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Les rares patients contrôlant spontanément la réplication du VIH, appelés “contrôleurs du VIH”, développent des réponses T antivirales particulièrement efficaces. Leurs cellules T CD4+ détectent les antigènes du VIH avec une haute sensibilité, menant à la persistance de réponses T CD4 effectrices malgré une virémie limitée. Comment ces cellules parviennent à maintenir une immuno-surveillance constante du VIH sans se faire infecter et dépléter par le virus reste encore mal compris. Pour répondre à cette question, nous avons étudié le profil de différentiation et d’expression génique des cellules T CD4+ spécifiques du VIH au niveau de la cellule unique. Les cellules T CD4+ spécifiques de l’épitope le plus immunodominant de la capside du VIH, Gag293, ont montré une différentiation effectrice de type Th1 plus avancée chez les contrôleurs que chez les patients traités. Curieusement, CCR5 s’est révélé être le seul marqueur Th1 diminué, plutôt qu’augmenté, dans les cellules T CD4+ spécifiques de contrôleurs. Nous avons montré que cette expression limitée du corécepteur majeur du VIH limite la susceptibilité des cellules T CD4+ spécifiques à l’entrée virale, ce qui représente un élément clef pour comprendre le maintien de la fonction T CD4 helper chez les contrôleurs. Dans le projet, nous proposons d’explorer le mécanisme responsable de la diminution de l’expression de CCR5 dans l’infection à VIH contrôlée.

Dans le premier objectif, nous déterminerons si l’expression de CCR5 est diminuée uniquement dans les cellules T CD4+ spécifiques de Gag, ou si ce phénomène s’applique également aux cellules spécifiques de Env, voire aux cellules reconnaissant d’autres virus. Les marquages seront effectués avec des tétramères du CMH de classe II, afin de détecter les cellules T CD4+ spécifiques sans les activer, ceci sur des prélèvements de contrôleurs inclus dans la cohorte ANRS CO21 CODEX (n=15), comparés à ceux de patients efficacement traités (n=15). D’autre part, nous avons identifié jusqu’ici deux contrôleurs portant la mutation CCR5 D32 ainsi qu’une autre mutation faux-sens sur le second allèle, suggérant que dans certains cas la diminution de CCR5 a une cause génétique. Nous évaluerons la fréquence des mutations bi-alléliques de CCR5 chez les contrôleurs, en utilisant la technologie PacBio pour séquencer le locus CCR5 chez les patients de la cohorte CODEX qui ont déjà été testés comme positifs pour la mutation D32 (n=12). Les analyses génétiques de CCR5 seront ensuite étendues au groupe de patients CODEX qui montrent la suppression virale la plus efficace (n=50).

Dans le second objectif, nous testerons la fonction des mutants faux-sens identifiés chez les contrôleurs. Nous utiliserons un test par nucléoporation qui permet d’évaluer rapidement l’expression de surface et la fonction de mutants de CCR5 dans des cellules T CD4+ primaires. Nous ferons également appel à un test récemment développé d’export synchronisé (RUSH), ainsi qu’à des tests d’internalisation et de recyclage, pour déterminer si les mutants de CCR5 ont un trafic intracellulaire altéré.

Dans le troisième objectif, nous explorerons le mécanisme de la diminution de CCR5 chez la majorité des contrôleurs qui ne montrent pas de mutations génétiques de CCR5. Nous étudierons en priorité l’internalisation de CCR5 dépendante des signaux chimiokines et TCR. Nos résultats préliminaires montrent que de forts signaux transduits par le TCR mènent à une diminution marquée de l’expression de CCR5 à la surface cellulaire. Nous testerons donc l’hypothèse que les TCRs de forte affinité préférentiellement exprimés par les cellules T CD4+ spécifiques des contrôleurs induisent une diminution chronique de l’expression de CCR5, ceci par transfert de TCR in vitro et analyses sur cellules uniques ex vivo.

L’ensemble du projet devrait établir le rôle de CCR5 dans l’infection à VIH naturellement contrôlée, et renforcer le rationnel pour développer les stratégies thérapeutiques qui visent à une inhibition de CCR5.

Les rétrovirus humains HTLV-1 et HIV-1 possèdent la particularité de se transmettre de façon très efficace par contacts entre les cellules infectées productrices de virus et les cellules cibles. Ce mécanisme reste un processus mal connu, alors qu’il est non négligeable dans le cycle des rétrovirus. En effet, il permet (i) d’éviter ou de limiter la neutralisation par le système immunitaire et (ii) de réduire la vitesse de diffusion du virus dans les milieux extracellulaires avant l’attachement aux cellules cibles et (iii) augmente la quantité de virus délivré dans les cellules cibles. De plus, ce processus de transmission virale échappe aux mécanismes de restriction cellulaires ainsi qu’à l’action des antiviraux. Il est donc crucial de mieux caractériser la transmission virale après contact cellulaire pour pouvoir mieux contrôler la dissémination virale.

Deux voies de transfert des particules virales ont été décrites pour les rétrovirus HIV-1 et HTLV-1 : (i) la synapse virologique, et (ii) la formation de conduits intercellulaires. Une troisième voie a été plus récemment décrite pour HTLV-1 : elle implique la production de virions piégés dans des agrégats extracellulaires adhésifs, ou biofilms viraux, accumulés à la surface des cellules infectées. Lors d’un contact cellule-cellule, le biofilm de HTLV-1 adhère rapidement à la cellule cible ce qui permet un transfert rapide du virus, même lors d’un contact éphémère. HIV-1 est également rapidement transféré d’une cellule à une autre lors d’un contact cellulaire, nous faisons donc l’hypothèse que le virus HIV-1 est lui aussi capable de s’accumuler en surface des cellules infectées dans des structures assimilables à du biofilm viral, qui pourrait également participer à la transmission virale. Nous souhaitons donc dans ce projet de recherche capitaliser sur l’existence du biofilm de HTLV-1 pour caractériser le biofilm de HIV-1 puis comparer la structure, la composition moléculaire, les propriétés physiques des biofilms rétroviraux et identifier les mécanismes moléculaires responsables de la transmission des biofilms HTLV-1 et HIV-1 à l’infection des lymphocytes T CD4 cibles.

Nous utiliserons pour cela des approches innovantes d’imagerie de pointe, (microscopie à fluorescence haute résolution, microscopie à force atomique, microscopie électronique à balayage) combinées à des techniques de virologie moléculaire (modification des protéines virales) et de biologie cellulaire (invalidation génétique des constituants des biofilms, mesure de la transmission virale).

Nous anticipons que nos résultats permettront des avancées majeures dans la compréhension des mécanismes de transmission virale par contact cellulaires, tout comme l’a été la découverte pionnière de la synapse virologique formée par les cellules infectées par HTLV-1, mécanisme ensuite également démontré comme responsable de la transmission de HIV-1 par contact cellulaire. A plus long terme, nos résultats pourront ouvrir de nouvelles perspectives thérapeutiques en ciblant par exemple les voies de biogénèse des biofilms, leur mobilité à la surface des cellules infectées ou les composants (protéiques ou lipidiques) responsables de leur transmission d’une cellule infectée à sa cible.

Le projet RIPOSTE a pour objectif de développer un traitement innovant contre la tuberculose en ciblant la réponse de l’hôte par l’inhibition pharmacologique du facteur de transcription PU.1 dans les macrophages. Ce projet découle de la découverte que PU.1 joue un rôle central dans la réponse des macrophages à l’infection par Mycobacterium tuberculosis (Mtb). Des travaux préliminaires suggèrent qu’en inhibant PU.1 via un knockdown médié par siRNA lors de l’infection par Mtb, la croissance intracellulaire du pathogène diminue. Ce phénomène pourrait découler d’une augmentation de l’apoptose, d’une inhibition de l’expression de gènes inflammatoires ou d’autres mécanismes encore non élucidés. 
Dans cette optique, nous avons accès à des inhibiteurs de PU.1 récemment développés pour explorer si l’inhibition de PU.1 peut aider l’hôte à combattre l’infection par Mtb. Notre objectif principal est d’évaluer ces inhibiteurs de PU.1 sur l’infection par Mtb dans des macrophages primaires in vitro. Notre deuxième objectif est de poursuivre cette étude en évaluant l’efficacité de ces inhibiteurs sur des macrophages alvéolaires, qui seront ensuite intégrés dans un modèle organoïde humain. En parallèle, nous étudierons la pharmacocinétique et la clairance des inhibiteurs dans un modèle murin d’infection par Mtb. Cette approche globale nous permettra de déterminer la faisabilité d’une transition vers un modèle d’organoïde humain et d’évaluer l’efficacité potentielle des inhibiteurs de PU.1 sur l’infection par Mtb dans un contexte multi cellulaire et in vivo.