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Bien qu’un vaccin soit disponible depuis 1982, le virus de l’hépatite B (VHB) reste un problème de santé mondial. Le VHB est un virus enveloppé dont les glycoprotéines (GP) d’enveloppe L, M et S sont respectivement composés des domaines PreS1/PreS2/S, PreS2/S et S. PreS1 est important pour la liaison au récepteur, NTCP, et aussi à la capside. Ces GPs ont une double topologie associée à différentes étapes du cycle de vie. La première topologie, dite “immature”, correspond à PreS1 exposé à l’intérieur de la particule virale et semble importante pour l’assemblage du VHB via une interaction entre PreS1 et la capside. La deuxième topologie est appelée “mature”, correspond à l’exposition de PreS1 à la surface du virus, ce qui permet la liaison de PreS1 au récepteur.

La mise en évidence du mécanisme de maturation des GP du VHB restent est importante pour comprendre comment le VHB devient infectieux au bon moment et au bon endroit afin éviter une “immobilisation extra-hépatique” ou d’échapper aux anticorps neutralisants.

Aussi, nous avons initié des analyses de coévolution des GPs des différents génotypes (Gt) pour sélectionner et caractériser des résidus d’intérêt pour la maturation et/ou le switch topologique des GPs. La plupart des séquences Gt-A/B/C possèdent une extension N-terminale de 11 résidus (appelée peptide +11AA) par rapport à la plupart du Gt-D. L’un des clusters de coévolution identifié présente 9 positions d’intérêt qui sont réparties sur les 3 domaines (PreS1, PreS2 et S) et qui co-varient avec la présence ou non du peptide 11AA. Dans des études préliminaires, nous avons étudié 2 positions de ce cluster qui sont situées dans PreS1 et qui ont été mutées dans Gt-D L GP (T18V et S19P) en plus d’y introduire les 11 premiers résidus de PreS1 du Gt-C, dans le but d’étudier la production de virions, l’infectivité, les essais de liaison à NTCP et la topologie des GPs. Alors que les virus exposant le peptide +11AA étaient moins infectieux que le WT, en accord avec des études précédentes, nous avons constaté que les particules virales possédant les mutations +11AA/T18V ou +11AA/S19P avaient une infectivité restaurée à des niveaux similaires au WT, ce qui était corrélé aux niveaux de liaison à NTCP. Pour mieux comprendre ces observations, nous avons réalisé une étude topologique des particules virales WT et mutantes. Nous avons constaté que, par rapport aux particules WT, les virions possédant le peptide +11AA présentaient un plus grand nombre de L GP immature, entraînant ainsi une exposition plus faible de PreS1 à la surface du virus, tandis que les virions avec la mutation +11AA/T18V présentaient une topologie similaire au WT. Nous avons donc conclu que le peptide 11AA ainsi que ce cluster de coévolution contenant la position 18 était important pour le switch topologique de L GP.

Ce projet a trois objectifs. Premièrement, nous poursuivrons l’analyse de la coévolution de la L GP et de la protéine Core du VHB, ou de la protéine L-HDAg du VHD, afin d’explorer la coévolution potentielle GPs et de la capside/ribonucléocapside et les résidus du cluster impliqués dans la maturation ou le switch topologique. Ensuite, nous explorerons les facteurs environnementaux qui pourraient réguler la maturation des GP. Plus précisément, nous nous concentrerons sur i) le pH et la charge des acides aminés, et des facteurs ioniques; ii) les facteurs du sérum ou sécrétés par les hépatocytes; et iii) les facteurs intracellulaires. Troisièmement, nous réaliserons des essais in vitro et in vivo pour étudier la cinétique de maturation des virions et comprendre le lien entre le changement de topologie des GPs et l’échappement à la neutralisation par les anticorps et/ou à l’immobilisation extra-hépatique.

Globalement, ce projet permettra de déterminer quels résidus sont impliqués dans le changement de topologie des GPs mais aussi l’importance des différents GPs et de leurs domaines sur le processus de maturation. Nous mettrons en évidence des facteurs de l’hôte potentiellement nécessaires à la maturation des virions. Enfin, nous mettrons en évidence le lien éventuel entre la maturation et l’échappement immunitaire.

L'infection par le virus de l'hépatite C (VHC) peut entraîner des hépatites chroniques et des maladies hépatiques mortelles telles que la cirrhose et le carcinome hépatocellulaire. Le développement d'agents antiviraux a permis une meilleure prise en charge des patients mais ces traitements sont coûteux et ne sont pas accessibles à toutes les populations. Les protéines impliquées dans les interactions entre le virus et son hôte constituent de nouveaux candidats thérapeutiques prometteurs et nous proposons d'étudier l'une de ces protéines : HELZ2. La littérature récente relie HELZ2, un gène stimulé par l'interféron, à la réponse contre les infections virales. Ainsi, HELZ2 a été décrit comme supprimant la réplication du VHC, mais les détails de son mécanisme d'action manquent. Ce projet vise donc à décrypter le rôle de HELZ2 lors de l'infection par le VHC.

Nos analyses récentes ont révélé que HELZ2 possède des activités ribonucléase et hélicase. Ainsi, notre hypothèse de travail est que HELZ2 interfère avec le VHC en dégradant les ARN de l’hôte et/ou du virus. Nous avons généré des lignées cellulaires HeLa et Huh7 knock-out pour HELZ2 par CRISPR/Cas9 et les utiliserons pour étudier l'impact de HELZ2 sur le transcriptome cellulaire en comparant les niveaux des ARN dans les cellules sauvages ou HELZ2-/-, avec ou sans stimulation par l’interféron. Cela nous permettra d'identifier les gènes hôtes et les voies contrôlées par HELZ2 lors de son induction. Pour tester l’impact de HELZ2 sur le VHC, nous utiliserons un réplicon, dans lequel les protéines structurales virales ont été remplacées par un gène rapporteur. Puisque HELZ2 contient des domaines interagissant avec l’ARN, l’interaction entre la protéine et l’ARN viral sera étudiée biochimiquement. De même, les interactions entre HELZ2 et les protéines hôtes ou virales seront évaluées par des expériences de co-immunoprécipitation. L'inactivation de HELZ2 dans les cellules Huh7, qui peuvent supporter les infections par des réplicons basés sur le VHC, nous permettra de suivre la réplication virale en mesurant l'activité du gène rapporteur et/ou les niveaux d'ARN viral dans des cellules sauvages ou HELZ2-/-. L'induction de HELZ2 par l'accumulation d'ARN viral dans les cellules infectées sera analysée et des méthodes de séquençage des ARN à haut débit qui identifieront les ARN endogènes et viraux affectés par HELZ2.

Au total, ces expériences visent à confirmer l'implication de HELZ2 contre le VHC et donneront un aperçu du rôle de HELZ2 au cours de la réponse immunitaire innée qui pourrait être transposable à d'autres infections virales.

L’intégration du génome du VIH-1 se produit principalement dans les régions actives de la chromatine. Ceci est une condition favorable pour une réplication virale efficace, cependant, le VIH-1 coexiste avec l’hôte pendant des périodes prolongées à l’état latent. La régulation spatio-temporelle des premières étapes du cycle de vie du VIH-1 et l’environnement nucléaire de l’hôte sont des déterminants essentiels de l’issue de l’infection. Notre équipe est intéressée à l’étude fondamentale des premières étapes de la réplication du VIH-1, avec un accent particulier sur les mécanismes impliqués dans l’import nucléaire actif des complexes de réplication viraux et dans le remodelage du compartiment nucléaire au cours de l’infection. En particulier, nous pensons que le VIH crée des microenvironnements nucléaires qui entravent son éradication.

 Selon les vues actuellement admises, la transcription inverse (RT), le processus responsable de la synthèse de l’ADN viral, se produit exclusivement dans le cytoplasme. Des outils de microscopie de pointe combinés à la virologie moléculaire nous ont permis de revisiter ce « dogme ». Nous avons découvert que les génomes d’ARN du VIH peuvent pénétrer dans le noyau et former des amas dans des niches nucléaires où ils sont rétrotranscrits en ADN viral fonctionnel. Cinquante ans après la découverte de la RT, nous avons ainsi montré que cette étape cruciale de la réplication virale peut également se produire dans le noyau de la cellule hôte. Nos résultats récents montrent que le VIH lors de l’entrée nucléaire provoque un phénomène appelé séparation de phase (LLPS) générant des organelles sans membrane (MLO) dans le noyau hôte. Les MLOs non seulement augmentent les vitesses de réaction, mais agissent également comme un filtre pour sélectionner les molécules à retenir ou à exclure de la gouttelette liquide. Il est à noter que la LLPS est à l’origine de plusieurs processus biologiques et maladies. Nous avons récemment décrit les VIH-MLOs comme des centres où se déroulent la RT et la formation du complexe de pré-intégration (PIC), tandis que les provirus activement transcrits se localisent dans la chromatine des MLO voisins. Notre étude révèle la localisation des génomes viraux intranucléaires dans une cellule unique, mettant en évidence que les condensats biomoléculaires orchestrent les étapes d’entrée post-nucléaire du VIH-1.

Cependant, on ne sait pas si des facteurs clés du VIH-MLO régulent les étapes virales intranucléaires individuelles. Plusieurs spéculations peuvent être proposées pour expliquer la présence de ces structures nucléaires virus/hôte: (i) pour servir de microréacteurs nucléaires pour la RT et la coalescence des facteurs de l’hôte pour favoriser la synthèse de l’ADN virale; (ii) pour servir de microenvironnement qui inclut des facteurs viraux et hôtes requis pour la génération d’une nouvelle descendance virale et/ou pour cacher le virus des mécanismes de défense cellulaire ; (iii) servir de centre de la transcription virale active pour diffuser rapidement la nouvelle descendance virale.

L’hypothèse susmentionnée peut être étudiée en démêlant le mécanisme sous-jacent à la biogenèse des MLO du VIH-1 et leur rôle dans la transcription inverse et la réplication virale.

Notre proposition vise à élucider la biogenèse/fonction des MLO et leur contribution à la réplication virale.

Les objectifs de la proposition sont :

1. Décrypter le mécanisme sous-jacent à l’établissement/la persistance/la fonction des virus-hôte-MLO.
2. Composition structurelle des VIH-MLO et leur persistance en tant que centre de la réplication virale.
3. Fonction VIH-MLOs et leur remodelage pour réguler la transcription virale.

 Nous pensons que l’étude proposée à l’ANRS peut donner lieu à des résultats qui permettront d’améliorer nos connaissances sur le cycle de vie des rétrovirus, notamment pour le VIH.