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Mycobacterium tuberculosis (Mtb) expose à la surface de son enveloppe une grande diversité de MAMPs (Motifs Moléculaires Associés aux Microbes), reconnus par les récepteurs du système immunitaire inné (PRRs), notamment les lectines de type C. L’interaction MAMPs/PRRs conduit à la phagocytose des bacilles et/ou l’activation de voies de signalisation intracellulaires qui contribuent, selon les cas, à la mise en place d’une réponse immunitaire protectrice ou à la persistance des bacilles. Il s’agit donc d’un étape clef du processus infectieux. De nombreux travaux ont porté sur l’élucidation des bases moléculaires de la reconnaissance des ligands, sous forme isolée, par les PRRs, mais peu de choses sont connues sur la distribution des MAMPs à la surface des bacilles, et comment cette dernière impacte la liaison aux PRRs. Or, il apparait de plus en plus évident que la distribution spatiale des molécules à la surface des enveloppes bactériennes est hétérogène et dynamique.

Ainsi, nous avons montré récemment par l’utilisation de techniques d’imagerie moléculaire que l’organisation des MAMPs en nanodomaines est cruciale pour la reconnaissance sélective des espèces du complexe Mycobacterium tuberculosis (MtbC) par la lectine de type C DC-SIGN. En effet, bien que ces MAMPs soient également exprimés en surface des espèces n’appartenant pas au complexe tuberculosis (non-MtbC), ces dernières ne sont pas reconnues par la lectine. En étudiant deux espèces représentatives, nous avons observé que la densité des MAMPs et la taille des nanodomaines (> 0.02 µm² dans 90% des cas) est nettement supérieure pour l’espèce MtbC, favorisant ainsi une liaison efficace de DC-SIGN, et induisant un recrutement local de la lectine (phénomène de « clustering ») venant renforcer la force de l’interaction. Forts de cette observation, nous avons également mis en évidence des nanodomaines fonctionnels pour la reconnaissance par les lectines Mincle et Dectine-2, impliquées dans la réponse immunitaire à Mtb.

Sur la base de ces données, le projet MtFunDom a pour objectif de caractériser en détails les nanodomaines fonctionnels présents à la surface de l’enveloppe de Mtb, et impliqués dans la reconnaissance par les lectines de type C. Plus précisément, nous souhaitons définir la composition de ces nanodomaines, identifier les déterminants de leur formation et évaluer leur influence sur l’interaction des bacilles avec les récepteurs à la surface des cellules immunitaires. Pour ce faire, nous utiliserons des techniques d’imagerie moléculaire de pointe, avec une résolution de l’ordre de 20 nm, pour i) cartographier la distribution et ii) caractériser la dynamique des ligands de différentes lectines de type C (DC-SIGN, Mincle, Dectine-1, Dectine-2) à la surface de différentes espèces mycobactériennes (Mtb, espèces non-Mtb à croissance lente ou rapide) et de diverses souches mutantes spécialement construites.

Le projet MtFunDom devrait conduire à une meilleure compréhension des interactions moléculaires hôte/pathogène mises en jeu à l’interface bactérie/cellule immunitaire, permettant d’envisager à plus long terme le développement rationnel d’approches antituberculeuses basées sur l’immunomodulation.

La tuberculose infantile est globalement sous-diagnostiquée et non traitée, en raison de la faible performance diagnostique des tests existants, de la faible spécificité des caractéristiques cliniques et radiologiques et de la difficulté à collecter des échantillons bactériologiques adéquats chez les enfants. Les tests basés sur la détection de l’antigène mycobactérien lipoarabinomannan (LAM) dans l’urine répondent à la nécessité de développer et/ou d’utiliser des tests basés sur des biomarqueurs utilisant des échantillons autres que les expectorations pour le diagnostic et le contrôle de la tuberculose. Il existe deux principaux tests basés sur les LAM, l’Alere Determine TB-LAM Ag (AlereLAM), recommandé par l’OMS, et le Fujifilm SILVAMP TB LAM (FujiLAM). L’AlereLAM est actuellement utilisé pour le diagnostic actif de la tuberculose chez les personnes vivant avec le VIH, principalement chez les adultes. Ces tests n’ont pas été inclus dans les études TB-Speed VIH et SAM qui ont validé en externe et développé des algorithmes de decision thérapeutique (TDA) spécifiques pour les enfants vivant avec le VIH et les enfants atteints de malnutrition aigüe sévère au Mozambique, en Côte d’Ivoire, en Ouganda et en Zambie. Parallèlement, en 2022, l’OMS a recommandé sous conditions l’utilisation d’un TDA pour améliorer le diagnostic de la tuberculose pulmonaire chez les enfants de moins de 10 ans et a demandé la validation externe de deux TDA suggérés pour la population pédiatrique générale. Dans le cadre de notre projet EDCTP Horizon 2020 Decide-TB, nous validerons en externe dans des centres de santé primaire et des hôpitaux de district au Mozambique et en Zambie, les TDA recommandés par l’OMS pour les enfants ainsi que les TDA développés par d’autres études cliniques telles que les TDA PAANTHER et TB-Speed SAM pour les enfants les plus vulnérables. L’objectif général de ce contrat d’initiation est d’évaluer la valeur ajoutée des tests diagnostiques basés sur les LAM dans les TDA PAANTHER et TB-Speed SAM en vue d’une intégration future dans l’approche intégrée Decide TB basée sur l’utilisation des TDA. Pour atteindre cet objectif, nous proposons d’analyser des échantillons d’urine, collectés dans les deux études et stockés dans des biobanques locales, avec AlereLAM et FujiLAM et d’évaluer leur précision diagnostique par rapport aux normes de référence microbiologiques et composites dans chaque étude. Nous concentrerons également les LAM dans les échantillons d’urine afin d’augmenter la sensibilité du test AlereLAM et nous mesurerons sa précision diagnostique. Les tests de laboratoire seront effectués dans les pays qui ont collecté et stocké des échantillons d’urine pour TB-Speed. Les résultats des tests basés sur le LAM seront introduits dans les TDA PAANTHER et TB-Speed SAM en tant que prédicteurs et leur valeur ajoutée sera évaluée. Dans un second temps, nous discuterons avec les équipes nationales et les principales parties prenantes (y compris les programmes nationaux de contrôle de la tuberculose) impliquées dans le projet Decide-TB de l’intérêt d’intégrer les résultats des tests basés sur les LAM dans l’approche basée sur les TDA développée par le projet. Enfin, les résultats générés seront utiles pour le développement futur d’une plus grande cohorte diagnostique d’enfants présomptifs TB qui évaluera la précision diagnostique des tests basés sur les biomarqueurs utilisant des échantillons non expectorés (y compris les tests LAM), ainsi que l’avantage des méthodes de laboratoire pour augmenter la sensibilité de ces tests.

De nombreux facteurs cellulaires pouvant potentiellement interférer avec la progression des infections rétrovirales ont été identifiés chez les mammifères. L'expression de ces facteurs de restriction est souvent induite par l'interféron et constitue la première ligne de la réponse immunitaire innée de l’hôte. Parmi eux, le facteur de restriction spécifique d’espèce TRIM5alpha, est capable de bloquer les infections lentivirales via une interaction directe au niveau de la capside virale. Cependant les détails moléculaires de son action antivirale restent encore à explorer. Grâce à un crible génétique de perte de fonction, nous avons précédemment identifier de potentiels cofacteurs impliqués dans cette restriction et confirmé le rôle de 2 d’entre eux (PRELID3A et TRDMT1) comme partenaires fonctionnels dans cette restriction. PRELID3A, localisée dans l’espace inter-membranaire mitochondrial, fait partie des protéines à domaine PRELI, qui, lorsque qu’elle sont complexées à TRIAP1, participent au transport d’acide gras de la membrane externe vers la membrane interne. Par ARN interférence, nous avons pu montrer que certaines protéines de ce complexe étaient elles aussi impliquées dans la restriction virale médiée par TRIM5alpha. Ces résultats suggèrent une implication de ce complexe TRIAP1-PRELID et de la mitochondrie dans le contrôle de l’infection virale médiée par TRIM5alpha. TRDMT1 est une ARN méthyltransférase déjà impliquée dans la méthylation m5C des ARN du HIV-1 qui est relocalisée dans le cytoplasme lors de l’infection. Ainsi, nous étudierons également, l’importance de cette méthylation dans la restriction en présence ou non de TRIM5alpha.

Ce projet permettra d’apporter de réelles avancées dans le mécanisme d’action de ce facteur de restriction décrit depuis près de 20 ans.

L’infection chronique par le virus de l’hépatite B (VHB) augmente considérablement les risques de développer des maladies sévères du foie tel que le carcinome hépatocellulaire. Bien qu’efficaces pour maintenir l’infection sous contrôle, les traitements actuels ne permettent pas d’éradiquer le virus du fait de la persistance du minichromosome viral, l’ADNccc (circulaire clos de façon covalente). Il est donc absolument essentiel de développer de nouvelles thérapies ciblant directement cet épisome. L’interaction complexe entre le VHB et le système immunitaire de l’hôte crée un micro-environnement hépatique inflammatoire responsable des lésions du foie et du développement du cancer. Cette interaction est régie par la production de cytokines/chemokines à partir des hépatocytes ou des cellules immunitaires. Une meilleure compréhension de cette interaction intercellulaire est donc primordiale afin de ralentir significativement la progression de la maladie. Le stress du réticulum endoplasmique (RE) est une des voies de signalisation contrôlant la production de cytokines et est communément activée lors de maladies hépatiques. En particulier, le VHB, de par la production de protéines virales, induit cette voie de stress responsable d’une sécrétion plus importante de l’interleukin-8 (CXCL8), décrite pour attirer des cellules immunitaires. De manière intéressante, l’environnement pro-inflammatoire augmente la proportion de variants d’épissage du VHB, en particulier peu de temps avant l’apparition du cancer. Ce processus co-transcriptionnel génère une vingtaine de variants dont certains codent des protéines décrites pour moduler l’interaction avec le système immunitaire montrant un rôle prépondérant dans la pathogenèse induite par le VHB.

Nous avons identifié les hélicases à ARN DDX5 et DDX17 comme des régulateurs clés de l’épissage du VHB dans des cellules hépatiques primaires ou cancéreuses. Leur déplétion est notamment associée à l’induction du variant SP17 qui semble produire une nouvelle protéine virale que nous avons appelée HBc-P. De manière frappante, l’induction de ce variant et potentiellement de cette protéine est associée à l’induction d’un stress du RE et l’augmentation de l’expression de CXCL8.

L’objectif de ce projet sera donc d’établir un lien fonctionnel entre la production de HBc-P, l’induction du stress du RE et la production de cytokines pro-inflammatoires telle que CXCL8. Après avoir confirmé la production de HBc-P à partir du variant SP17 après infection d’hépatocytes primaires humains par un fractionnement de polysomes, nous générerons un vecteur lentiviral nous permettant de surexprimer cette protéine dans ces cellules. L’induction du stress du RE sera monitoré par une approche de Nanostring nCounter avec un panel de gènes dédiés associée à des expériences de Western blot quantifiant des évènements liés à cette voie de signalisation. En parallèle, les cytokines seront quantifiées par Isoplexis et leur régulation par HBc-P sera validée par de nouvelles expériences d’ELISA.   

Dans le cas où ces résultats obtenus au cours de financement corroborent notre hypothèse, ce projet fournira les bases d’un projet plus large visant à 1) caractériser le lien fonctionnel entre SP17/HBc-P et le tress du RE dans des modèles in vivo, 2) suivre l’expression de SP17/HBc-P chez les patients au cours des différénetes étapes de l’hépatite B chronique et enfin 3) caractériser la contribution d’autres variants d’épissage du VHB à l’interaction entre les hépatocytes infectés et les cellules immunitaires à la fois dans des modèles in vivo et chez les patients. Ce projet éclairera donc davantage l’importance fonctionnelle des variants d’épissage au cours de l’hépatite B chronique et ouvrira la porte au développement de nouvelles stratégies thérapeutiques, ciblant notamment le stress du RE, stratégie déjà employée contre des maladies hépatiques telle que la MASLD et dont des drogues ciblant cette voie sont actuellement en essais cliniques.