Winning projects and candidates

HTLV-1 (Virus T-lymphotrope humain de type 1) est un rétrovirus ciblant les lymphocytes T CD4+, responsable d’une maladie neuro-inflammatoire TSP/HAM (paraparésie spastique tropicale/myélopathie associée à HTLV-1) et d’un cancer agressif, l’ATL (leucémie/lymphome T aiguë de l’adulte). La population de lymphocytes T infectés par HTLV-1 regroupe des cellules exprimant les gènes viraux mais également des cellules dans lesquelles le provirus est latent en raison de la répression de la Longue Répétition Terminale 5’ (LTR5’). Ceci constitue une stratégie virale pour échapper au système immunitaire, permettre la persistance virale et favoriser le développement de l’ATL. Le LTR5’ comprend le promoteur contrôlant l’expression des gènes viraux dont le gène du transactivateur viral Tax, qui transactive en retour ce même promoteur en induisant un remodelage nucléosomal à proximité́ du site d’initiation de la transcription. HBZ, gène viral transcrit dans l’orientation antisens à partir du LTR3’, est le seul produit viral exprimé à tous les stades cliniques, incluant l’ATL. HBZ est capable de bloquer la transactivation par Tax, agissant ainsi comme un facteur viral de latence.

Ce projet de recherches vise à mieux comprendre les mécanismes moléculaires régulant la transcription et la latence du HTLV-1, en se focalisant sur le rôle du facteur cellulaire BCL11b. En effet, les données préliminaires du groupe de Carine Van Lint montrent que BCL11b est recruté au niveau du LTR5’ et inhibe sa transactivation par Tax, ceci étant associé à l’induction de la dégradation de Tax par la voie de l’autophagie (résultats non publiés).

Pour poursuivre cette étude, nous allons (i) étudier le recrutement de BCL11b et de ses partenaires au niveau du LTR5’, (ii) caractériser l’interaction entre BCL11b et Tax ainsi que (iii) les déterminants cellulaires impliqués dans la dégradation de Tax induite par BCL11b. Pour ce faire, nous utiliserons d’abord des lignées cellulaires infectées de manière latente par le HTLV-1 puis validerons les données obtenues avec des PBMCs provenant de sujets infectés par le HTLV-1 soit asymptomatiques, soit HAM/TSP, soit ATL. En outre, nous étudierons le lien potentiel entre BCL11b et HBZ en analysant (iv) l’impact de BCL11b dans la régulation transcriptionnelle du LTR3’ et (v) l’interaction potentielle entre BCL11b et HBZ et donc leur possible synergie dans la répression du LTR5’. Enfin, nous étudierons (vi) le rôle de BCL11b dans l’accessibilité́ de la chromatine du génome HTLV-1 mais également l’accessibilité des gènes cellulaires cibles de BCL11b en réalisant des expériences d’ATAQ-seq sur des cultures ex-vivo de PBMCs provenant d’individus infectés par le HTLV-1 soit asymptomatiques, soit HAM/TSP, soit ATL, cultures dans lesquelles BCL11b aura été déplété par interférence ARN.

Ce projet basé sur la collaboration entre différentes équipes de cliniciens et des scientifiques spécialistes du HTLV-1 nous permettra de déterminer la relation HTLV-1/BCL11b en validant nos données dans le modèle le plus physiologique que sont les cellules primaires d’individus infectés par le HTLV-1. Nos résultats contribueront à une compréhension plus approfondie des mécanismes viraux et cellulaires d’établissement et de maintien de la latence du HTLV-1, ce qui pourra conduire au développement de nouvelles stratégies thérapeutiques potentielles contre ce virus.

L’étude que nous proposons ici est un préalable nécessaire pour la mise en place ultérieure d’une étude sur le rôle de BCL11b chez les individus co-infectés VIH/HTLV. L’obtention des résultats prévus au terme de la première année (et non au terme des deux ans de financement) nous permettront de démarrer les premières études sur les individus co-infectés VIH/HTLV.

L’identification de nouveaux modulateurs viraux est à la base de notre compréhension des interactions entre hôte et pathogène et un certain nombre de laboratoires ont, et consacrent à présent, leurs efforts vers cet objectif. Compte tenu de l’intérêt que représentent les cellules de la lignée myéloïde et la stimulation par l’interféron dans la régulation de la réplication du VIH, nous avons par le passé réalisé un criblage génétique basé sur des shRNA de gènes régulés par l’interféron dans des cellules de type macrophage THP-1-PMA pour identifier des modulateurs des étapes précoces de l’infection virale. Cette analyse a été complété par un criblage évolutif pour identifier gènes ayants un rôle potentiel aussi dans la transmission lentivirale entre les primates.

Ces analyses ont conduit à l’identification de plusieurs candidats d’intérêt en soi, ou pour les rôles qu’ils jouent dans des voies cellulaires plus complexes. Ce projet vise à caractériser en profondeur le rôle de deux de ces protéines. La première est TRIM69, membre relativement mal connu de la famille TRIM, très récemment décrit comme un régulateur négatif de l’infection par les Rhabdovirus et pour lequel nous avions déjà accumulé des preuves d’un rôle régulateur lors de la transcription inverse dans un contexte de type cellulaire myéloïde contre le VIH-1. Dans ce cas, nous proposons un certain nombre d’expériences supplémentaires que nous jugeons nécessaires et qui visent spécifiquement à comprendre les relations entre TRIM69, SAMHD1, ainsi que les capsides virales et les protéines cellulaires associées.

La seconde est la protéine Absent in Melanoma 2 (AIM2), classiquement décrite comme un senseur d’ADN et inducteur de l’inflammasome.AIM2 est une protéine de liaison à l’ADN de la famille PYHIN, comme IFI16, et n’a pas été jusqu’à présent directement liée à la réplication du VIH-1. Étant donné que notre crible la met en évidence comme un régulateur négatif des phases précoces de l’infection par le VIH dans un environnement induit par l’IFN, nous explorerons si et comment cette protéine seule ou dans le cadre du complexe inflammasome peut moduler l’infection virale.AIM2 joue un rôle clé dans l’assemblage de l’inflammasome, un processus qui, en réponse à une infection virale ou bactérienne, conduit à la formation d’un complexe dépendant de la protéine ASC et qui aboutit à l’activation de la protéase caspase 1 et, par conséquence, à la sécrétion d’IL1b/IL18 et/ou à la pyroptose (mort cellulaire induite par l’inflammasome. Cependant, la régulation et les conséquences de l’activation de ce processus sont bien plus complexes que cela et leur relation avec le VIH reste méconnue. Malgré des rapports initiaux sur l’engagement exclusif de la voie pyroptotique dans les cellules T des ganglions lymphatiques, il existe des preuves de l’activation de l’inflammasome dans des cellules du sang périphérique. Ici, nous déterminerons plus systématiquement si, quand et dans quelles cellules l’inflammasome peut être activé lors de la réplication virale et parmi les conséquences de cette activation, nous porterons une attention particulière aux modifications possibles de la sensibilité des cellules cibles à l’infection.

Dans l’ensemble, nous visons à fournir une caractérisation plus complète d’au moins deux nouveaux acteurs de l’infection par le VIH dont l’un impliqué dans une voie de défense cellulaire complexe, dans un projet qui constitue un axe de recherche important pour notre laboratoire déjà soutenu par l’ANRS.

Chez les eucaryotes, la traduction est un processus dynamique et rapide qui est régulé à la fois par la structure intrinsèque de l’ARN et de nombreuses protéines cellulaires qui se fixent sur l’ARNm. Contrairement au mécanisme de traduction procaryote, la sous-unité 40 S ne peut pas se lier directement sur l’ARN et l’attachement a lieu par le biais d’interactions ARN-protéines qui se mettent en place grâce à un ensemble de 12 facteurs d’initation (eIFs pour eukaryotic Initiation Factors). La sous-unité 40 S du ribosome associée à ces facteurs d’initiation constitue le coeur d’un vaste complexe macromoléculaire auquel se joint de nombreuses autres protéines de liaison à l’ARN pour former le complexe de préinitiation. Celui-ci a une composition variable en fonction de l’ARN considéré ce qui module sa fonction et lui permet de s’adapter aux contraintes structurelles que l’on trouve chez certains transcrits.

L’initiation de la traduction chez les eucaryotes, qu’elle soit opérée à partir de l’extrémité 5’ (coiffe-dépendante) ou en position interne (IRES-dépendante) consiste à attirer et lier le complexe de préinitiation sur l’ARNm afin qu’il puisse parcourir la région 5′ non traduite (5’UTR) pour accéder au codon AUG. Lorsqu’il arrive sur le site initiateur, ce complexe de préinitiation est dissocié pour permettre la liaison de la sous-unité 60 S du ribosome et constituer le ribosome 80S; celui-ci va ensuite parcourir la phase codante pour produire la protéine d’intérêt. L’étape d’initiation est l’étape limitante et elle détermine le taux de production protéique global de l’ARN concerné. A ce titre, l’initiation de la traduction est un processus extrêmement régulé et contrôlé à la fois par la structure de l’ARNm et la composition du complexe de préinitiation.

L’ARN génomique du VIH-1 est traduit dans le cytoplasme de la cellule infectée par la machinerie cellulaire de l’hôte et code pour les polyprotéines Gag et Gag/Pol. Il commence par une coiffe (guanosine méthylée-m7GTP) qui est suivie par une longue région 5′ non traduite (5’UTR) de 336 nucléotides qui contient de nombreux motifs complexes d’ARN dont la tige boucle TAR, le PBS, les signaux de dimérisation (DIS) et d’encapsidation (Psi). L’initiation de la traduction de l’ARNg est particulière puisqu’elle peut s’opérer à la fois à partir du 5′ de l’ARN (mécanisme coiffe-dépendant) ou sur 2 séquences IRES distinctes qui se trouvent dans la région 5’UTR (IRES1) et au début de la phase codante pour Gag (IRES2). Il est donc possible de recruter 3 complexes de préinitiation sur l’ARNg mais on ne sait pas si ces complexes peuvent se former simultanément ou si leur assemblage est mutuellement exclusif. On ne connait pas leur composition protéique ni leur dynamique d’assemblage au cours de la progression du cycle viral ou de l’état physiologique de la cellule hôte. En revanche, on sait qu’ils ont une composition variable en fonction de leur site de recrutement sur l’ARN.

Les objectifs de ce projet sont de cartographier et identifier la composition de ces complexes d’initiation sur leurs sites d’assemblage, c’est à dire à l’extrémité 5′ de l’ARN (coiffe/TAR) ou au niveau des 2 IRES afin de mieux comprendre comment s’articule la traduction du VIH-1. Pour ce faire, nous utiliserons la technique récente de biotinylation de proximité en combinaison avec un système d’édition de type CRISPR/Cas13 pour cibler des régions précises de l’ARN génomique. Cela permettra de cartographier les interactions protéines-protéines et déterminer le réseau complexe de ces interactants dans un rayon d’environ 10 nm autour des sites d’initiation.

L’infection par le VIH est à ce jour incurable du fait de la persistance du virus dans les réservoirs cellulaires. En outre, les patients infectés sont exposés, même sous traitement antirétroviral (TARV), à une inflammation chronique et une dysfonction immunitaire, en partie liée à l’expression de molécules inhibitrices (immune check points, ICP) tels que PD-1 sur les lymphocytes T et PD-L1/-L2 et les LILRs sur les cellules myéloides. Ces réseaux de protéines inhibitrices contribuent à l’« exhaustion » (épuisement) des lymphocytes T. La modulation de l’activation immune chronique et la lutte contre les réservoirs viraux sont deux priorités de la recherche fondamentale et clinique.

Dans ce contexte, les voies des Interférons (IFN) et leur régulation constituent des cibles thérapeutiques intéressantes. Ces cytokines sont produites très tôt au cours de l’infection et leur action sur les cellules immunitaires induit, via l’activation des voies JAK-STAT, l’expression de gènes (Interferon stimulated genes ou ISG) impliqués dans la régulation de l’activation immune et la restriction antivirale. Les IFN sont indispensables pour la coordination de l’action antivirale dans les phases précoces. Néanmoins, la persistance de leur action en phase chronique avec une expression anormale des ISGs est associée à l’inflammation résiduelle. Certains ISGs sont des gènes codant pour des ligands d’ICP, comme PD-L1/-L2, induits par l’IFNγ en particulier.

Des études récentes suggèrent que les sous-types IFN non-α2 pourraient optimiser l’action antivirale. Les données préliminaires obtenues par nos équipes suggèrent que l’IFNα14 et l’IFNβ réduisent l’infection des lymphocytes T (LT) CD4 primaires, notamment mémoires centraux. L’impact de ces sous-types sur l’induction d’ISG dans LT CD4 ou sur l’inflammation n’est pas bien connu. Par ailleurs, les inhibiteurs de JAK1 et 2 ont des effets anti-inflammatoires et inhibent la voie de signalisation des IFN. Le ruxolitinib (anti-JAK1/2) semble avoir des effets intéressants sur la régulation des réservoirs viraux mais aucune donnée concernant la régulation de l’activation immune au cours du VIH n’a été publiée. Egalement, le baricitinib (autre anti-JAK1/2, mais non métabolisé par le cytochrome p450 – pouvant conférer moins d’interactions médicamenteuses avec les TARV) pourrait être intéressant mais n’a jamais été étudié dans ce cadre.

Nous faisons l’hypothèse que certains sous-types d’IFN type I non-α2 et/ou les inhibiteurs de de la voie JAK-STAT pourraient diminuer l’expression des ligands d’ICP comme PD-L1/L2, conduisant à une optimisation de la réponse immune avec amélioration de l’action antivirale et réduction de l’activation immune. Nous étudierons l’effet des traitements in vitro par IFN type I α2 et non-α2 (α14, β, γ), sur la modulation de l’expression des ligands d’ICP et des signatures ISG parallèlement à leur action antivirale, sur les populations de LT CD4, T CD8 et monocytes de patients infectés sous TARV en primo-infection et de volontaires sains. L’action de molécules anti-JAK 1/2 (ruxolitinib, baricitinib) sera testée sur l’expression des ligands d’ICP et la réduction des signatures ISG des mêmes populations cellulaires de patients traités en phase chronique identifiés selon leur niveau d’activation immune. 

Cette étude contribuera à mieux comprendre la régulation de l’activation immune par les sous-types d’IFN et les anti-JAK au sein des cellules primaires. Cette évaluation est un prérequis indispensable à la conduite de projets de recherche clinique utilisant ces molécules selon les stades de l’infection, dans une optique de stratégies thérapeutiques innovantes de lutte contre l’activation immune et les réservoirs viraux.

L’utilisation de traitements antirétroviraux (ARV) constitue un outil majeur pour contrôler l’épidémie de VIH. Des stratégies innovantes visant à diversifier les modalités d’administration de ces traitements sont actuellement en cours d’évaluation, voire d’implémentation, parmi lesquelles les traitements ARV à longue durée d’action (ARV-LA).

Deux molécules – le cabotégravir et la rilpivirine – administrées par voie injectable tous les deux mois, sont une alternative aux traitements oraux quotidiens, acceptable et efficace chez les Personnes Vivant avec le VIH (PVVIH) traitées et contrôlées sans résistance connue ou suspectée aux deux molécules. Ces traitements sont, depuis fin 2021, autorisés en France et prescrits en routine. Pour autant, il existe encore peu de données probantes sur leur implémentation. Cette nouvelle option thérapeutique, aussi encourageante soit-elle, ne peut faire l’économie d’une réflexion sur les conditions et les enjeux de son implémentation. En effet, au-delà des questions d’efficacité, de tolérance et d’acceptabilité de ces traitements, se posent les questions de leur accessibilité, du contexte, des modalités et des effets de leur implémentation. Les défis de mise en œuvre sont nombreux et les enjeux d’équité d’accès importants. En outre, les questions relatives à l’implémentation de ces traitements seront renouvelées et évolueront avec l’avènement prochain d’autres ARV-LA.

Le présent projet en sciences sociales a pour objectif principal de comprendre les conditions d’accès aux traitements ARV-LA en France et leurs effets cliniques et sociaux, afin de déceler d’éventuelles inégalités d’accès. Il s’agira plus spécifiquement de (1) décrire et analyser les contextes d’implémentation des ARV-LA en France – où, comment et à qui ces traitements sont-ils prescrits – et déceler les éventuelles inégalités territoriales et sociales d’accès ; (2) analyser l’impact de la diversité des contextes d’implémentation et des profils des PVVIH sur la prescription et l’utilisation au long cours pour déceler les éventuelles inégalités structurelles et sociales ; (3) comprendre les conditions de prescription et d’utilisation de ces traitements du point de vue des professionnels de santé et des PVVIH concernées et leurs effets sociaux, pour mettre en évidence les mécanismes de production des inégalités identifiées ; (4) Décrire et analyser l’efficacité virologique et clinique, les causes d’arrêt de traitements et les facteurs associés en fonctions des profils des PvVIH et des critères d’initiation aux traitements ; (5) Promouvoir l'utilisation des connaissances produites dans le cadre de ce projet grâce à la mise en œuvre d'une stratégie de transfert de connaissances.

Ce dispositif de recherche original s’articule autour d’un projet en sciences sociales qui s’appuie sur des données sociodémographiques et cliniques d’une cohorte de PVVIH existante (ANRS CO4 FHDH) pour renforcer et objectiver les résultats des études conduites en sciences sociales.  Il mobilise des chercheurs issus de disciplines diverses, des professionnels de santé et des acteurs associatifs, engagés dans le processus de recherche. Il convoque ainsi une diversité de savoirs et vise à produire des connaissances utiles pour les populations concernées à la fois par le croisement des regards et la place importante donnée à l’opérationnalité des connaissances. Il s’inscrit ainsi dans le champ des recherches participatives.

Ce projet sera réalisé sur 3 ans. Il permettra d’établir un état des lieux de l’implémentation des ARV-LA en France ; d’identifier des stratégies ou des modèles de dispensation à privilégier pour surmonter les difficultés de mise en œuvre et favoriser un accès équitable à ces traitements ; de fournir des connaissances contextualisées sur la reconfiguration de la prise en charge du VIH que génère l’implémentation des ARV-LA ; de favoriser une meilleure appropriation des résultats de la recherche par les acteurs impliqués dans la prise en charge du VIH.

Les interférons (IFN) de type I sont sécrétés par les individus infectés par le VIH-1 pendant la phase aiguë et la phase chronique de l’infection. Ils permettent de limiter la propagation virale par l’induction d’expression de gènes antiviraux et stimulent la réponse immunitaire, en particulier dans la phase précoce de l’infection. Les IFN sont impliqués dans la suractivation chronique du système immunitaire résultant en une réponse inflammatoire persistante lors de la phase chronique de l’infection au VIH-1 ; ils participent aussi à l’établissement des réservoirs cellulaires du VIH-1. Les cellules dendritiques (CD) sont à l’interface entre l’immunité innée et adaptative. Elles expriment les récepteurs permettant l’entrée du VIH-1 mais sont relativement résistantes à l’infection par le VIH-1 de par l’expression de facteurs de restriction tels que SAMHD1. Suite à la dégradation de SAMHD1 par la protéine Vpx (codée par le VIH-2 ; ou apportée expérimentalement pour étudier les mécanismes de détection du VIH-1 par les CD), les CD humaines s’infectent efficacement et peuvent détecter le VIH-1 par la protéine cGAS qui entraine la production d’IFN, la maturation des CD et la production de cytokines inflammatoires. Les CD peuvent alors déclencher la réponse adaptative médiée par les lymphocytes T dirigés contre le VIH-1. Nous avons montré que la protéine Tétraspanine 7 (TSPAN7), en impactant les dynamiques du cytosquelette d’actine dans les CD, est impliquée dans le transfert de virions du VIH-1 des CD aux des lymphocytes T CD4+.

Nos données préliminaires indiquent que TSPAN7 exerce un rôle de régulation de la production d’IFN de type I et de type III par les DC et de la maturation de ces cellules (modèle de CD dérivées de monocytes primaires). Nous aimerions tester si les CD circulantes conventionnelles de donneurs sains dépendent aussi de TSPAN7 pour la sécrétion d’IFN induite par le VIH-1. Nous proposons d’étudier l’ampleur de la fonction de TSPAN7 dans la réponse des CD à l’infection par le VIH-1. En particulier, nous étudierons l’impact de TSPAN7 sur la capacité des CD infectées à stimuler des lymphocytes T CD8+ spécifiques du VIH-1 et sur le comportement migratoire des CD. Nous examinerions les mécanismes moléculaires en jeu. Pour ce faire, nous testerons si TSPAN7 a un impact direct sur la détection du VIH-1 par les CD (axe cGAS/STING) et/ou si son rôle de régulateur de la nucléation de l’actine est impliqué. Pour ce projet, nous utiliserons des systèmes lentiviraux pour diminuer (shARN) ou augmenter (surexpression) l’expression de TSPAN7 (méthodes utilisées en routine dans notre laboratoire). Quant aux expériences permettant de préciser les mécanismes moléculaires en jeu, nous étudierons les CD de patients portant des mutations induisant une dérégulation de la nucléation de l’actine ou un suractivation de la protéine STING (protéine appartenant à la voie moléculaire permettant à cGAS d’induire la production d’IFN ; collaboration avec l’équipe de Frédéric Rieux-Laucat).

Une meilleure compréhension des interconnexions entre TSPAN7, la détection du VIH-1 par les CD, la sécrétion d’IFN et de cytokines pro-inflammatoires et la maturation des CD pourrait aider à développer de nouvelles stratégies pour limiter les symptômes des patients, la pathogénicité du VIH-1 et l’établissement de réservoirs cellulaires. Étant des actrices clés des réponses immunitaires innées et adaptatives, les CD sont reconnues comme de bonnes candidates pour de futures immunothérapies cellulaires. En tant que telles, une meilleure compréhension des voies moléculaires facilitant leur maturation et leur comportement inflammatoire pourrait aider à l’amélioration de ce type de thérapies pour aider à la lutte contre le VIH-1 mais aussi contre d’autres virus chroniques et certains cancers.