Winning projects and candidates

Les traitements antirétroviraux actuels bloquent efficacement l’infection mais ne peuvent pas éliminer les cellules infectées. En conséquence, le traitement antirétroviral doit être conservé à vie. Cependant, l’étude ANRS EP47 VISCONTI a montré que certaines personnes étaient capables de maintenir une charge virale indétectable après interruption du traitement pendant de très longues périodes (contrôleurs post-traitement, PTC). Tous les PTC de l’étude VISCONTI ont en commun d’avoir initié le TARV très tôt au cours des premières semaines suivant l’infection. Contrairement aux contrôleurs naturels du VIH (qui n’ont jamais reçu de TARV pour contrôler l’infection), les PTC portent souvent des allèles HLA-B35 (53), qui sont généralement associés à une progression rapide de l’infection en l’absence de traitement. A travers des analyses rétrospectives des données disponibles dans la cohorte ANRS CO6 PRIMO et des PTC de VISCONTI, nous avons identifié un génotype du CMH [B35 (53) Bw4TTC2, comprenant au moins un allèle portant un ligand Bw4 et un ligand C2 des cellules NK] qui est fortement associé à une probabilité accrue de contrôler la virémie après une interruption du TARV précoce: (i) neuf sur neuf PTC B35(53) de VISCONTI portent ce génotype, qui se trouve chez <1/3 des individus HLA-B35 de la cohorte PRIMO ; (ii) parmi 8 sujets de la cohorte PRIMO portant ce génotype, traités pendant au moins un an depuis la PHI et qui avaient arrêté ensuite tout traitement, 4 avaient maintenu une charge virale plasmatique inférieure à 400 copies/mL 12 mois après l’arrêt (50 % de chance de PTC à 12 mois contre <7% dans d’autres études historiques). Ceci, combiné aux données fonctionnelles obtenues avec les cellules des PTCs de VISCONTI, soutien que l’HLA-B*35 favorise le contrôle du VIH post-traitement en association avec des ligands Bw4 et/ou C2 par le biais de cellules NK éduquées à travers de récepteurs KIR et qui possèdent des activités antivirales renforcées.

Nous proposons donc de confirmer cette association dans un essai pilote, de « preuve de concept », prospectif, multicentrique, non randomisé, avec un bras unique, dans lequel l’intervention sera un arrêt du traitement antirétroviral chez de participants de la cohorte ANRS PRIMO sous TARV efficace depuis la primo-infection et présélectionnés pour porter le génotype identifié.

Nous nous attendons à identifier 50 personnes éligibles dans la cohorte ANRS PRIMO sur la base de leur génotype HLA et répondant aux critères d’inclusion, et nous estimons que 20 accepteront de participer à l’essai.

Le taux de PTC (charge virale inférieure à 400 copies d’ARN/ml) sera évalué 6 mois après l’interruption du traitement. Nous explorerons des paramètres immunologiques et virologiques lors de l’inclusion dans l’essai, lors de l’interruption du traitement et à la fin de l’étude pour identifier des facteurs potentiellement associés à la rémission ou qui pourraient permettre d’anticiper le rebond viral. Nous proposerons également des enquêtes psychosociales aux candidats identifiés pour évaluer leur compréhension / perception / attentes par rapport à l’objectif et les avantages en termes de risque de l’étude, leurs motivations à participer ou non à l’essai et leur expérience / perception au cours de l’étude.

Les résultats de cet essai devraient avoir des implications importantes dans la recherche d’une rémission du VIH. Si elle était confirmée, l’association du génotype B35(53)Bw4TTC2 avec le contrôle après-traitement (i) fournirait des informations importantes sur le contexte et les mécanismes associés au contrôle, (ii) aurait des implications pour l’interprétation correcte des protocoles d’interruption du traitement en cours, et (iii) devraient guider des nouvelles stratégies visant à guérir le VIH.

Le virus de l’hépatite C (VHC) contrôle les voies métaboliques lipidiques de la cellule hôte pour son cycle viral. Cela se traduit en particulier par un détournement des corps lipidiques (CL), structures cellulaires de stockage des lipides. Les CL servent de source d’énergie, de source de  lipides, mais aussi de plateforme d’assemblage pour la particule virale. Les CL et leur métabolisme sont donc de nouvelles cibles pour le développement de stratégies antivirales. Les CL ont une organisation originale avec un cœur de lipides neutres entouré par une monocouche de phospholipides et un ensemble de protéines. Nous nous intéressons à une classe particulière des protéines du CL, les protéines de Classe I, dont fait partie la protéine core du VHC. Ces protéines présentent une convergence structurale avec un repliement en épingle à cheveux (hairpin). Très peu de données structurales existent sur ces protéines car elles sont très difficiles à manipuler en raison de leur forte hydrophobicité. Grâce à nos compétences acquises sur l’étude des oléosines, protéines de Classe I du CL des graines oléagineuses, nous proposons un projet d’étude fonctionnelle et structurale de la protéine core du VHC dans la levure selon un protocole d’expression hétérologue que nous avons développé au laboratoire. Ce contrat d’initiation va nous permettre d’obtenir les résultats nécessaires au développement de projets plus ambitieux d’études de biochimie structurale utilisant la rayonnement synchrotron que nous sommes les seuls à maitriser. De plus, les résultats qui découleront de ce projet contribueront à une meilleure compréhension des mécanismes mis en œuvre par le virus pour détourner le métabolisme lipidique de sa cellule hôte et à fournir de nouveaux outils pour le criblage de molécules thérapeutiques.

L’infection par le virus de l’hépatite B (VHB) est un enjeu majeur de santé publique au niveau mondial avec près de 260 millions de porteurs chroniques. La prévalence de l’antigène de surface HBs du VHB varie de 0,2% à plus de 8% dans des régions de forte endémicité. Le nombre de décès associés à des cirrhoses du foie et des hépato-carcinomes a été estimé à 887.000 en 2015 dans le monde.

Le mode principal de transmission du virus de l’hépatite B (VHB) est la transmission périnatale de la mère à l’enfant.  Les conséquences cliniques en sont par ailleurs particulièrement graves puisque la précocité de l’infection est corrélée avec un risque de chronicité élevé. Malgré une immunoprophylaxie efficace chez le nouveau-né, celle-ci est mise en échec chez des enfants nés de mère dont la charge virale est supérieure à 200.000 UI/mL

L’objectif de ce projet est de développer un outil moléculaire innovant et permettant d’éviter le recours à des instruments afin de diagnostiquer la mère à risque de transmission.  Ce test permettra d’identifier les femmes enceintes infectées par le virus de l’hépatite B et ayant une charge virale élevée afin d’initier un traitement antiviral.

Ce test comprend des étapes pré-analytiques simples intégrant une extraction d’ADN rapide couplée à une amplification isotherme RPA. Ce système sera optimisé pour obtenir un seuil de détection à 200.000 UI/mL. Un contrôle interne synthétique sera intégré au test afin de valider ce seuil. Une détection semi-quantitative sur bandelette en flux latéral pourra être réalisée à l’œil nu.

Ainsi ce test simple et rapide, en évitant le recours à des instruments, ouvrira de nouvelles perspectives diagnostiques adaptées aux besoins des pays à ressources limitées.

Le virus de l’hépatite delta (VHD) est un virus à ARN singulier, satellite du virus de l’hépatite B (VHB) car il utilise les protéines d’enveloppe de ce dernier pour sa propagation. La transmission se fait ainsi soit en coinfection avec le VHB, soit par surinfection.

Des liens étroits existent entre le métabolisme hépatique des acides biliaires (AB) et l’infection par le VHB. NTCP, le principal transporteur d’AB des hépatocytes, s’est révélé être le récepteur du VHB. De plus notre équipe a identifié le Farnesoid X Receptor alpha (FXR), le récepteur nucléaire des AB, comme un facteur proviral pour le VHB et des ligands de FXR se sont avérés être de puissants inhibiteurs du VHB. Les virions du VHD portant les protéines d’enveloppe du VHB, le VHD utilise aussi NTCP pour infecter les hépatocytes. Cependant, hormis ce rôle de NTCP dans l’entrée, une possible influence du métabolisme des AB dans l’infection par le VHD n’a pas encore été explorée. Notre hypothèse est que FXR interfère avec le cycle du VHD de façon indépendante de son impact sur le VHB.

Nos expériences préliminaires ont montré que des ligands de FXR inhibent de façon significative la synthèse des ARNs intracellulaires totaux, génomiques et naissants du VHD, ainsi que des antigènes delta (HDAg-L et HDAg-S) dans des cellules HepaRG et des hépatocytes primaires humains (HPH). Cet effet est indépendant de la présence du VHB et spécifique car l’extinction de FXR abolit l’effet des ligands. De plus, dans les cellules HepaRG coinfectées, les ligands de FXR diminuent de façon majeure l’infectiosité spécifique des particules VHD sécrétées, suggérant que plusieurs mécanismes pourraient être mis en jeu. Enfin une possible interaction entre FXR et HDAg-L a été identifiée en technique double hybride Split-TurboLuc.

En utilisant les cellules HepaRG et les HPH comme modèles d’infection, les 3 principaux objectifs de ce projet seront : 1) de décrire plus en détails l’effet inhibiteur des ligands de FXR en réalisant des cinétiques d’infection et de traitements et en testant des combinaisons avec d’autres antiviraux ciblant le VHD (IFN-a et lonafarnib); 2) d’identifier les mécanismes à l’origine de l’inhibition de la réplication/transcription virale. Deux hypothèses sont privilégiées. Premièrement, FXR pourrait moduler l’expression de gènes jouant un rôle clé dans le cycle viral du VHD. Des expériences de RNAseq seront donc réalisées dans des cellules infectées et traitées ou non par des ligands de FXR. Une attention particulière sera portée aux voies du métabolisme énergétique, de la synthèse des acides nucléiques et de la réponse immunitaire innée. Si cette analyse identifie des cibles intéressantes, leur expression sera invalidée ou restaurée et l’impact sur l’inhibition du VHD induite par les ligands de FXR sera évalué. Alternativement, FXR pourrait interférer avec les complexes de réplication du VHD en interagissant avec l’ARN viral, l’HDAg-S ou des protéines cellulaires associées. Des techniques d’immunoprécipitation d’acides nucléiques seront réalisées pour déterminer si FXR interagit avec ces complexes ou si les agonistes de FXR déstabilisent l’interaction de l’HDAg-S ou des facteurs cellulaires avec l’ARN viral; 3) d’identifier les mécanismes à l’origine de l’inhibition de l’infectiosité spécifique induite par les ligands de FXR. Une analyse des particules virales sécrétées par gradients de densité et protéomique sera réalisée pour déterminer si la composition des virions est modifiée par le traitement. En parallèle, l’interaction entre FXR et HDAg-L ainsi que ses conséquences fonctionnelles possibles seront analysées en détail.

Ce projet pourrait aboutir à l’identification de FXR comme un nouveau facteur jouant un rôle dans l’infection par le VHD, suggérant que des interactions complexes pourraient exister entre le métabolisme des AB et les cycles viraux du VHB et du VHD. De plus, des agonistes de FXR étant utilisés en clinique pour le traitement de la cirrhose biliaire primitive ou leur utilisation évaluée chez des patients atteints de NASH ou chroniquement infectés par le VHB, ces molécules pourraient représenter une nouvelle classe d’antiviraux contre le VHD.

Le virus de l’hépatite E (HEV) est responsable de plus de 20 millions d’infections et 70000 décès par an. Cette infection provoque des hépatites aiguës mais peut devenir chronique chez les patients immunodéprimés ou fulminante notamment chez les femmes enceintes. En raison de l’évolution vers la chronicité, sa transmission par transfusion sanguine, du nombre croissant de cas et des complications chez les patients souffrant d’une maladie hépatique préexistante, l’infection par le HEV est désormais considérée comme un problème émergent dans les pays industrialisés. L’immunité innée via la production d’interféron de type I (IFN-I) est essentielle pour le contrôle en phase aiguë et précoce des infections virales. Des données in vitro suggèrent que le HEV a probablement mis en place des mécanismes lui permettant d’inhiber la réponse antivirale de l’hôte. Cependant, notre connaissance est encore très partielle. Paradoxalement, les molécules induites par la réponse IFN-I sont détectées chez les patients infectés et les animaux expérimentalement infectés. Ceci implique donc l’existence des mécanismes alternatifs de détection des cellules infectées, pouvant contourner l’inhibition dans les cellules infectées. Dans le contexte d’autres infections virales, nous avons récemment découvert un mécanisme de reconnaissance des cellules infectées pas un type de cellules immunitaires spécialisées pour la production d’IFN-I, les cellules dendritiques plasmacytoïdes (pDCs). De manière intéressante, nos résultats préliminaires montrent que les pDCs détectent les cellules infectées par le HEV par contact cellulaire induisant la production d’une quantité massive d’IFN-I.

Ainsi, nous proposons un projet visant à définir la modulation de la réponse IFN-I par le HEV et en particulier par la protéine de capside ORF2. En effet, nous avons récemment démontré qu’au cours du cycle viral, le HEV produit distinctes formes de la protéine de capside ORF2, présentant des modifications co- et post-traductionnelles différentes. Ces formes ORF2 sont : i) la forme ORF2i (infectieuse) associée aux particules infectieuses et ii) les formes ORF2g (glycosylée) et ORF2c (clivée) qui ne sont pas associées à du matériel infectieux, mais produites massivement et sont les antigènes viraux majeurs présents dans le sérum des patients infectés par le HEV. Ces formes ORF2 ont des localisations subcellulaires distinctes : ORF2i est cytosolique ou nucléaire, alors que les formes ORF2g/c sont principalement réticulaires. De plus, nos résultats préliminaires suggèrent que la translocation nucléaire d’ORF2i inhibe l’expression de plusieurs gènes appartenant aux signalisations antivirales ou inflammatoires, en lien avec l’activateur transcriptionnel NF-kB. Ainsi, nous proposons que les différentes formes de l’ORF2 moduleraient distinctivement les réponses innées dans les cellules infectées ainsi que par les pDCs. Nous avons alors pour objectifs de définir :

-comment les différentes formes et localisations subcellulaires d’ORF2 influencent le profil d’expression des gènes dans les cellules infectées (Aim I).

-comment la réponse IFN-I par les pDC est activée et régulée par l’infection par le HEV (Aim II). Nous étudierons notamment comment les différentes formes d’ORF2 modulent les fonctions des pDC et quel est l’impact de la signalisation antivirale par les pDC sur la réplication du HEV et les réponses antivirales dans les cellules infectées.

La production, à partir d’un gène unique codant pour la capside virale, de multiples formes d’ORF2 ayant des localisations différentes est un aspect original et nouvellement découvert. Notre projet permettra d’identifier de nouveaux mécanismes de régulation de la réponse antivirale par le HEV. Dans une perspective plus large, notre projet permettra d’acquérir de nouvelles connaissances sur la biologie des pDC, notamment sur la modulation par des glycoprotéines virales. Les résultats obtenus serviront de cadre d’étude pour d’autres virus connus pour sécréter de larges quantités de glycoprotéines. Outre ces avancées en recherche fondamentale, nos travaux contribueront à définir de cibles pour le développement de traitements thérapeutiques.

Les métabolites sont des petites molécules biologiques qui participant a de nombreux processus cellulaires. Ils sont impliqués par exemple dans la glycolyse et la respiration mitochondriale (aussi appelée Oxphos), les deux principales méthodes de production d’énergie dans les cellules. Les particules virales de virus enveloppés comme le VIH se composent de protéines et d’acides nucléiques d’origine à la fois cellulaire et virale. Les composants provenant de la cellule sont incorporés dans la particule virale au moment de sa formation à la membrane de la cellule productrice. Il a été récemment montré que les particules virales peuvent également contenir une petite molécule ayant des propriétés de modulation de la réponse immunitaire : l’AMP-GMP cyclique (cGAMP). Lorsque ces virus contenant cGAMP entrent dans une nouvelle cellule cible, cGAMP se lie à son récepteur STING ce qui induit l’activation de la cellule qui produit alors des cytokines pro-inflammatoire et augmente son expression de gènes antiviraux. L’incorporation de cGAMP dans des particules virales utilisées dans un contexte de vaccination augmente l’efficacité du vaccin. Ainsi, une petite molécule incorporée dans une particule virale peut avoir un effet significatif sur l’organisme. Nous avons émis l’hypothèse que les particules virales peuvent également incorporer des petites molécules d’origine cellulaires et en particulier des métabolites. Des expériences préliminaires nous ont permis d’identifier des métabolites dans des préparations virales par une approche metabolomique semi-ciblée. Dans ce projet, nous souhaitons confirmer la présence de ces métabolites cellulaires dans les particules virales (« métabolites viraux »), développer des méthodes pour moduler les quantités de métabolites présents dans les particules virales et décrire les effets de ces métabolites viraux sur la cellule cible.

Les préparations virales contiennent à la fois les particules virales et des petites vésicules extracellulaires (sEVs) qui ont des caractéristiques morphologiques et physico-chimiques similaires aux particules virales. Dans un premier temps, nous testerons donc plusieurs méthodes de séparation des particules virales et des sEVs et nous identifierons la plus efficace par western blot et par microscopie électronique. Nous confirmerons ensuite que les métabolites identifiés dans nos expériences préliminaires sont présents dans les particules virales ainsi purifiées en utilisant des méthodes plus ciblées telles que des ELISAs, des tests enzymatiques in vitro et de la spectrométrie de masse ciblée. Ces métabolites viraux peuvent être incorporés soit de manière passive lors de la formation de la particule virale à la membrane cellulaire, soit par des processus actifs qui pourraient alors impliquer des protéines virales. L’existence de tel mécanismes viraux pour l’incorporation de métabolites spécifiques suggèrerait que ces métabolites sont importants pour la pathologie du VIH. Dans un second temps, nous identifierons donc des méthodes pour moduler l’incorporation des métabolites viraux en modifiant soit la cellule productrice, soit le virus. Cela nous permettra de produire des particules virales contenant des quantités plus importantes ou moins importantes de certains métabolites choisis. Nous utiliserons ensuite différentes méthodes pour étudier les effets des métabolites viraux sur le métabolisme de la cellule cible ainsi que sur la réplication virale et la réponse immunitaire a l’infection.

Ce projet décrira pour la première fois la présence de métabolites cellulaires dans les particules virales et montrera les effets de ces métabolites sur la réplication virale et la réponse immunitaire à l’infection dans les cellules cibles du VIH. Il révèlera ainsi un nouvel aspect de la relation hôte-pathogène et permettra d’envisager de nouvelles stratégies thérapeutiques innovantes.