveloppé dont les glycoprotéines (GP) d’enveloppe L, M et S sont respectivement composés des domaines PreS1/PreS2/S, PreS2/S et S. PreS1 est important pour la liaison au récepteur, NTCP, et aussi à la capside. Ces GPs ont une double topologie associée à différentes étapes du cycle de vie. La première topologie, dite “immature”, correspond à PreS1 exposé à l’intérieur de la particule virale et semble importante pour l’assemblage du VHB via une interaction entre PreS1 et la capside. La deuxième topologie est appelée “mature”, correspond à l’exposition de PreS1 à la surface du virus, ce qui permet la liaison de PreS1 au récepteur.

La mise en évidence du mécanisme de maturation des GP du VHB restent est importante pour comprendre comment le VHB devient infectieux au bon moment et au bon endroit afin éviter une “immobilisation extra-hépatique” ou d’échapper aux anticorps neutralisants.

Aussi, nous avons initié des analyses de coévolution des GPs des différents génotypes (Gt) pour sélectionner et caractériser des résidus d’intérêt pour la maturation et/ou le switch topologique des GPs. La plupart des séquences Gt-A/B/C possèdent une extension N-terminale de 11 résidus (appelée peptide +11AA) par rapport à la plupart du Gt-D. L’un des clusters de coévolution identifié présente 9 positions d’intérêt qui sont réparties sur les 3 domaines (PreS1, PreS2 et S) et qui co-varient avec la présence ou non du peptide 11AA. Dans des études préliminaires, nous avons étudié 2 positions de ce cluster qui sont situées dans PreS1 et qui ont été mutées dans Gt-D L GP (T18V et S19P) en plus d’y introduire les 11 premiers résidus de PreS1 du Gt-C, dans le but d’étudier la production de virions, l’infectivité, les essais de liaison à NTCP et la topologie des GPs. Alors que les virus exposant le peptide +11AA étaient moins infectieux que le WT, en accord avec des études précédentes, nous avons constaté que les particules virales possédant les mutations +11AA/T18V ou +11AA/S19P avaient une infectivité restaurée à des niveaux similaires au WT, ce qui était corrélé aux niveaux de liaison à NTCP. Pour mieux comprendre ces observations, nous avons réalisé une étude topologique des particules virales WT et mutantes. Nous avons constaté que, par rapport aux particules WT, les virions possédant le peptide +11AA présentaient un plus grand nombre de L GP immature, entraînant ainsi une exposition plus faible de PreS1 à la surface du virus, tandis que les virions avec la mutation +11AA/T18V présentaient une topologie similaire au WT. Nous avons donc conclu que le peptide 11AA ainsi que ce cluster de coévolution contenant la position 18 était important pour le switch topologique de L GP.

Ce projet a trois objectifs. Premièrement, nous poursuivrons l’analyse de la coévolution de la L GP et de la protéine Core du VHB, ou de la protéine L-HDAg du VHD, afin d’explorer la coévolution potentielle GPs et de la capside/ribonucléocapside et les résidus du cluster impliqués dans la maturation ou le switch topologique. Ensuite, nous explorerons les facteurs environnementaux qui pourraient réguler la maturation des GP. Plus précisément, nous nous concentrerons sur i) le pH et la charge des acides aminés, et des facteurs ioniques; ii) les facteurs du sérum ou sécrétés par les hépatocytes; et iii) les facteurs intracellulaires. Troisièmement, nous réaliserons des essais in vitro et in vivo pour étudier la cinétique de maturation des virions et comprendre le lien entre le changement de topologie des GPs et l’échappement à la neutralisation par les anticorps et/ou à l’immobilisation extra-hépatique.

Globalement, ce projet permettra de déterminer quels résidus sont impliqués dans le changement de topologie des GPs mais aussi l’importance des différents GPs et de leurs domaines sur le processus de maturation. Nous mettrons en évidence des facteurs de l’hôte potentiellement nécessaires à la maturation des virions. Enfin, nous mettrons en évidence le lien éventuel entre la maturation et l’échappement immunitaire.

Le laboratoire a précédemment montré que le degré d’apoptose détectable dans les organes lymphoïdes au cours de la phase de primo-infection chez le macaque rhésus infecté par le virus SIVmac251 est prédictif de l’évolution ultérieure vers un Sida. Nos récents travaux montrent que l’injection au cours de la phase de primo-infection d’un inhibiteur des caspases, diminue la mort des lymphocyte T CD4, réduit l’inflammation ainsi que la charge virale plasmatique, et impacte sur l’évolution vers un Sida. Parallèlement, nous avons montré que l’infection par SIV conduit à une déplétion précoce des cellules T folliculaires auxiliaires (Tfh) dans la rate comme dans les ganglions mésentériques.

Nous souhaitons dans ce projet déterminer dans quelle mesure cet inhibiteur de caspases permet d’améliorer des stratégies antivirales actuelles, et de préserver les cellules Tfh et ainsi améliorer la réponse humorale, capable de réduire les réservoirs viraux. Ainsi, nous nous proposons d’analyser (i) la dynamique des cellules Tfh et le profil d’expression génique, (ii) la dynamique des cellules B, la production d’anticorps spécifiques, et la redistribution des cellules en relation avec le remodelage du follicule B dans les tissus lymphoïdes, ainsi que (iii) la taille des réservoirs viraux, la diversité génétique du virus et le rebond viral après interruption  de la ART.

Cette étude jettera les bases d’études visant à améliorer les thérapies chez les personnes vivant avec le VIH.

Objectifs

L’objectif du projet est de mettre en évidence un lien entre la résistance naturelle aux nouveaux antituberculeux (ATTB) et les lignées ou sous-lignées phylogénétiques des souches de Mycobacterium tuberculosis (MTB) afin de pouvoir dans l’avenir choisir le traitement le plus adapté à la souche infectante de MTB et au patient, dans une perspective de médecine personnalisée. .

Situation du sujet

La tuberculose (TB) demeure un problème majeur de santé publique, avec 10 millions de cas annuels répartis de manière inégale entre les pays à revenu élevé, moyen et faible. L'émergence et la propagation d'un demi-million de cas multirésistants (TB-MDR) (résistants à l'isoniazide et à la rifampicine, antituberculeux majeurs de première ligne) chaque année aggrave la situation. Heureusement, de nouveaux médicaments antituberculeux (ATTB), tels que le prétomanide et la bédaquiline, sont désormais disponibles et, lorsqu'ils sont associés à d'autres ATTB de deuxième ligne, tels que le linézolide et la moxifloxacine, ils permettent désormais de guérir la TB-MDR en 6 mois, contre 24 mois avec les anciens schémas thérapeutiques.

Problématique

Comme les tests de sensibilité phénotypiques sont fastidieux et nécessitent des laboratoires de niveau élevé de sécurité biologique, peu de souches du complexe Mycobacterium tuberculosis (MTB) ont été testées jusqu'à présent pour ces nouveaux ATTB. Il se trouve que certains des premiers résultats ont montré que les souches MTBC appartenant à la lignée 1, prédominante en Asie dont les Philippines, sont intrinsèquement résistantes au prétomanide. Notre hypothèse est que cette résistance dite « naturelle », car trouvée chez des souches n’ayant jamais été en contact avec ces nouveaux ATTB, est due à des signatures génétiques spécifiques de la lignée ou de la sous-lignée. Ceci rejoint l’exemple bien connu de M. bovis résistant au pyrazinamide à cause d’une mutation dans le gène pncA, présent chez toutes les souches de cette espèce.

Méthodes et échéancier

Dans le cadre de ce projet, nous rechercherons des SNP dans les gènes impliqués dans la résistance aux nouveaux antituberculeux, en les analysant lignée par lignée à l’aide d’une approche in silico basée sur l’étude de 280 000 génomes publiés et rassemblés dans la plateforme bio-informatique «TB Annotator», que nous administrons. Nous produirons aussi des génomes de souches cliniques de MTBC dans des laboratoires de mycobactériologie des Philippines, du Liban et de France (une équipe impliquée par pays). Pour les souches présentant les SNP repérés identifiés in silico comme potentiellement associés à la résistance, nous réaliserons des tests phénotypiques pour montrer la résistance aux nouveaux ATTB, et ainsi corroborer ainsi les informations obtenues par l'analyse génotypique.

Faisabilité et résultats attendus

Nous disposons(i) d’une expertise dans larecherche in silico de SNP dans les bases de données, (ii) d’une compétence reconnue dans la production et l’analyse du séquençage du génome entier (whole genome sequencing, WGS) pour le MTBC, et (iii) nous sommes référents international pour la détermination des CMI (méthode EUCAST). Grâce au consortium réunissant les trois équipes, ce projet renforcera les capacités diagnostiques et de recherche des laboratoires du Liban et des Philippines, tout en générant des résultats ayant un impact direct sur la stratégie de traitement de la tuberculose dans les trois pays. L'impact à long terme pourrait être de stratifier les recommandations de traitement en fonction de l'identification de la lignée, ce qui n'est pas faisable aujourd'hui dans les laboratoires de diagnostic. Le développement de cette capacité diagnostique constituerait une base solide pour un futur projet translationnel.

La capside du VHB formée par la protéine core est un élément central de l’infection, et ses interactions hétérologues, c’est-à-dire avec les protéines d’enveloppe, jouent un rôle crucial dans la sécrétion des particules virales. Dans ce contexte, notre objectif est de décrypter, au niveau moléculaire, ces interactions de la capside avec ses protéines partenaires. Nous voulons donc étudier, d’un point de vue moléculaire, les mécanismes qui sous-tendent l’enveloppement de la capside, en étudiant des capsides qui présentent un comportement de sécrétion altéré, soit par des mutations, soit par des génotypes naturels aux propriétés divergentes. Ce projet fait suite à un projet précédemment financé, dans lequel nous avons étudié les interactions homologues entre les protéines de capside, et qui a donné lieu à plusieurs publications, dont une dans Nature Communications. Au cours de ce projet précédent, nous avons également recueilli de nombreuses données préliminaires sur les interactions entre la capside de type sauvage et le domaine preS de la protéine d’enveloppe L. Un nouveau rapport du laboratoire Loeb lors de la conférence sur le VHB qui s’est tenue à Paris en septembre 2002 nous amène aujourd’hui à nous concentrer sur le mutant F97L, dont ils ont montré qu’il était enveloppé sous sa forme totalement immature, contenant l’ARN pré génomique. Nous avons immédiatement testé cela in vitro, et nos données montrent en effet une augmentation d’un ordre de grandeur de l’affinité entre les capsides F97L et preS par rapport aux capsides WT. Nous allons donc orienter nos études dans ce projet vers ce mutant comme référence pour l’enveloppement réussi de capsides contenant du pgRNA, et étudier les mécanismes moléculaires, ainsi que les changements induits par d’autres mutants ou variants. Nous atteindrons cet objectif en utilisant en première ligne d’attaque la résonance plasmonique de surface (SPR), méthode très sensible, pour déterminer les affinités ; dans une deuxième approche, la co-expression acellulaire sur des paires qui interagissent ; et en troisième ligne la RMN à l’état solide pour dériver les détails moléculaires des interactions. Cela nous permettra de caractériser en détail les propriétés structurales modulant la sécrétion de la capside. Notre recherche devrait fournir la base structurale pour le développement de nouveaux antiviraux ciblant les interactions hétérologues de l’enveloppe avec la capside.