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En 2019, la population des enfants non infectés exposés au VIH (HEU) a atteint 15,2 millions. Cette population continuera à augmenter avec près d’un million d’enfants nés de mères infectées par le VIH chaque année. Les données récentes montrent que les HEU sont en moins bonne santé que les enfants non infectés et non exposés au VIH (HUU), sans que l’on en comprenne bien les mécanismes sous-jacents. La plupart des femmes vivant avec le VIH sont enceintes alors qu’elles suivent déjà un traitement antirétroviral, exposant ainsi les enfants HEU aux médicaments antirétroviraux maternels (ARV) et au VIH, de la conception à la naissance. Par la suite, les enfants HEU allaités continuent d’être exposés à la fois aux ARV maternels et au VIH par le lait maternel, et à leur propre régime ARV prophylactique. Cette situation a incité Powis et Siberry à plaider en faveur d’un suivi à long terme des enfants HEU, indépendamment de leur exposition au VIH/ARV.

De nombreuses déficiences chez les enfants HEU pourraient être liées à des dysfonctionnements mitochondriaux. Les signes cliniques des mitochondriopathies pédiatriques, principalement associés à des troubles neuromusculaires, neurologiques et au développement neurologique, dû à un déficit énergétique, pourrait recouper les dysfonctionnements observés chez les enfants HEU. De plus, l’exposition au VIH modifie l’activité mitochondriale et les ARV induisent une instabilité de l’ADNmt.

La génotoxicité mitochondriale a été étudiée chez les enfants HEU, les études se concentrant principalement sur le nombre de copies d’ADNmt par cellule (MCN). Ces études font état d’une diminution du nombre de MCN chez les enfants HEU par rapport aux enfants HUU. L’intégrité de la molécule d’ADNmt, des mutations ponctuelles et des grandes délétions (délétome), peut également être altérée dans le contexte de l’infection par le VIH, bien que les données pédiatriques soient rares et obtenues à partir de techniques non quantitatives.

Avec le Centre national de référence des maladies mitochondriales (Angers), nous avons eu accès à un outil de diagnostic robuste qui combinait une approche de séquençage de nouvelle génération et un algorithme original d’analyse des séquences. Dans une étude préliminaire, nous avons établi les profils du délétome et de mutations ponctuelles de l’ADNmt dans le sang total de 32 enfants HEU, à J7 post-partum. Nous avons observé que 24 des 32 enfants (75%) avaient des molécules d’ADNmt délétées, avec un taux d’hétéroplasmie, c’est-à-dire la coexistence de molécules d’ADNmt de type sauvage et de molécules d’ADNmt délétées au sein d’une cellule, de 0.26% (IQR 0.03-1.37). De plus, nous avons analysé 22 de ces enfants à l’age d’un an. Ils avaient tous reçu une monoprophylaxis pour mrévenir la transmission du VIH de la mère à l’enfant. Le nombre d’enfants ayant des molecules d’ADNmt délétées restait stable (n=15, 68%) avec un taux d’hétéroplasmie de 0.98% (IQR 0.23-4.332). Ces données conferment que ces molecules ne peuvent pas être réparées et peuvent s’accumuler tout au long de la vie. Il est nécessaire de procéder à une caractérisation complète de la génotoxicité mitochondriale chez les enfants HEU, qui tienne compte des expositions actuelles au VIH et aux ARV.

Le projet PROMISE-EPI de phase II/III recrute des paires mère-enfant pour évaluer une intervention de secours de PTME. Nos objectifs spécifiques visent à décrire la toxicité mitochondriale chez les enfants non exposés au VIH, non infectés et séropositifs au cours de la première année de vie, à évaluer la sécurité des différents régimes de PrEP et à déterminer si les délétions de l’ADN mitochondrial sont héritées verticalement ou acquises de novo après l’exposition.

La génotoxicité mitochondriale sera évaluée en mesurant le MCN, le délétome de l’ADNmt, le % d’hétérophasmie et la présence de mutations ponctuelles.

La sécurité est la priorité absolue pour les interventions de prévention visant un grand nombre de personnes. Bien que les effets néfastes à long terme de l’exposition aux ARV pour la PTME restent mal identifiés, ce projet contribuera à l’étude des mécanismes potentiels qui expliqueraient la santé des enfants HEU.

La Guyane française est une région française d’outre-mer située en amazonie. Elle fait face à plusieurs défis avec une démographie dynamique, une pauvreté touchant près de la moitié de la population et une immigration importante (plus d’un tiers de la population guyanaise est issue de l’immigration). Les personnes originaires d’Haïti représentent 59% des étrangers vivant en Guyane suite à plusieurs vagues migratoires dont une importante datant de 2015. Elles sont aussi surreprésentées parmi les personnes vivant avec le VIH (PVVIH). Un travail analysant la pente de décroissance des CD4 suggère qu’une proportion importante des contaminations par le VIH surviennent sur le territoire guyanais. Leurs conditions de vie après l’arrivée en Guyane des émigrés d’Haïti sont souvent dégradées alliant précarité financière, administrative et de l’habitat. Ces conditions pourraient augmenter le risque de rapports sexuels exposant au risque d’acquisition du VIH et des infections sexuellement transmissibles quand ils surviennent dans un contexte de vulnérabilité sociale ou sexuelle ou de rapports tarifés dans un contexte de survie. L’enquête ANRS Parcours avait mis en évidence cette vulnérabilité sexuelle parmi les immigrés d’Afrique subsaharienne vivant en Ile-de-France à l’aide d’une méthodologie biographique permettant de croiser les conditions de vie avec la sexualité des personnes.

Ainsi, le présent projet se propose de mettre en place une étude épidémiologique transversale et biographique auprès de PVVIH originaires d’Haïti et de personnes nées en Haïti déclarant ne pas être infectées par le VIH. L’étude aura pour objectif d’évaluer la fréquence des rapports sexuels à risque (dont les rapports forcés) après l’arrivée en Guyane des personnes originaires d’Haïti et leur association avec les conditions de vie et l’acquisition d’une infection par le VIH années après années. Elle cherchera aussi à mieux comprendre les conditions de vie des personnes haïtiennes après leur arrivée en Guyane, à éclairer le recours au dépistage et les déterminants des diagnostics tardifs, du délai à l’entrée en soins mais aussi et surtout du maintien en soins après le diagnostic, notamment durant la période particulière de l’épidémie du Covid 19. Un focus sera réalisé sur les hommes ayant des rapports avec d’autres hommes originaires d’Haïti, de plus en plus représentés parmi les demandeurs d’asile et parmi les PVVIH arrivées depuis 2015, à qui sera proposée une étude ancillaire phylogénétique.

A cette fin, il recrutera un groupe de PVVIH originaires d’Haïti suivis au CH de Cayenne ou de Kourou et un groupe de personnes nées en Haïti non infectées suivies en médecine générale, à la PASS ou par la Croix Rouge Française dans les communes de Cayenne, Matoury, Macouria ou Kourou. Des données sociales, démographiques, administratives, relatives au parcours migratoire, à la sexualité, au recours au dépistage, aux outils de la prévention diversifiée, à l’entrée et au maintien en soins seront recueillies. Une partie des informations sera recueilli chaque année depuis l’arrivée en France à l’aide d’une grille biographique.

Les résultats de cette étude est susceptible d’améliorer la compréhension des situations de vulnérabilité sexuelle des immigrés d’Haïti dans une optique de mise en place de parcours en santé sexuelle intégrant une offre de dépistage et de prévention médicalisée permettant de réduire le risque d’infection par le VIH, les IST, les rapports sexuels non souhaités et les grossesses non désirées, ainsi qu’une amélioration du parcours d’entrée et de maintien en soins après la découverte d’une séropositivité en Guyane. Ils s’articuleront avec le travail déjà en cours de développement d’une offre de prévention et de soins directement au sein des zones d’habitats informels où vit une population majoritairement originaire d’Haïti.

Il permettra par ailleurs de mieux comprendre le parcours des PVVIH haïtiens après leur diagnostic et de produire des informations utiles à la mise en place d’actions susceptibles de prévenir la perte de vue.

            Le virus de l’hépatite B (VHB) est un virus enveloppé à ADN circulaire partiellement double brin de 3.2 kb qui appartient à la famille des Hepadnaviridae. Les traitements disponibles sont fondés sur l’utilisation d’interféron alpha et d’analogues de nucleos(t)ides (aujourd’hui entecavir ou tenofovir). Ces agents thérapeutiques ont significativement amélioré la prise en charge des maladies hépatiques associées à l’infection chronique par le VHB. Cependant, aucun traitement ne permet encore l’élimination complète du virus par les cellules infectées. Le développement de nouveaux agents anti-VHB, ciblant différentes étapes du cycle viral, reste indispensable pour envisager l’élimination de l’antigène HBs (AgHBs), voire à terme la guérison de l’infection.

Les Cyps sont une famille de protéines chaperonnes présentes dans le règne animal et végétal. Chez l’homme, les 17 Cyps connues possèdent un domaine commun d’environ 109 acides aminés, appelé CLD (pour « Cyclophilin-Like Domain »). Les Cyps sont dotées d’une activité enzymatique peptidyl-prolyl cis-trans isomérase (PPIase) puisqu’elles catalysent, en amont d’un résidu amino-acidique proline, l’interconversion cis-trans de la conformation de la liaison peptidique. Un grand nombre de virus semblent dépendant des cyclophilines pour accomplir leur cycle de vie mais leur rôle précis dans l’infection par le VHB reste mal compris et pourrait être multifactoriel.

Les structures tridimensionnelles compactes des cyclophilines en font des cibles très complexes pour le « drug design ». Afin d’apporter de nouvelles solutions thérapeutiques et cognitives, nous avons utilisé une approche complexe de FBDD (pour « Fragment-Based Drug Design ») fondée sur la résonance magnétique nucléaire et la cristallographie au rayons X pour générer une nouvelle famille de petites molécules non peptidiques inhibitrices des cyclophilines (SMCypI). Ces nouvelles molécules, sans parenté chimique avec la CsA, sont dépourvues d’activité immunosuppressive et possèdent une efficacité antivirale à large spectre, comme nous l’avons récemment publié dans Nature Communications

Dans ce cadre, notre hypothèse est qu’à l’instar de nombreux virus, une ou plusieurs cyclophilines pourraient être impliquées dans le cycle de vie du VHB. Les cyclophilines représenteraient donc une cible potentielle d’intervention antivirale et nos SMCypI pourraient être utilisées pour comprendre les mécanismes impliqués tout en représentant de nouvelles molécules anti-VHB à fort potentiel thérapeutique.

Ce contrat d’initiation nous permettra d’apporter la preuve de concept de l’efficacité anti-VHB des SMCypI et d’envisager ainsi le développement thérapeutique de ces molécules

Le projet proposé garantit des retombés majeurs puisqu’il pourrait ouvrir la voie à la validation des cyclophilines comme nouvelle cible anti-VHB, permettre la mise en évidence de nouvelle molécules anti-VHB et aider à la compréhension du mécanisme d’action antiviral des différentes familles d’inhibiteurs de cyclophilines (dépendant et/ou indépendant de NTCP).

Bien que le virus de l'hépatite E (HEV) soit la première cause d'hépatite aiguë dans le monde, et ait été classé très récemment par l'OMS dans la liste des pathogènes les plus à risque, son cycle infectieux est encore très mal caractérisé. Dans notre laboratoire, nous nous intéressons depuis plusieurs années à la protéine de capside du HEV, nommée ORF2. En effet, nous avons montré qu'au cours de son cycle infectieux, le HEV produit au moins 3 formes de sa protéine de capside ORF2 : l'ORF2 infectieuse (ORF2i), l'ORF2 glycosylée (ORF2g) et l'ORF2 clivée (ORF2c). Ces formes ORF2 remplissent des fonctions distinctes dans le cycle infectieux du HEV. La protéine ORF2i est le constituant structurel des particules infectieuses tandis que les protéines ORF2g/c ne sont pas associées à du matériel infectieux mais agissent probablement comme des leurres immunologiques. Les protéines ORF2g/c sont sécrétées en grandes quantités dans le surnageant de culture et sont les antigènes les plus abondants détectés dans le sérum des patients.

Récemment, nous avons étudié les mécanismes moléculaires et cellulaires impliqués dans la biogenèse, la localisation subcellulaire et les fonctions des différentes formes de l’ORF2. Nous avons notamment montré qu'au moment de la traduction, la protéine ORF2 est massivement transloquée dans la lumière du RE, par un processus dépendant du translocon. Elle suit ensuite la voie de sécrétion classique où elle subit des modifications post-traductionnelles (maturation des N-glycanes, O-glycosylation, sialylation et maturation par des protéases) pour générer les formes solubles ORF2g/c. L'ORF2i est quant à elle produite par une voie différente d'adressage puisqu'après traduction elle reste ancrée du côté cytosolique des membranes. En effet, nous avons montré qu'il existe un mécanisme de régulation fine de l'expression de l'ORF2 reposant sur la présence d'un motif présent à l'extrémité N-terminale de la protéine. Ce motif riche en résidus Arginine, nommé ARM, régulerait l'adressage subcellulaire des formes ORF2 en modulant la topologie et la fonctionnalité du peptide signal de l'ORF2.

De manière intéressante, nous avons obtenu des résultats préliminaires suggérant que la production de la protéine ORF2i pourrait être dépendante de l'EMC (ER-membrane complex), qui est un complexe impliqué dans la traduction, le repliement et l'insertion membranaire de certaines protéines cellulaires et virales. C'est pourquoi, dans ce projet de recherche, nous proposons de démontrer qu'en plus du translocon, l'EMC serait impliqué dans le processus de traduction de la protéine ORF2 en prenant en charge et en régulant l'intégration dans les membranes de la protéine ORF2i. Pour cela, différentes approches méthodologiques et expérimentales seront développées. Au-delà du mécanisme de traduction de la protéine ORF2 du HEV, nous proposons également d'analyser par profilage ribosomique (Ribo-seq) le traductome de cellules infectées ou non par le HEV afin d'établir une cartographie des modifications de l'expression des protéines cellulaires induites par l'infection, ainsi que des mécanismes de détournement de la machinerie cellulaire par le HEV.

Le développement de notre projet devrait apporter de nouvelles connaissances sur les mécanismes du cycle infectieux nécessaires à la lutte contre l'hépatite E ainsi que pour la compréhension générale des stratégies virales de détournement de la machinerie cellulaire.

Le virus de l’Hépatite B (VHB) induit une infection chronique qui affecte plus de 250 millions de personne dans le monde et augmente le risque de développer des maladies hépatiques sévères tel que la cirrhose du foie et le carcinome hépatocellulaire, la deuxième cause de décès par cancer. Par conséquent, malgré l’existence d’un vaccin prophylactique, le VHB reste un problème de santé mondial et est classé comme deuxième agent cancérigène au monde, après le tabac.

Le VHB est un petit virus à ADN enveloppé, mais il pourrait être assimilé à un pararetrovirus, car il requiert une phase nucléaire avec un intermédiaire ARN pour sa réplication. Les virions infectieux contiennent un ADN détendu circulaire (rcDNA) partiellement double brin associé de manière covalente à la protéine de polymérase virale. Pour être transcriptionnellement actif, le rcDNA doit être converti en un épisome d’ADN circulaire fermé de manière covalente (ADNccc) dans le noyau des hépatocytes infectés. Les histones, la protéine Core du VHB (HBc) et l’ADNcc sont étroitement liés pour former une structure chromatinienne dynamique qui se transcrit aux différents niveaux d’activité biologique.

Les mécanismes conduisant au dépôt d’histones sur les rcDNA entrants et régulant le remaniement des histones au cours de la transcription de l’ADNccc sont encore inconnus. Nous avons démontré que le complexe de l’histone chaperon HIRA, connu pour déposer le variant d’histone H3.3 sur le site des lésions de l’ADN, sur l’ADN nu et sur les gènes actifs, est crucial pour l’établissement des molécules d’ADNccc après l’infection des hépatocytes par le VHB. De plus, le silencing de HIRA affecte gravement les taux d’ARN viral et la réplication du VHB, suggérant son implication dans la régulation de l’activité de l’ADNccc une fois que le pool d’ADNccc est déjà formé. La protéine Core du VHB (HBc) s’est avérée être associée à la fois à l’ADNccc et à HIRA et des expériences de co-immunoprécipitation indiquent une interaction possible entre les deux protéines.

 Ce projet de recherche , en continuité avec les résultats obtenus, vise à mieux étudier le rôle du complexe HIRA dans la deposition de l’histone H3.3 sur l’ADNccc et le rôle spécifique de la protéine Core dans ce phénomène. En particulier, pour

– caractériser les composants du complexe HIRA associés à l’ADNccc et à HBc ;

– caractériser les domaines des protéines HIRA et HBc nécessaires pour la deposition d’hisontes sur l’ADNccc ;

– investiguer la nature de l’interaction entre le complexe HIRA et HBc.

De nouvelles approches thérapeutiques sont nécessaires pour surmonter la persistance de l’ADNccc dans les cellules infectées, ou du moins pour contrôler son activité transcriptionnelle et réplicative car les antiviraux actuels pouvent inhiber la productivité des virions, mais ils n’affectent ni le réservoir d’ADNccc ni son activité. Les objectifs de cette proposition de bourse aideront à comprendre comment l’ADNccc est formé et régulé et pourraient potentiellement fournir une nouvelle stratégie thérapeutique spécifique au virus pour influer à la fois sur la formation et l’activité des minichromosomes du VHB. Dans l’impossibilité d’éliminer l’ADNccc dans les cellules infectées, la réduction de nouvelles infections en bloquant l’établissement de l’ADNccc et le contrôle de l’activité du pool déjà formé apporterait une hypothèse de travail pour atteindre le contrôle à long terme de l’hépatite B chronique.

Ces dernières années d’immenses progrès ont été réalisés dans notre compréhension de l’assemblage intracellulaire et du bourgeonnement du VIH-1 grâce aux avancées de la microscopie. Cependant, l’étape cruciale de libération des virions reste peu étudiée car elle ne peut être caractérisée par la seule microscopie. En conséquence, les données disponibles dans la littérature sur la libération des virions restent très approximatives car réalisées avec des populations de cellules dont les cinétiques de réplication du VIH-1 sont très hétérogènes. Notre objectif est d’apporter à la virologie conventionnelle la puissance des stratégies de nano/micro-fluidique (“viro-fluidique”) pour étudier la dynamique du relargage du VIH-1 à l’échelle de la cellule unique. Ce projet technologiquement ambitieux est porté par un consortium interdisciplinaire, composé de 4 équipes aux compétences reconnues et complémentaires en microfluidique, nanotechnologies, rétrovirologie et microscopie de molécules uniques.

Nous développerons un système microfluidique original qui permettra de mesurer en temps réel la libération des virus par des cellules individuelles. Cette puce microfluidique va devoir opérer plusieurs fonctions:

– Piégeage : Le circuit microfluidique thermostaté à 37°c va comporter une cale pour piéger une cellule unique dans un flux continu de milieu de culture, sans l’endommager. Le piège cellulaire doit immobiliser la cellule dans un écoulement mais permettre le relargage des virions. Plusieurs géométries ont d’ores et déjà été validées pour différents types cellulaires.

– Unicité : le circuit doit garantir par son design qu’une seule cellule soit piégée et perfusée, alors que l’ensemencement est opéré à partir d’une solution diluée de cellules. Un système à plusieurs entrées/sorties contrôlé par des valves pneumatiques sera utilisé pour garantir que le milieu collecté ne provienne que de la perfusion d’une cellule unique.

– Détection : En aval du piège, le circuit recevra des systèmes de quantification des virions fluorescents utilisant soit un comptage optique par caméra rapide soit par spectroscopie de corrélation de fluorescence (détection ponctuelle dans un faisceau laser). Pour les virions non-fluorescents nous utiliserons une technique de comptage par nanopore unique de type « track etched » intégré dans le système microfluidique.

            La puce sera installée sur le statif d’un microscope inversé à fluorescence pendant toute la durée de l’expérience. Cette dernière sera stoppée à la mort cellulaire observée par coloration au DAPI présent dans le milieu de perfusion. Nous étudierons les cellules modèles HeLa exprimant un VIH-1-GFP non-infectieux (∆env) et déterminerons pour la première fois la fréquence, la cinétique, la durée de la libération des virions et la quantité de virions produits par cellule. Cette étude permettra d’appréhender l’hétérogénéité de production entre cellules issues d’une même population. Puis, nous étendrons cette étude à plusieurs types cellulaires afin de faire état du degré de variation d’un type cellulaire à l’autre. Cette étude de la vitesse de libération des virus en fonction du temps de viabilité cellulaire nous permettra de mieux comprendre les stratégies adaptatives de production du VIH-1 à son hôte. Par ailleurs, nous ferons varier plusieurs paramètres physiques comme la vitesse du flux microfluidique, la tension membranaire, ou encore biochimiques en induisant l’activation des cellules (TNFalpha, LPS) afin d’appréhender la mécanistique de la libération des virions. A ce jour, toutes ces données ne sont pas connues car inaccessibles par l’utilisation d’approches conventionnelles.

            Les applications de la viro-fluidique sont nombreuses. Elle pourra être utilisée pour étudier ou découvrir des facteurs cellulaires ou viraux impliqués dans la libération des virus. Elle pourra également faciliter l’étude des mécanismes de réactivation de la production virale dans les cas de latence. De manière plus générale, les outils de viro-fluidique développés ici, aussi bien pour la capture cellulaire que pour la quantification des virus en flux, seront transposables à d’autres pathogènes.