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En plus des éléments cis-régulateurs localisés dans la longue répétition terminale 5’ (LTR 5’) du virus de l’immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1), notre laboratoire a identifié une importante région cis-régulatrice intragénique (IRR), présentant une activité enhancer sur le promoteur viral localisé dans le LTR5’. A l’origine identifiée comme étant associée à une région chromatinienne ouverte dans un contexte myéloïde uniquement, nos résultats récents ont montré que l’IRR était également critique pour médier la transcription et la réplication du VIH-1 dans des lymphocytes T infectés, démontrant l’importance d’étudier le rôle fonctionnel de l’IRR dans les deux contextes cellulaires d’infection par le VIH-1. De manière intéressante, nous avons identifié dans l’IRR trois sites de liaison pour le facteur de transcription myeloïde-spécifique PU.1. Le présent projet de recherche vise à comprendre plus avant les mécanismes moléculaires régulant la transcription et la latence du VIH-1 dans les deux cibles cellulaires majeures de l’infection, en étudiant le rôle joué par l’IRR sur l’activité promotrice du LTR5’. Dans la première partie du projet, nous étudierons le rôle du facteur de transcription myeloïde-specifique PU.1 dans la régulation transcriptionnelle et épigénétique du VIH-1 dans un modèle d’infection hautement physiologique, en réalisant des expériences d’infection de macrophages primaires dérivés de monocytes (MdMs) avec des particules virales contenant le génome viral du VIH-1 sauvage ou muté au niveau des sites intragéniques de liaison pour le facteur PU.1. Ensuite, afin de caractériser davantage le rôle fonctionnel de PU.1 dans la transcription et la réplication du VIH-1, nous inhiberons la liaison de PU.1 par une approche pharmacologique en utilisant un composé appelé diamidine hétérocyclique DB2115, connu pour inhiber sélectivement la liaison de PU.1 à ses sites cibles. Dans la seconde partie du projet, nous étudierons le rôle du facteur nucléaire T-spécifique se liant aux PU-boxes de l’IRR dans un contexte d’infection T-lymphocytaire. Nous étudierons le rôle de ce facteur dans la régulation transcriptionnelle et épigénétique du VIH-1 afin de démontrer les fonctions critiques jouées par l’IRR dans les deux contextes cellulaires majeurs d’infection par le VIH-1. Dans la dernière partie du projet, étant donné que la régulation transcriptionnelle du VIH-1 est un mécanisme multifactoriel complexe, comprenant de multiples niveaux de contrôle dont la structure tri-dimensionnelle (3D) de la chromatine, nous étudierons le rôle de protéines architecturales sur la régulation de la structure chromatinienne 3D des cellules infectées par le VIH-1. Plus précisément, dans l’IRR mais également le long du provirus VIH-1, nous avons identifié des sites de liaison pour CTCF et YY1, deux protéines architecturales impliquées dans la formation de boucles chromatiniennes. De plus, notre laboratoire a acquis une expertise importante dans la caractérisation des boucles chromatiniennes médiées par CTCF en étudiant d’autres rétrovirus dont le BLV et le HTLV-1. Afin d’étudier si le provirus du VIH-1 est capable de modifier l’organisation 3D de la chromatine dans les cellules infectées, nous étudierons le recrutement in vivo de CTCF et YY1 le long du provirus VIH-1 ainsi que leurs potentielles interactions 3D, par des expériences de 4C-seq. Par des expériences de CRISPR/Cas9, nous muterons ensuite les différents sites de liaison viraux pour CTCF et YY1 afin d’abolir la formation des boucles chromatiniennes et de caractériser le rôle fonctionnel de ces facteurs dans la latence virale et sur le transcriptome de la cellule infectée. Cette partie du projet de recherche contribuera à une meilleure compréhension des interactions 3D entre le provirus VIH-1 et son environnement génomique. En conclusion, notre projet de recherche permettra une connaissance plus approfondie des mécanismes moléculaires associés à la transcription et à la persistance du VIH-1 dans les deux réservoirs cellulaires majeurs du VIH-1 latent, ainsi que de nouvelles options thérapeutiques innovantes visant à contrôler l’infection virale.

Les inquiétudes liées à l’émergence de la pratique du chemsex, définie comme le fait de consommer des drogues dans l’intention d’avoir des pratiques sexuelles chez les hommes ayant des rapports sexuels avec des hommes (HSH), appellent aujourd’hui à mieux comprendre ce phénomène. Les données existantes et florissantes sur ce sujet permettent une compréhension de la pratique au prisme du risque et des complications sanitaires. Afin d’enrichir ces connaissances, nous souhaitons documenter cette pratique sur un temps suffisamment long pour en comprendre les déterminants, les nuances et les dynamiques aussi bien dans les parcours que dans les conséquences associées, ceci pour développer des réponses adéquates.

L’objectif de ce projet est donc d’étudier les parcours des HSH (et des personnes trans) ayant des pratiques de chemsex afin de définir les déterminants individuels et structurels des pratiques considérées comme problématiques, pouvant susciter une demande d’aide ou d’accompagnement.

La méthodologie de ce projet repose sur une approche communautaire et participative et mobilisera des méthodes mixtes. Le volet quantitatif sera composé d’une cohorte ouverte pendant 36 mois (avec prolongement) de 1678 HSH ayant une pratique de chemsex suivis en ligne à travers des questionnaires trimestriels qui documenteront les données sociodémographiques, l’histoire liée à la sexualité, les pratiques sexuelles, la consommation de drogues, l’entourage, la santé somatique/mentale, les parcours et accès aux soins et à la prévention. Afin d’étudier les déterminants des trajectoires problématiques, des méthodes statistiques adaptées seront utilisées (group-based trajectory models, modèles de transitions de Markov, latent transition analysis). Le volet qualitatif ciblera 25 à 36 HSH, constitués de sous-populations plus difficiles à atteindre via la cohorte (HSH nés à l’étranger, HSH de plus de 60 ans, ceux de moins de 25 ans, personnes trans, HSH ayant pratiqué le chemsex il y a plus de 2 ans). Pour les questions transversales aux deux volets, une triangulation des données est prévue, notamment afin de mieux comprendre les enjeux biographiques autour des points de ruptures et modifications des pratiques qui seront observées dans le volet quantitatif.

Les résultats nous informerons sur la diversité et l’évolution des pratiques du chemsex, les motivations, les effets positifs et les complications. Ils permettront d’identifier les freins et leviers à l’adoption de pratiques de réduction des risques et à l’accès aux soins et à l’accompagnement des personnes qui pratiquent le chemsex. Ainsi, ils participeront à adapter des interventions aux différentes pratiques et populations.

De nouvelles stratégies sont nécessaires pour infléchir de manière significative la courbe d’incidence de la tuberculose humaine dans le monde. Il faut pour cela mieux comprendre comment l’agent pathogène évolue pour échapper et/ou survivre à l’intervention humaine (vaccination ou traitements antibiotiques). Une grande quantité de données génomiques sur les bacilles de la tuberculose a été obtenue grâce au développement du séquençage à haut débit. Ces données ont permis d’explorer l’évolution de ces pathogènes et d’identifier des gènes soumis à une sélection adaptative qui façonnent l’évolution récente de Mycobacterium tuberculosis (MTB), le principal agent de la tuberculose.  Parmi eux, le gène phoR subit une forte sélection positive. Ce gène code pour la protéine senseur du système de régulation à deux composants PhoPR, un acteur majeur de la pathogénicité de MTB. PhoPR contrôle l’expression de plus de 80 gènes en réponse à des stimuli intracellulaires, tels que le pH acide ou le zinc. Les pressions responsables de la sélection de mutations dans phoR et l’impact de ces mutations sur l’activité du système PhoPR et l’interaction avec l’hôte restent inconnus. Nous émettons l’hypothèse que l’acquisition de mutations dans PhoR permet d’affiner l’interaction hôte-pathogène afin d’augmenter les chances de survie et de transmission et/ou contribue à accroître la capacité de la bactérie à survivre à de nouvelles pressions sélectives telles que la vaccination BCG ou les traitements antibiotiques.

Nous proposons ici d’aborder ce problème et de répondre à plusieurs questions importantes : 1) Quel est le moteur de l’évolution de PhoR chez MTB ? 2) Quelle est l’activité des variants de PhoR sélectionnés ? 3) Quel est l’impact de ces variants de PhoR sur l’interaction avec l’hôte ?

Tout d’abord, nous allons créer une collection de souches recombinantes isogéniques à code-barres exprimant des variants de PhoR. Ces variants ont été sélectionnés parce qu’ils sont apparus indépendamment à plusieurs reprises dans des isolats cliniques de MTB. Nous ajouterons également des variants PhoR présentant de fortes différences dans leur capacité à reconnaître le signal et à activer le régulon PhoP (sur la base de nos résultats antérieurs). Nous réaliserons ensuite une série d’expériences de compétition in vitro et in vivo afin d’évaluer l’aptitude des souches recombinantes au cours du cycle infectieux, d’un traitement antibiotique ou chez un hôte vacciné. Ces expériences nous informeront sur l’impact de ces pressions sélectives sur les souches recombinantes exprimant ces variants PhoR. Deuxièmement, nous caractériserons l’effet des mutations trouvées dans ces variants sur l’expression du régulon PhoP et la réponse aux conditions inductrices. Enfin, nous étudierons l’impact de ces variants de PhoR sur la cinétique de croissance chez l’hôte et la capacité à induire des lésions pulmonaires dans un modèle murin pertinent.

Cette proposition est très innovante car elle aborde la question des adaptations fonctionnelles sélectionnées au cours de l’infection d’un hôte, qu’il soit naïf, vacciné ou traité avec des antibiotiques. Cette question est d’une importance majeure mais reste jusqu’à présent inexplorée. Ce projet s’appuie 1) sur l’expertise du groupe dirigé par C. Guilhot, 2) sur les plates-formes technologiques de pointe de l’Institut de Pharmacologie et de Biologie Structurale de Toulouse, 3) ainsi que sur des résultats préliminaires solides. Les résultats attendus devraient permettre de mieux comprendre l’évolution des bacilles de la tuberculose et l’impact de cette évolution sur l’interaction hôte-pathogène.

L’intégration du génome du VIH-1 se produit principalement dans les régions actives de la chromatine. Ceci est une condition favorable pour une réplication virale efficace, cependant, le VIH-1 coexiste avec l’hôte pendant des périodes prolongées à l’état latent. La régulation spatio-temporelle des premières étapes du cycle de vie du VIH-1 et l’environnement nucléaire de l’hôte sont des déterminants essentiels de l’issue de l’infection. Notre équipe est intéressée à l’étude fondamentale des premières étapes de la réplication du VIH-1, avec un accent particulier sur les mécanismes impliqués dans l’import nucléaire actif des complexes de réplication viraux et dans le remodelage du compartiment nucléaire au cours de l’infection. En particulier, nous pensons que le VIH crée des microenvironnements nucléaires qui entravent son éradication.

 Selon les vues actuellement admises, la transcription inverse (RT), le processus responsable de la synthèse de l’ADN viral, se produit exclusivement dans le cytoplasme. Des outils de microscopie de pointe combinés à la virologie moléculaire nous ont permis de revisiter ce « dogme ». Nous avons découvert que les génomes d’ARN du VIH peuvent pénétrer dans le noyau et former des amas dans des niches nucléaires où ils sont rétrotranscrits en ADN viral fonctionnel. Cinquante ans après la découverte de la RT, nous avons ainsi montré que cette étape cruciale de la réplication virale peut également se produire dans le noyau de la cellule hôte. Nos résultats récents montrent que le VIH lors de l’entrée nucléaire provoque un phénomène appelé séparation de phase (LLPS) générant des organelles sans membrane (MLO) dans le noyau hôte. Les MLOs non seulement augmentent les vitesses de réaction, mais agissent également comme un filtre pour sélectionner les molécules à retenir ou à exclure de la gouttelette liquide. Il est à noter que la LLPS est à l’origine de plusieurs processus biologiques et maladies. Nous avons récemment décrit les VIH-MLOs comme des centres où se déroulent la RT et la formation du complexe de pré-intégration (PIC), tandis que les provirus activement transcrits se localisent dans la chromatine des MLO voisins. Notre étude révèle la localisation des génomes viraux intranucléaires dans une cellule unique, mettant en évidence que les condensats biomoléculaires orchestrent les étapes d’entrée post-nucléaire du VIH-1.

Cependant, on ne sait pas si des facteurs clés du VIH-MLO régulent les étapes virales intranucléaires individuelles. Plusieurs spéculations peuvent être proposées pour expliquer la présence de ces structures nucléaires virus/hôte: (i) pour servir de microréacteurs nucléaires pour la RT et la coalescence des facteurs de l’hôte pour favoriser la synthèse de l’ADN virale; (ii) pour servir de microenvironnement qui inclut des facteurs viraux et hôtes requis pour la génération d’une nouvelle descendance virale et/ou pour cacher le virus des mécanismes de défense cellulaire ; (iii) servir de centre de la transcription virale active pour diffuser rapidement la nouvelle descendance virale.

L’hypothèse susmentionnée peut être étudiée en démêlant le mécanisme sous-jacent à la biogenèse des MLO du VIH-1 et leur rôle dans la transcription inverse et la réplication virale.

Notre proposition vise à élucider la biogenèse/fonction des MLO et leur contribution à la réplication virale.

Les objectifs de la proposition sont :

1. Décrypter le mécanisme sous-jacent à l’établissement/la persistance/la fonction des virus-hôte-MLO.
2. Composition structurelle des VIH-MLO et leur persistance en tant que centre de la réplication virale.
3. Fonction VIH-MLOs et leur remodelage pour réguler la transcription virale.

 Nous pensons que l’étude proposée à l’ANRS peut donner lieu à des résultats qui permettront d’améliorer nos connaissances sur le cycle de vie des rétrovirus, notamment pour le VIH.