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Aujourd’hui l’immense majorité des patients infectés par le VIH bénéficient d’un traitement permettant le contrôle de la réplication virale. Malheureusement, si les traitements antirétroviraux réduisent la mortalité et améliorent la qualité de vie des patients infectés, ils ne permettent pas de normaliser une activation excessive non spécifique du système immunitaire. Cette activation chronique du système immunitaire est considérée comme déterminante dans l’immuno-pathologie du VIH.

D’autres éléments physiopathologiques sont à prendre en compte aujourd’hui dans le suivi des patients infectés et traités, notamment l’existence de comorbidités souvent inflammatoires : athéroscléroses, maladies cardiovasculaires, maladies rénales, troubles cognitifs, ostéoporose, et même des cancers. Indépendamment de l’infection par le VIH, dans toutes ces pathologies ainsi que dans l’activation immune il existe un point commun : une association avec l’existence de microparticules (MPs) circulantes.

Notre groupe d’étude, composé de 5 équipes, propose que lors d’une infection par le VIH et contrôlée, les MPs jouent un rôle majeur dans les pathologies que rencontrent les patients infectés. L’étude des caractéristiques phénotypiques et fonctionnelles de ces MPs aura un impact au-delà de l’infection par le VIH puisque des pathologies similaires peuvent être présentes dans d’autres infections.

Lors d’une étude préliminaire, nous avons comparé le phénotype des MPs de patients infectés traités à celui de donneurs sains. Nous montrons que les MPs plasmatiques présentes chez ces patients ont bien un profil d’activation particulier, notamment les MPs plaquettaires (PMPs), monocytaires (MMPs) ainsi que les MPs issues de lymphocytes T (LMPs). Ce projet de recherche propose un protocole expérimental visant donc à caractériser ces MPs (PMPs, MMPs, et LMPs) sur la base de leurs protéines membranaires et de leur contenu (cytokines, ARN et organelles). Ces MPS seront purifiées et leur fonctionnalité sera testée in vitro sur l’activation immune (lymphocytes T CD4+, T CD8+, et lymphocytes B) et l’inflammation (plaquettes et endothélium vasculaire). Les patients étudiés seront tous issus de la cohorte d’étude des comorbidités nommée CARDAMONE qui comporte 241 patients infectés par le VIH sous traitement efficace et qui ont bénéficiés d’un bilan clinique complet afin d’étudier précisément ces maladies non apparentées au SIDA. Cette cohorte a permis d’obtenir une cartographie bidimensionnelle des patients avec des regroupements de patients ayant des caractéristiques inflammatoires similaires. Ainsi 4 groupes de patients ont été identifiés et seront utilisés pour ce projet.

Les innovations mises en place et déjà publiées par ce groupe de recherche devraient permettre de comprendre le rôle exact de ces MPs dans l’activation immune ou liée aux comorbidités du VIH mais aussi en dehors du cadre infectieux. En effet, ces résultats permettront de proposer de nouvelles immunothérapies en ciblant ou en utilisant des MPs et permettre ainsi d’améliorer notamment des réponses immunitaires spécifiques et vaccinales.

La plupart des virus à ARN enveloppés exploitent la machinerie cellulaire ESCRT-III (endosomal sorting complexes required for transport) pour la dernière étape de leur cycle de multiplication, le bourgeonnement. Néanmoins, les virus enveloppés utilisent seulement les protéines CHMP2, CHMP3 et CHMP4 et l'ATPase VPS4. Étant donné que cette machinerie est essentielle pour les événements cellulaires de coupure de membrane, cela limite la possibilité d'acquérir des mutations qui l'inhibent. Cependant, de nombreuses espèces ont évolué pour conserver des duplications mutées de CHMP3 (appelées rétroCHMP3), qui préservent les fonctions cellulaires de l'ESCRT mais agissent comme des inhibiteurs du bourgeonnement viral à large spectre

In vitro, les protéines ESCRT-III ont la propriété de s’auto-assembler sur les membranes plasmiques en formant des filaments de composition variable, présentant également une diversité de formes : les CHMP4 forment des filaments en spirales plates et lâches, alors que les CHMP2A-CHMP3 s'assemblent en hélices compactes. Cependant, il reste encore à déterminer la composition des fibres aux sites de bourgeonnement du VIH-1 en particulier, on ne sait pas si ce sont des spirales de CHMP4B ou des polymères hélicoïdaux de CHMP2A/CHMP3 comme ceux observés in vitro. De plus, il n'est pas encore clair si ces filaments sont échangés ou s'ils sont successivement recrutés et désassemblé lors de la fission membranaire. En fin de compte, la distribution spatiale des filaments ESCRT-III et les transitions entre chaque fibre le long du col de bourgeonnement restent des sujets controversés.

La compréhension de la dynamique et de l'architecture du complexe ESCRT-III natif aux sites de bourgeonnement du VIH-1 est limitée en raison de la résolution spatiale et du recrutement transitoire des ESCRT-III. Nous proposons d'utiliser les ciseaux moléculaires pour marquer les protéines ESCRT-III par des protéines fluorescentes de différentes couleurs à leur loci chromosomiques. Nous utiliserons l'imagerie cellulaire « Total Internal Reflection Fluorescence » (TIRF) à haute résolution temporelle pour établir la cinétique de leur échange, assemblage et désassemblage lors du bourgeonnement. Pour obtenir une résolution spatiale suffisante, nous tirerons parti des récentes améliorations de la Single Molecule Localization Microscopy (SMLM) telle que les améliorations récentes de Points Accumulation for Imaging Nanoscale Topography (PAINT). De plus, nous utiliserons des techniques de microscopie électronique à cryogénie. Ces technologies de pointe promettent de fournir des images cellulaires de haute résolution des protéines ESCRT-III, dans le but d'élucider la cinétique, l'arrangement spatial, l'organisation structurelle et l'interaction de chaque filament.

Ces approches seront appliquées à divers mutants connus pour bloquer le bourgeonnement à différentes étapes, notamment des mutants de VPS4, des dominant négatifs des ESCRT-III et les mutants rétroCHMP3. Cela nous permettra de déterminer le rôle de CHMP4B, CHMP2A, CHMP3 et VPS4. De plus, l'inclusion des protéines rétroCHMP3 enrichira notre compréhension des fonctions spécifiques de CHMP3 et nous fournira des éléments pour comprendre les mécanismes altérés par les retroCHMP3.

Dans le cadre du "contrat d'initiation", nous mettrons en place les modèles cellulaires pour l'imagerie cellulaire. Nous fournirons les premières preuves de concept afin d'atteindre les objectifs décrits ci-dessus. L'utilisation de techniques d'imagerie avancées telles que la TIRF, la SMLM et la cryo microscopie électronique aidera à explorer l'organisation spatiale et la dynamique des filaments ESCRT-III, enrichissant notre compréhension de leur implication dans la fission membranaire lors du bourgeonnement viral. Cette recherche repoussera les limites technologiques de l'imagerie, contribuant à des progrès méthodologiques en biologie cellulaire. L'étude des variantes rétroCHMP3 révèlera comment ces protéines inhibent le bourgeonnement viral tout en préservant les fonctions cellulaires essentielles, offrant des pistes pour de nouveaux antiviraux moins toxiques.

Le virus de l'immunodéficience humaine 1 (VIH-1) est un agent pathogène humain important qui persiste sous forme de réservoir et nécessite un traitement antirétroviral continu. L’incapacité du système immunitaire à éliminer l’infection par le VIH-1 est au moins en partie due à une activation immunitaire sous-optimale. Bien que le récepteur cGAS (cyclic GMP-AMP synthase) ait été proposé comme principal détecteur d’ADNs double brins (ADNdb) dérivés du VIH-1, ils sont de mauvais inducteurs de réponses antivirales car leur accessibilité est limitée. Les ADN simple brin (ADNsb) peuvent se former au cours du cycle de réplication du VIH-1, mais la manière dont ils induisent des réponses inflammatoires est très peu étudiée. Nous proposons ici d'explorer leur rôle dans la réponse immunitaire innée à l'infection par le VIH-1.

Nos données préliminaires montrent que la détection d’ADNsb est déclenchée dans les cellules immunitaires et non immunitaires, conduisant à l'activation des réponses d'interféron de type I (IFN) et associées au facteur nucléaire kappa B (NF-kB). Nous montrons que ces réponses à l’ADNsb peuvent être indépendantes du récepteur cGAS. Des analyses protéomiques réalisées dans des cellules humaines immunitaires et non immunitaires nous ont permis d'identifier et de valider des réseaux de protéines qui interagissent spécifiquement avec les ADNsb dans le cytosol. Nous souhaitons maintenant étudier le rôle joué par ce réseau de récepteurs et de modulateurs spécifiques des ADNsb dans la réponse intrinsèque des cellules dans le contexte de l'infection par le VIH-1. Pour cela, nous proposons un projet suivant deux axes :

1. Dissection du rôle des réseaux de protéines liant l'ADNsb dans la reconnaissance du VIH-1 dans ses cellules cibles.

2. Description du rôle de la détection des ADNsb au cours de l'infection par le VIH-1.

Nous utiliserons une approche de criblage ciblée basée sur la technologie CRISPR/Cas9 et des inhibiteurs spécifiques. Nous analyserons le rôle de la détection des ADNsb dans la régulation des réponses immunitaires innées à l'infection par le VIH-1 ainsi que dans sa réplication. Les travaux proposés apporteront une compréhension du rôle joué par les ADNsb dans l’immunité innée et dans la réponse à l’infection par le VIH-1. Ce travail ouvrira un nouveau champ de recherche et entraînera potentiellement des bénéfices pour les patients infectés par le VIH-1 en permettant d’envisager de nouvelles approches pour stimuler les réponses immunitaires antivirales.

Daxx est une protéine chaperonne, majoritairement nucléaire, impliquée dans de nombreux processus cellulaires, comme l’apoptose et la répression transcriptionnelle. Lors de travaux antérieurs, nous avons identifié cette protéine comme un facteur de restriction capable d’inhiber la réplication du VIH-1. Le mécanisme d’action de Daxx est particulièrement original, puisque l’infection par le VIH-1 provoque la translocation de Daxx du noyau vers le cytoplasme. De façon intrigante, d’autre rétrovirus non humains déclenchent aussi la translocation de Daxx, mais pas le virus de la grippe (un orthomyxovirus) ou le virus de la stomatite vésiculaire (un rhabdovirus). Récemment, nous avons démontré que l’infection par le SARS-CoV-2 induisait également la sortie de Daxx du noyau et que celui-ci inhibait alors la réplication du virus.

Dans le cas du VIH-1, nous avons démontré que c’est la rétro-transcription qui déclenche le signal induisant la translocation de Daxx, mais la nature de ce signal est cependant inconnue.

Une fois dans le cytoplasme, Daxx interagit, via son domaine de liaison à SUMO (SIM, pour “SUMO interacting motif) avec les capsides entrantes et recrute un complexe multi-protéique qui empêche leur décapsidation. Par ailleurs, nous avons des résultats préliminaires suggérant que Daxx est également incorporée dans les particules virales et inhibent leur réplication.

Toutes ces observations soulèvent de nombreuses questions sur le mécanisme de restriction virale médiée par la protéine Daxx et notamment sur les déterminants viraux et cellulaires qui déclenchent sa sortie du noyau et son encapsidation dans les particules virales. Notre projet de recherche vise à lever le voile sur ces zones d’ombre.

Nous étudierons donc tout d’abord la localisation subcellulaire de Daxx au cours de l’infection VIH-1, par une approche d’imagerie en temps réel, afin d’identifier quelle voie de signalisation déclenche la translocation de Daxx. Nous identifierons également les déterminants viraux permettant à Daxx d’être encapsidée dans les particules virales, ainsi que le mécanisme qui permet à Daxx d’interférer avec l’infectivité de ces particules. Ces aspects seront notamment évalués dans les principales cellules-cibles du VIH-1, afin de comparer l’expression de Daxx, sa propension à être encapsidée et les conséquences de son encapsidation sur la réplication virale. D’autres pistes de recherche seront également explorées. En particulier, étant donné que Daxx interagit avec la capside du VIH-1 via son domaine SIM et que nos résultats préliminaires font suspecter une interaction directe de Daxx avec la cyclophiline A (CyPA), nous étudierons si cette protéine cellulaire liée à la capside du virus, est SUMOylée. Enfin, nous évaluerons si le domaine D/E de Daxx est impliqué dans son activité anti-VIH. En effet, ce domaine a récemment été identifié comme étant capable de reconnaitre les protéines mal repliées et ainsi permettre à la protéine Daxx de restaurer leur conformation. Il est tentant d’imaginer que cette activité ” disaggregase” de Daxx pourrait être impliquée dans son activité antivirale.

Notre projet de recherche permettra de répondre à des questions cruciales relatives à l’activité antivirale de Daxx et de mieux comprendre les relations complexes que le virus entretient avec cette protéine cellulaire. Élucider le mécanisme d’action de Daxx constitue un important défi de la recherche sur les défenses antivirales, contre le VIH-1, mais également contre d’autres virus pathogènes.

La tuberculose (TB), causée par Mycobacterium tuberculosis (Mtb) reste l’une des principales causes de décès due à un agent infectieux dans le monde. Le traitement de la tuberculose nécessite plusieurs mois de chimiothérapie avec des schémas thérapeutiques complexes contenant plusieurs antibiotiques. Malheureusement, la durée et la toxicité des régimes antituberculeux disponibles affectent considérablement l’observance, conduisant à des échecs thérapeutiques, des rechutes et l’émergence de résistances. Ce nombre croissant de souches multirésistantes constitue un véritable défi clinique extrêmement préoccupant. Dans ce contexte, le développement de nouvelles interventions thérapeutiques est désespérément nécessaire pour réduire la durée du traitement et éviter la génération de sous-populations multirésistantes récalcitrantes.

Parmi les médicaments de première ligne disponibles, le pyrazinamide (PZA) joue un rôle clé dans le traitement de la tuberculose. En effet, l’introduction de cet antibiotique dans la chimiothérapie antituberculeuse standard a permis de raccourcir la durée du traitement de 9-12 mois à 6 mois. Le PZA est donc l’une des meilleures molécules à notre disposition. Deux mécanismes majeurs, communément acceptés au sein de notre communauté scientifique, ont été proposés pour décrire le mode d’action du PZA. Le premier nécessite un pH microenvironnemental acide pour être efficace en perturbant l’homéostasie du pH intrabactérien et le potentiel de membrane. Le second, ne nécessite aucune étape de protonation et cible l’aspartate carboxylase PanD, impliquée dans la biosynthèse de la co-enzyme A, ayant ainsi une efficacité quel que soit le pH microenvironemental. Ainsi, bien qu’il soit utilisé en clinique depuis près de 50 ans, le mode d’action moléculaire du PZA reste mal caractérisé avec des modèles potentiellement conflictuels.

Afin de répondre à ces questions, nous avons conçu une proposition de projet d’initiation intitulée ” Contribution moléculaire du pH et de l’aspartate décarboxylase PanD dans le mode d’action du pyrazinamide chez Mycobacterium tuberculosis (PanDMyc)” qui vise à développer de nouveaux outils biologiques, technologiques et analytiques pour décrypter les bases moléculaires responsales de l’activité du PZA.

Dans un premier temps, nous proposons de développer un programme de répression transcriptionnelle (CRISPRi) chez Mycobacterium tuberculosis. Ensuite, ce système permettra de réaliser des approches chimio-génétiques innovantes pour caractériser les hypothétiques cibles et voies biologiques impliquées dans la sensibilité au PZA. Nos travaux se focaliseront donc sur la cible putative PanD, impliquée dans la biosynthèse de la co-enzyme A et la contribution du pH microenvironnemental.

Avec ces investigations, nous visons à redéfinir le mode d’action du PZA, apportant ainsi de nouvelles connaissances sur les principes fondamentaux de la chimiothérapie et l’émergence d’une population résistante aux médicaments avec des implications cliniques importantes.

Nous croyons fermement que les conclusions qui découleront de ce contrat d’initiation fourniront une base solide pour la conception d’un projet multidisciplinaire très ambitieux qui a le potentiel de bénéficier non seulement aux chercheurs fondamentaux et aux cliniciens, mais également à la définition de nouvelles stratégies thérapeutiques, le raccourcissement de la durée du traitement et ultimement bénéficier aux patients grâce à un meilleur contrôle global des cas de TB.

Pour se répliquer, le VIH-1 doit encapsider spécifiquement deux copies de son ARN génomique (ARNg) à partir d’un excès d’ARN cellulaires et viraux épissés. Dans le cytoplasme, le précurseur Pr55Gag (Gag) du VIH-1 sélectionne l’ARNg en interagissant très spécifiquement avec le signal d’encapsidation dans la région 5’UTR de l’ARNg. Les complexes ainsi formés atteignent la membrane plasmique (MP) où l’assemblage a lieu.  A ces sites, le domaine N-terminal de Gag qui est myristoylé, permet l’encrage des Gag et des complexes Gag-ARNg, et environ 2500 Gag s’assemblent autour du dimère d’ARNg. Cela implique que le mode de liaison de Gag à l’ARNg doit devenir à ce stade non spécifique et ce changement (d’un mode d’interaction très spécifique au moment de la sélection, à un mode d’interaction non spécifique lors de l’assemblage) favoriserait efficacement l’assemblage viral.

A ce jour, peu d’informations quantitatives sont disponibles sur les facteurs moléculaires régulant le mode d’interaction entre Gag et l’ARNg lors de l’assemblage à la MP. Selon notre hypothèse, ces interactions seraient régulées par i) l’interaction de Gag avec la MP, ii) la multimérisation de Gag, ou par l’ensemble de ces deux facteurs. L’objectif de ce projet est de réaliser la première analyse quantitative in vitro et en cellule, de manière à comprendre comment ces deux facteurs moléculaires régulent le mode de liaison de Gag à l’ARNg et favorisent l’assemblage du VIH-1.

Dans ce but, nous avons produit des fragments d’ARN viraux (un fragment d’ARNg et deux ARN viraux mutés), ainsi que les protéines myristoylées Gag de type sauvage (Myr-Gag WT) et trois protéines Gag mutées dans le domaine de multimérisation de manière à déstabiliser les contacts protéine-protéine (Myr-Gag WM, Myr-Gag-PAE et Myr-Gag K affectant respectivement une interaction à deux, trois et six hélices dans les multimères immatures de Gag) dans des cellules eucaryotes. Les protéines Myr-Gag et les ARN ont été marqués par fluorescence, puis les protéines ont été associées aux bicouches lipidiques (SLB) mimant la composition interne de la MP. En introduisant une quantité croissante d’ARN, nous avons déterminé par microscopie confocale, les valeurs de Kd pour les interactions entre les protéines Myr-Gag (WT ou WM), les fragments d’ARN viral, et un ARN non viral, l’ARNt.  Contrairement à ce qui a été précédemment observé en solution avec des protéines Gag non myristoylées, nos résultats montrent que i) l’association de Myr-Gag WT aux SLB conduit à une interaction non spécifique entre Myr-Gag WT et les ARN viraux testés, ii) Myr-Gag WT associée aux SLB pourrait discriminer entre les ARN viraux et les ARN non viraux, et iii) l’interaction avec les SLB (plutôt que l’état de multimérisation de Myr-Gag) semble influencer le mode de liaison des protéines à l’ARN. Suite à ces résultats préliminaires encourageants, nous étendrons ces expériences aux autres mutants de multimérisation et à un plus vaste panel d’ARN (viraux et cellulaires). De même, nous déterminerons l’impact de l’insertion et de l’orientation du myristoyl dans la MP, ainsi que l’effet de la courbature de la MP dans la régulation de la spécificité des interactions Myr-Gag-ARN. Ces valeurs de Kd (déterminées pour les protéines liées au SLB), seront comparées à celles déterminées par des expériences similaires en solution, qui simulent la sélection cytoplasmique de l’ARNg. Cette analyse quantitative des interactions Gag-lipides, Gag-Gag et Gag-ARNg régulant l’assemblage du VIH-1 sera aussi transposée à des systèmes cellulaires. Ainsi, en combinant des approches de biochimie et biophysique de pointe, et des méthodes de microscopie adaptées à cette analyse, nous fournirons un cadre précis des facteurs impliqués dans la régulation des interactions Gag-ARNg lors de l’assemblage du VIH-1. Les résultats obtenus dans leur ensemble élargiront notre compréhension des interactions Gag-ARNg permettant l’assemblage rétroviral, ouvrant ainsi la voie au développement de stratégies antivirales novatrices et à l’amélioration des vecteurs rétroviraux pour la thérapie génique visant au traitement des pathologies liées au VIH-1 ou d’autres maladies.